王晨驕，陳穎，李蕾，郭嘉航，唐光美，官會(huì)林，黃晶心

（云南師范大學(xué)高原特色中藥材種植土壤質(zhì)量演變退化與修復(fù)云南省野外科學(xué)觀測(cè)研究站，昆明650500）

苯酚是石油化工、塑料生產(chǎn)、醫(yī)藥合成等行業(yè)的原料，具有長(zhǎng)效性和生物積累性，是工業(yè)生產(chǎn)中的主要污染物之一，目前世界范圍內(nèi)均普遍存在農(nóng)田苯酚污染的情況[1]。苯酚等土壤有機(jī)污染物可以被植物的根系吸收并由蒸騰拉力輸送到作物地上部位，影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)和品質(zhì)[2]，例如：土壤污染可導(dǎo)致甘薯中苯酚含量增加48%以上[3]，高濃度苯酚將嚴(yán)重限制植物的生長(zhǎng)[2]。禾谷鐮刀菌是多種糧食作物的致病菌，導(dǎo)致農(nóng)作物的根腐、莖腐、萎蔫等，造成玉米、水稻大量減產(chǎn)，有些年份甚至導(dǎo)致減產(chǎn)70%以上[4]。并且隨著污染的持續(xù)增加，土壤苯酚污染和鐮刀菌病害同時(shí)發(fā)生的概率必然增加。

多數(shù)傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法例如淋洗法、熱脫附法、化學(xué)氧化法雖能修復(fù)苯酚污染土壤，但此類(lèi)方法破壞土壤質(zhì)地，影響農(nóng)業(yè)土壤的可耕作性，并且修復(fù)費(fèi)用高昂，不適于農(nóng)田土壤苯酚污染的修復(fù)[5-6]?；瘜W(xué)農(nóng)藥雖可有效控制禾谷鐮刀菌病害的發(fā)生，但化學(xué)農(nóng)藥的生產(chǎn)、存儲(chǔ)、使用等環(huán)節(jié)存在明顯的環(huán)境、健康風(fēng)險(xiǎn)，目前部分歐美國(guó)家已加大對(duì)化學(xué)農(nóng)藥使用的管控，禁用部分風(fēng)險(xiǎn)較大、難降解化學(xué)農(nóng)藥的使用[7]。微 生 物 如 紅 球 菌（Rhodococcussp.）[8]、假 單 胞 菌（Pseudmonassp.）[9]等具有動(dòng)植物所不具備的代謝途徑，可快速降解土壤中的苯酚，部分種類(lèi)的紅球菌屬微生物其苯酚的降解效率最高可達(dá)80%～100%[8]。苯酚降解菌可以苯酚作為碳源進(jìn)行生命活動(dòng)，在降解苯酚的同時(shí)避免對(duì)環(huán)境形成二次污染，具有綠色環(huán)保的特點(diǎn)[10]。微生物可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制、分泌抗生素等方式抑制其他微生物的生長(zhǎng)，目前被廣泛研究用于制備生物防治藥劑、提取活性物質(zhì)等[11]，生防菌可有效防控糧食作物如馬鈴薯和玉米[12]的鐮刀菌病害。由于代謝的復(fù)雜性，部分微生物可同時(shí)具備多種生物學(xué)功能，例如紅球菌屬微生物同時(shí)具有降解單環(huán)和雙環(huán)芳烴化合物的功能[13]，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）不僅能降解苯酚，也可促進(jìn)植物生長(zhǎng)[14]。據(jù)上述背景推測(cè)存在可同時(shí)降解苯酚和抑制其他微生物生長(zhǎng)的微生物，但目前該方面的研究報(bào)道較少。

本研究擬通過(guò)微生物學(xué)方法，從高濃度苯酚污染土壤中富集、篩選高活性苯酚降解菌，并從得到的苯酚降解菌中篩選具備抑制禾谷鐮刀菌的“多功能菌”，通過(guò)分子生物學(xué)法對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，進(jìn)一步通過(guò)溫室栽培試驗(yàn)驗(yàn)證其降解苯酚、防治禾谷鐮刀菌病害功能，為苯酚污染修復(fù)、禾谷鐮刀菌病害防治提供有潛力的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 苯酚降解菌的篩選

1.1.1 土壤樣品的采集及處理

采集昆明市郊某紙品廠排污渠中的10 個(gè)黑色沉積物樣品100 g，仔細(xì)清除樣品中的雜物后混合均勻，帶回實(shí)驗(yàn)室常溫保存并盡快用于后續(xù)研究。

1.1.2 苯酚降解菌的富集培養(yǎng)

