黃靜瑩， 陳萱， 饒靖紅

內(nèi)源性大麻素花生四烯酸氨基乙醇介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激*

黃靜瑩△， 陳萱， 饒靖紅

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建 泉州 362000）

探討內(nèi)源性大麻素-花生四烯酸氨基乙醇（AEA）在卵巢癌中的作用，并深入研究其作用機制。ELISA實驗分析健康對照組和卵巢癌組患者血清中AEA的水平，并結(jié)合ROC曲線評估AEA對卵巢癌患者的診斷價值；結(jié)合CCK-8實驗、Transwell小室侵襲實驗和劃痕實驗檢測AEA對卵巢癌細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響；并通過腫瘤體積、瘤重的測量及瘤組織肉眼觀圖進(jìn)一步驗證AEA對卵巢癌的作用；同時用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測AEA對卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)而采用Western blot檢測卵巢癌細(xì)胞自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的水平，探究其促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡的機制。卵巢癌患者體內(nèi)AEA的含量較健康對照組顯著下降， ROC結(jié)果提示AEA有望成為區(qū)分卵巢癌患者和健康個體的靈敏性生物學(xué)標(biāo)志物，且AEA可以抑制卵巢癌細(xì)胞的活力、遷移、侵襲，抑制卵巢癌組織生長。AEA通過促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并影響其自噬，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

內(nèi)源性大麻素；-花生四烯酸氨基乙醇；卵巢癌；自噬；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一［1］。全球每年有24萬名女性被診斷出患有卵巢癌，且5年生存率低于45％，成為女性中第7位最常見的腫瘤和第8位最常見的腫瘤死因［2］。卵巢癌在常規(guī)治療手段后，由于化療耐藥等原因致使復(fù)發(fā)率和死亡率極高，嚴(yán)重威脅患者的生命［3］。因此尋找新的治療手段提高卵巢癌患者的生存期刻不容緩。

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)是一種脂質(zhì)信號系統(tǒng)，涉及廣泛的生理和病理過程，如能量代謝和炎癥［4-5］。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)有3個主要成分：內(nèi)源性大麻素、大麻素受體和內(nèi)源性大麻素代謝物［4］。研究表明-花生四烯酸氨基乙醇（-arachidonic acid aminoethanol， AEA）是一種重要的天然存在的內(nèi)源性大麻素，其能通過激動大麻素受體CB1和CB2，從而對肥胖、炎癥、疼痛和化療引起的惡心或嘔吐起抑制作用，并可以減輕神經(jīng)變性疾病和多發(fā)性硬化癥的癥狀［6-7］。另外，AEA還有較強的抗腫瘤作用［8- 9］，可作為化療劑用于腫瘤治療，但其在卵巢癌中的作用仍不甚明確。

細(xì)胞自噬作為維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一種常見機制，其可以通過清除受損的蛋白質(zhì)和老化的細(xì)胞器維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)［10］。腫瘤病理生理學(xué)的特征在于細(xì)胞遺傳和代謝組成病變，而自噬將代謝物傳感與蛋白質(zhì)降解及生物能量效率聯(lián)系起來，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療關(guān)系密切［11］。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過程受自噬的影響［10］，然而這種自噬是否有助于AEA的抗腫瘤作用仍不清楚。另外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress， ERS）與自噬密切相關(guān)，可以與自噬協(xié)同作用影響腫瘤細(xì)胞的生存［12-13］。本課題中將探討AEA對卵巢癌的治療作用，并進(jìn)一步揭示自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與AEA的抗腫瘤作用，為將AEA應(yīng)用于卵巢癌的治療打下堅實的實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1　材料

1.1細(xì)胞株和動物人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。4~6周齡C57BL/6J雄性小鼠6只，體重16~18 g， SPF級，購自南京大學(xué)模式動物中心，許可證號為SCXK（蘇）2017-0007。

1.2試劑AEA購自Sigma； CCK-8試劑盒購自Progma；抗ATG5、BECN1、P62和LC3B-Ⅱ單克隆抗體購自Abcam；抗cleaved caspase-3、caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly（ADP-ribose） polymerase，PARP］和cleaved PARP多克隆抗體購自Santa Cruz；Ⅱ抗及Western blot相關(guān)化學(xué)試劑購自武漢飛羿技術(shù)公司； ECL發(fā)光液購自Pierce；胎牛血清購自杭州四季青公司； RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco； Annexin V PE-7AAD凋亡試劑盒購自BD Biosciences。