本研究通過(guò)往LB液體培養(yǎng)基中添加苯酚制備富集培養(yǎng)基，LB 培養(yǎng)基的基本成分為：胰蛋白胨10 g·L-1、酵母浸出粉5 g·L-1、NaCl 5 g·L-1，pH 值7.0。進(jìn)一步通過(guò)在LB 培養(yǎng)基中添加不同量的苯酚形成100、200、400、800 mg·L-1苯酚濃度梯度，采用該培養(yǎng)基通過(guò)逐級(jí)富集方法富集土壤樣品中的苯酚降解菌。具體做法為：取上述土壤樣品1 g 接種于苯酚含量為100 mg·L-1的培養(yǎng)基200 mL 中，25 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d后取1 mL培養(yǎng)液接種于200 mg·L-1苯酚培養(yǎng)基中，后續(xù)培養(yǎng)過(guò)程所用方法與上述過(guò)程相同。于800 mg·L-1苯酚培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)的菌液用于后續(xù)篩選過(guò)程。

1.1.3 苯酚降解菌的篩選、純化、優(yōu)選

使用苯酚篩選培養(yǎng)基篩選上述富集培養(yǎng)基中的苯酚降解菌，苯酚篩選培養(yǎng)基成分如下：K2HPO40.40 g·L-1、KH2PO40.20 g·L-1、NaCl 0.10 g·L-1、MgSO40.10 g·L-1、MnSO4·H2O 0.01 g·L-1、（NH4）2SO40.40 g·L-1、苯酚0.50 g·L-1。苯酚降解菌的篩選方法具體步驟為：將上述富集培養(yǎng)液通過(guò)梯度稀釋法稀釋為10-4，通過(guò)平板涂布法將稀釋液均勻地涂布到苯酚篩選培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)5 d后挑取菌落較大、生長(zhǎng)旺盛的菌落進(jìn)行2 次純化，純化得到的菌株在苯酚培養(yǎng)固體基中通過(guò)相同培養(yǎng)方法優(yōu)選生長(zhǎng)旺盛的9 種菌株用于后續(xù)生防效果研究。

1.1.4 同時(shí)具備苯酚降解和生防功能的“多功能菌”篩選

本研究針對(duì)幾種糧食作物主要的致病菌禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum），通過(guò)平板對(duì)峙法篩選能夠抑制該種致病菌的菌株。具體步驟為：將浸有生防菌液的濾紙放在平板上靜置30 min，用5 mm 直徑打孔器將鐮刀菌菌餅置換入平板中央，培養(yǎng)5 d 后測(cè)量抑菌圈的大小。將其中抑菌活性最高的3 種菌分別命名為PBC01、PBC02、PBC03 用于后續(xù)研究。本研究按照以下方法計(jì)算上述3種菌株的抑菌率：

抑菌率=（對(duì)照組指示菌菌落直徑-處理組指示菌菌落直徑）/（對(duì)照組生防菌菌落直徑-濾紙直徑）×100%。

將上述具有生防功能的3 種菌接種于200 mL 苯酚濃度為500 mg·L-1的苯酚培養(yǎng)基中，菌種的接種量約為2.0×106cfu·mL-1，每種菌株平行培養(yǎng)3 次。接種后的搖瓶置于恒溫?fù)u床中25 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)，通過(guò)連續(xù)取樣的方式測(cè)定培養(yǎng)液中苯酚的含量，取樣的時(shí)間間隔為10 h，每次取樣盡快完成，以減少苯酚的揮發(fā)性損失。為減少培養(yǎng)過(guò)程中苯酚的損失，本研究的培養(yǎng)瓶采用橡膠塞密封，外用牛皮紙包裹。溶液中殘留的苯酚經(jīng)過(guò)離心、取上清液，按照何小麗等[15]的方法采用改進(jìn)的4-氨基安替吡林法測(cè)定苯酚含量。

1.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將篩選出的生防作用較強(qiáng)的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)48 h后離心，用于提取菌株的DNA。使用正向引物27f（5′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和反向引物1492R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），按照參考方法擴(kuò)增[16]菌株的16s rRNA 基因，擴(kuò)增后的DNA 片段純化后交生物公司測(cè)序。

采用BioEdit 軟件（BioEdit v7.2.6.1）對(duì)測(cè)序結(jié)果和參比序列進(jìn)行分析，使用MEGA 軟件（MEGA 7.0.26）制作序列的N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)Bootstrap 法對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行評(píng)估。

1.3 溫室栽培試驗(yàn)

為驗(yàn)證“多功能菌”在田間降解苯酚及同時(shí)防止禾谷鐮刀菌病害的功能，本研究在溫室中設(shè)置對(duì)比試驗(yàn)。溫室試驗(yàn)土壤采自云南師范大學(xué)植物園拋荒地，土壤的采集深度為0～20 cm，將采集的栽培土壤去除雜物、風(fēng)干、破碎、過(guò)5目篩備用。本研究所有處理均設(shè)置4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)均使用上述土壤1 kg裝于10 cm×8 cm×8 cm（上徑×下徑×高）的塑料花盆中。

為探究“多功能菌”降解土壤苯酚的功能，本研究設(shè)置植物+苯酚+禾谷鐮刀菌+“多功能菌”處理組（PPFP）：盆內(nèi)種植3 株玉米，土壤中的苯酚濃度為500 mg·kg-1，添加禾谷鐮刀菌孢子的數(shù)量約為5×106cfu·kg-1，“多功能菌”的添加量約為1×107cfu·kg-1；植物+苯酚+鐮刀菌+水處理組（PPFW）：該組除未添加“多功能菌”外其他均與PPFP組相同；苯酚+禾谷鐮刀菌+“多功能菌”處理組（PFP）：該組除未種植玉米外，其他處理均與PPFP 組相同；為探究“多功能菌”對(duì)禾谷鐮刀菌病害的生防功能，本研究另外設(shè)置對(duì)照處理組（CK）：除不添加苯酚、禾谷鐮刀菌、“多功能菌”，其他均與PPFP處理相同。本研究為控制培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，添加禾谷鐮刀菌孢子、“多功能菌”之前均進(jìn)行3 次“離心-水洗”過(guò)程，通過(guò)無(wú)菌水重懸后均勻倒入栽培土壤中。為減少試驗(yàn)過(guò)程中土壤苯酚的揮發(fā)，盆口使用多層保鮮膜密封，植物通過(guò)保鮮膜上的孔長(zhǎng)出后再使用保鮮膜加密孔上的縫隙。土壤殘留苯酚通過(guò)乙酸乙酯萃取、濃縮后，采用氣相色譜法測(cè)定含量，進(jìn)而求出土壤中苯酚的濃度（HJ 703—2014）。

分別于玉米種植第10、20、30、40 d 測(cè)定玉米的株高。于收獲前使用SPAD-502 Plus（KONICA MINOLTA，Japan）測(cè)定第3 伸展葉葉綠素含量。種植40 d后收獲整株玉米，仔細(xì)清洗收獲后玉米植株上的泥沙，而后置于恒溫干燥箱72 ℃烘干48 h，稱(chēng)量玉米的單株質(zhì)量。株高、葉綠素含量、單株生物量均按照每盆內(nèi)3株玉米的均值作為1個(gè)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用Excel 軟件（Excel 2016）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和制圖，應(yīng)用R 軟件（R x64 3.5.0）通過(guò)單因素方差分析法檢驗(yàn)不同菌株苯酚降解速率、抑菌率和不同處理間玉米株高、葉綠素含量、單株生物量的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1“多功能菌”的活性及鑒定

在禾谷鐮刀菌長(zhǎng)滿整個(gè)平板的5 d 時(shí)間里，優(yōu)選得到的9株菌種中有3種能夠明顯抑制禾谷鐮刀菌的活性，均能夠在平板對(duì)峙試驗(yàn)開(kāi)始5 d 后形成明顯的抑菌現(xiàn)象。其中PBC01 菌株的抑菌率為79.38%，顯著高于PBC02 菌株的47.05%（P＜0.05），高于PBC03菌株的61.85%（圖1）。

圖1 不同菌株對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌率Figure 1 Inhibition rate of different strains to F.graminearum

在密閉培養(yǎng)瓶中，上述3 種菌株在濃度為500 mg·L-1的苯酚培養(yǎng)基中具有明顯的降解苯酚活性，溶液中苯酚的濃度均呈下降趨勢(shì)，經(jīng)過(guò)70 h 的培養(yǎng)PBC01、PBC02、PBC03 分別將苯酚濃度降解至2.16、148.97、107.96 mg·L-1，PBC01菌株具有更顯著的苯酚降解活性（P＜0.01），PBC01 菌株在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，其降解苯酚的速率均明顯高于PBC02、PBC03 菌株（圖2）。表明PBC01 菌株同時(shí)具有相對(duì)較高的苯酚降解活性和對(duì)禾谷鐮刀菌的生防功能，本研究選擇該菌株進(jìn)行后續(xù)溫室試驗(yàn)。