1.3臨床樣本收集本研究于2016年2月~2018年12月期間從福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院招募了15例診斷為卵巢癌的患者，平均年齡為38.5歲。此外，同時招募15例健康志愿者作為對照組，平均年齡為39.3歲。研究方案經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均提供知情同意書。在研究開始之前，未對患者進(jìn)行系統(tǒng)治療，也未使用免疫抑制劑。

2　方法

2.1動物的分組和處置所有C57BL/6J小鼠隨機分為：PBS對照（control，CON）組，共3只，僅皮下種植OVCAR3細(xì)胞，每只種植1×106個細(xì)胞，種植后第4天起每2日瘤周注射PBS； AEA治療組，共3只，皮下種植OVCAR3細(xì)胞，每只種植1×106細(xì)胞，種植后第4天起每2日瘤周注射AEA（每只每次10 μmol/L）。在第32天處死小鼠，取腫瘤組織拍照，并經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片（玻片事先用多聚賴氨酸處理）。

2.2OVCAR3細(xì)胞的培養(yǎng)OVCAR3細(xì)胞為貼壁生長細(xì)胞，使用含10%的胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、含5% CO2的孵箱中，每2 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

2.3Western blot實驗使用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，將完成定量的樣品上樣到聚丙烯酰胺凝膠中，上樣量40 μg，開始電泳，電泳結(jié)束轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。將膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h，封閉結(jié)束后孵育 I 抗過夜，再加入所需Ⅱ抗孵育，最后通過ECL化學(xué)發(fā)光顯影及曝光。

2.4Transwell小室侵襲實驗用BD公司的Matrigel以1∶8稀釋，包被Transwell小室底部膜上室面，置37℃ 30 min使Matrigel聚合成凝膠。在小室下方加入含20%胎牛血清的DMEM 600 μL，小室上方接種無血清DMEM稀釋的OVCAR3細(xì)胞2×104個，培養(yǎng)24 h后，吸干上室面液體，并轉(zhuǎn)移到含有800 μL 4%多聚甲醛的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，室溫固定15 min后，用結(jié)晶紫室溫染色15 min，使用ddH2O沖洗小室3次后，用棉棒輕輕擦干，待其晾干后于顯微鏡下隨機挑選5個視野，計算穿膜細(xì)胞數(shù)。

2.5病理變化的觀察采用相鄰切片作常規(guī)HE染色，觀察皮下卵巢癌組織病理改變，估計AEA對卵巢癌的治療效果。

2.6CCK-8法檢測細(xì)胞活力取對數(shù)生長期OVCAR3細(xì)胞鋪96孔板，每孔4 000個細(xì)胞，在其貼壁生長后，每組10孔每孔加入10 μL CCK-8溶液后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，并在酶標(biāo)儀上450 nm處測定吸光度（）值，以相對應(yīng)的吸光度值繪制生長曲線。重復(fù)3次。

2.7劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移能力取OVCAR3細(xì)胞對數(shù)生長期時鋪6孔板，每孔2×106細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中，待其貼壁生長并密度合適后，用槍頭在每孔正中間畫線，并用PBS沖洗，洗去劃痕中間死亡的細(xì)胞，并將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基。分別在0 h和48 h拍照。

2.8雙染法檢測細(xì)胞凋亡取處理完的OVCAR3細(xì)胞用胰蛋白酶消化， 1 200 r/min離心3 min，用4℃預(yù)冷的無菌PBS漂洗2次，每次5 min，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108/L，在200 μL的細(xì)胞懸液中加入10 μL的Annexin V-FITC，然后加入10 μL（20 mg/L）PI，室溫避光孵育10 min，加入500 μL的PBS，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

所有統(tǒng)計分析均用SPSS 19.0軟件完成。各組檢測結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組組間比較用檢驗；多組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），各組均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-檢驗；兩變量之間相互關(guān)系用Pearson線性相關(guān)分析，計算相關(guān)系數(shù)。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　卵巢癌患者體內(nèi)血清N-花生四烯酸氨基乙醇水平下調(diào)

采用ELASA實驗檢測15名卵巢癌患者及15名健康對照組成員體內(nèi)血清AEA的水平，結(jié)果如圖1A所示，與相對應(yīng)的健康對照組成員血清AEA的水平相比，卵巢癌患者血清AEA的水平顯著降低（<0.01）。隨后，運用ROC曲線區(qū)分卵巢癌患者和對照組成員以評估AEA對卵巢癌患者的診斷價值，結(jié)果顯示， AEA的曲線下面積為0.838（圖1B），提示AEA有望成為區(qū)分卵巢癌患者和健康個體的靈敏性生物學(xué)標(biāo)志物。

Figure 1.　AEA was down-regulated in ovarian cancer. A: the serum level of AEA in the ovarian cancer patients and normal control （NC） individuals； B: ROC analysis based on the levels of AEA. Mean ±SD. n=15. **P<0.01 vs NC group.