PBC01 菌株16s rDNA 測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI 后獲得的序列登陸號(hào)為MT012079，經(jīng)序列比對(duì)，選擇同源性較近的菌株作為參比菌株構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，該菌株被鑒定為Rhodococcussp.，其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示。

2.2 溫室試驗(yàn)“多功能菌”降解土壤苯酚活性

經(jīng)過(guò)40 d 的種植PPFP、PPFW、PFP 處理土壤中苯酚含量均明顯降低，其中PPFP 處理土壤中苯酚濃度最低為79 mg·kg-1，PFP 處理組的濃度為105.33 mg·kg-1，均顯著低于PPFW 處理的262.67 mg·kg-1（P＜0.01）。這說(shuō)明PBC01 菌株施入土壤后能明顯提高土壤中苯酚的降解速率，顯著增加土壤對(duì)苯酚的自?xún)裟芰ΑＶ参锏姆N植在一定程度上增加了土壤中苯酚降解菌的活性，但對(duì)PBC01降解苯酚的活性并無(wú)顯著的促進(jìn)作用，降解苯酚的作用主要來(lái)自于PBC01 菌株（圖4）。

圖2 不同菌株降解苯酚速率Figure 2 Degradation rate of phenol by different strains

圖3 基于16s rRNA基因“多功能菌”的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 3 Phylogenetic tree of"multifunctional bacteria"based on 16S rRNA gene

圖4 不同處理土壤中苯酚含量變化Figure 4 Change of phenol content in soil of different treatments

圖5 不同處理植物株高變化Figure 5 Changes of plant height under different treatments

2.3 溫室試驗(yàn)“多功能菌”生防性能

圖5 表明，在40 d 的栽培過(guò)程中PPFP 和CK 處理玉米的株高均明顯高于PPFW 處理，在40 d 時(shí)這2 個(gè)處理組的株高分別為58.37 cm 和61.70 cm，顯著高于PPFW 處理組的37.63 cm（P＜0.05）。這說(shuō)明PBC01菌株可顯著降低苯酚、禾谷鐮刀菌對(duì)玉米株高的影響。

圖6 表明，盆培40 d 時(shí)PPFP 和CK 處理組玉米的葉綠素含量無(wú)顯著差異，分別為33.50 和33.33，均顯著 高 于PPFW 處 理 組 的22.93（P＜0.05）。這 說(shuō) 明PBC01菌株的使用可顯著降低苯酚、禾谷鐮刀菌對(duì)玉米葉綠素含量的影響。

栽培40 d 時(shí)PPFP 和CK 處理組玉米的單株生物量分別為1.79 g 和1.92 g，二者無(wú)顯著差異，但均顯著高于PPFW 處理組的0.97 g（P＜0.05）。這說(shuō)明PBC01菌株的施用可顯著降低苯酚、禾谷鐮刀菌對(duì)玉米單株生物量的影響（圖7）。

圖6 不同處理植物葉綠素含量Figure 6 Chlorophyll content of plants under different treatments

圖7 不同處理植物單株生物量Figure 7 Single biomass of plant under different treatments

3 討論

土壤苯酚污染通過(guò)植物的根系吸收、擴(kuò)散等方式進(jìn)入植物體內(nèi)[2]，破壞植物的酶系統(tǒng)，影響植物的正常新陳代謝[17]。本研究分離獲得的PBC01 菌株在苯酚培養(yǎng)基中70 h 內(nèi)能夠?qū)⑷芤褐械谋椒咏到?9.57%，在40 d 內(nèi)能夠?qū)⑼寥乐懈邼舛缺椒咏到?4.20%，這與其他研究結(jié)果類(lèi)似[18]。微生物具有多種苯酚代謝通路，例如可通過(guò)苯酚羥化酶將苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，然后由鄰苯二酚2，3-雙加氧酶通過(guò)中間途徑將其轉(zhuǎn)化為2-羥基黏液半醛方式分解環(huán)境中的苯酚，利用分解苯酚獲得的能量進(jìn)行新陳代謝[19]。目前研究發(fā)現(xiàn)的苯酚降解菌種類(lèi)較多，包括部分假單胞菌屬（Pseudmonas）[9]、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）[19]等，這說(shuō)明環(huán)境中有大量能夠降解苯酚的微生物。本研究中PPFW 處理組苯酚含量也明顯降低，說(shuō)明土壤對(duì)苯酚具有一定的自?xún)裟芰Γ@或許是由于土壤中存在一定量具有降解苯酚功能的微生物[14]。本研究篩選獲得的苯酚降解菌為Rhodococcussp.，目前已有一些研究表明Rhodococcussp.能夠降解苯酚，并且該菌屬具有較高的苯酚降解速率，可在短時(shí)間內(nèi)降解溶液中的大部分苯酚[8，18]。由于苯酚污染物對(duì)植物的新陳代謝具有顯著的抑制作用，對(duì)其去除可顯著降低土壤中苯酚對(duì)植物生長(zhǎng)的負(fù)效應(yīng)[17]，PBC01 菌株的施用顯著降低了土壤中苯酚的含量（圖4），進(jìn)而降低了苯酚對(duì)玉米的株高、葉綠素含量、生物量的抑制（圖5～圖7）。

PBC01菌株具有明顯的生防功能，在平板對(duì)峙試驗(yàn)中能抑制禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)（圖1），在土壤中仍能夠顯著限制禾谷鐮刀菌對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響（圖5～圖7）。生防菌通過(guò)對(duì)營(yíng)養(yǎng)、生存空間的競(jìng)爭(zhēng)、分泌抗生素等方式限制致病微生物的生長(zhǎng)[11]，在土壤顆粒、植物根際、植物根內(nèi)生存，限制致病微生物在土壤中的生長(zhǎng)、繁殖，在植物根部形成“防火墻”從而限制土傳致病微生物對(duì)植物的侵染[7，20]。本研究發(fā)現(xiàn)的PBC01菌株具有較快的生長(zhǎng)速率，5 d 內(nèi)在培養(yǎng)平板上形成了較大直徑的菌落，或許該種菌株能通過(guò)快速生長(zhǎng)限制禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)。平板對(duì)峙試驗(yàn)中PBC01 菌株在培養(yǎng)平板上形成了明顯的抑菌圈，該種菌株可能通過(guò)向胞外分泌抗生素的方式致畸、裂解禾谷鐮刀菌的菌絲，從而限制禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)[7]。施入土壤后，PBC01菌株顯著限制了禾谷鐮刀菌對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響，這或許由于該種菌能夠在土壤顆粒、植物根際較好地定殖，利用土壤中的苯酚、植物根部分泌的營(yíng)養(yǎng)生存，限制禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)，從而減少其對(duì)植物生長(zhǎng)的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)的PBC01 菌株同時(shí)具有良好的降解苯酚和對(duì)禾谷鐮刀菌的生防功能，雖然此類(lèi)研究結(jié)果較少，但同時(shí)具有多種生理功能的“多功能菌”的研究較多。Wang 等[14]的研究分離獲得的“多功能菌”同時(shí)具備分解土壤中苯酚和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的功能，一種紅球菌能同時(shí)降解苯酚和吡啶，同時(shí)對(duì)Cr6+具有還原作用[13]，鳳尾蕨根際微生物萬(wàn)古霉素假單胞菌（Pseudomonas vancouverensis）可通過(guò)分泌生長(zhǎng)素、鐵載體的方式促進(jìn)鳳尾蕨的生長(zhǎng)，同時(shí)具有促進(jìn)砷轉(zhuǎn)化的功能[21]，從堆肥中分離出的100種微生物中25種同時(shí)具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、生防或促進(jìn)堆肥腐解的功能[22]，這說(shuō)明同時(shí)具有多種功能的微生物在自然界普遍存在。自然界微生物的多樣性據(jù)估計(jì)超過(guò)50萬(wàn)種，微生物具有有別于動(dòng)植物的獨(dú)特代謝通路，并且微生物之間普遍存在基因的水平轉(zhuǎn)移，這可能是導(dǎo)致上述微生物同時(shí)具備多種環(huán)境生物學(xué)、生理生態(tài)學(xué)功能的原因[23-24]。

4 結(jié)論

本研究分離獲得了能同時(shí)降解苯酚和生物防治禾谷鐮刀菌病害的多功能菌株Rhodococcus zopfiisp.PBC01，該種微生物在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)70 h 能降解培養(yǎng)液中99.57%的苯酚，同時(shí)對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制率達(dá)到79.38%。該種菌株在溫室栽培試驗(yàn)中也具有良好的效果，可顯著降低禾谷鐮刀菌對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響，將土壤苯酚濃度由500 mg·kg-1降低至79 mg·kg-1，這或許是由于該種菌株同時(shí)具有苯酚代謝途徑和分泌抗生素的功能，具體原因仍需要進(jìn)一步研究。自然界中或許普遍存在具有多種生理生態(tài)功能的微生物，本研究可為土壤苯酚污染、農(nóng)業(yè)病害綜合問(wèn)題的解決提供一種思路。