2　N-花生四烯酸氨基乙醇抑制OVCAR3卵巢癌細(xì)胞的活性

為進(jìn)一步探討AEA對卵巢癌的影響，本研究首先檢測AEA對卵巢癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲的影響。分別使用0、5、10和20 μmol/L的AEA處理OVCAR3細(xì)胞24 h后，CCK-8實驗檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，AEA各劑量組卵巢癌細(xì)胞的生存率顯著降低（<0.01），見圖2A。而Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示，AEA各劑量組的侵襲能力顯著降低，且降低程度呈一定劑量依賴性，見圖2B。劃痕實驗結(jié)果表明，AEA明顯減弱卵巢癌細(xì)胞的遷移能力，見圖2C。以上結(jié)果顯示，AEA對卵巢癌細(xì)胞的活力、遷移和侵襲能力有一定抑制作用。

Figure 2.　AEA inhibited the viability, invasion and migration of OVCAR3 ovarian cancer cell. A: CCK-8 assay was used to detect the growth curve of ovarian cancer cells treated with AEA at 0, 5, 10 and 20 μmol/L; B: Transwell assay was used to measure the ability of invasion in 4 groups of cells (×100); C: the Scratch test was used to detect the migration ability of 4 groups of cells (×100). Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L AEA group.

3　N-花生四烯酸氨基乙醇促進(jìn)OVCAR3卵巢癌細(xì)胞凋亡

通過Western blot實驗檢測不同濃度AEA處理24 h后凋亡相關(guān)蛋白caspase-3及其剪切體cleaved caspase-3，PARP及其剪切體cleaved PARP的蛋白水平，與對照組相比，不同濃度AEA處理OVCAR3細(xì)胞后cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平明顯升高，而caspase-3和PARP變化的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（圖3A），提示AEA促進(jìn)OVCAR3細(xì)胞凋亡發(fā)生。流式細(xì)胞術(shù)的分析結(jié)果也進(jìn)一步佐證上述實驗結(jié)果，表明各劑量AEA可引起卵巢癌細(xì)胞凋亡率增加（圖3B）。上述實驗提示AEA可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，從而對卵巢癌起抑制作用。

Figure 3.　AEA promote the apoptosis of OVCAR3 ovarian cancer cells. A: the protein levels of apoptosis-related molecules caspase-3, cleaved caspase-3, PARP and cleaved PARP in the 4 groups; B： flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of each group. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L AEA group.

4　N-花生四烯酸氨基乙醇的抗腫瘤效果

為明確AEA對卵巢癌的治療作用，我們在小鼠皮下接種OVCAR3卵巢癌細(xì)胞，待其長到合適大小后開始瘤周給藥，每4 d檢測腫瘤體積，結(jié)果顯示，與對照組相比，AEA給藥后可有效抑制腫瘤生長速度，腫瘤體積明顯縮小，瘤重顯著減輕（<0.05），見圖4。動物實驗結(jié)果提示AEA具有顯著抗腫瘤效果，可能成為卵巢癌治療的新藥物。

Figure 4.　AEA inhibited the tumor growth, and the tumor volume (A), gross view of mouse tumor tissues (B) and tumor weight (C) of the mice were observed. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs CON group.

5　N-花生四烯酸氨基乙醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬

5、10和20 μmol/L的AEA處理卵巢癌細(xì)胞時，除了凋亡蛋白表達(dá)發(fā)生變化以外，自噬相關(guān)蛋白ATG5、BECN1、P62和LC3B-Ⅱ表達(dá)水平也發(fā)生了變化，如圖5所示，用各劑量的AEA處理24 h后，用Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)隨著AEA劑量增加，卵巢癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白ATG5、BECN1和LC3B-Ⅱ表達(dá)增加，P62蛋白表達(dá)減少（<0.01），見圖5A。在腫瘤組織中也發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，使用AEA治療后，小鼠腫瘤組織的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)與OVCAR3細(xì)胞有相同變化（<0.01），見圖5B。上述結(jié)果表明AEA可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬。

Figure 5.　AEA promoted autophagy in ovarian cancer cells. A: the expression of autophagy related proteins in the OVCAR3 ovarian cancer cells were detected by Western blot; B: the expression of autophagy related proteins in the xenografted tumors of the animals were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L AEA grpup; #P<0.05, ##P<0.01 vs CONgroup.

6　N-花生四烯酸氨基乙醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

鑒于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬的密切關(guān)系，本研究探究是否同時影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。我們分別使用0、5、10和20 μmol/L的AEA處理OVCAR3細(xì)胞24 h，利用Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示AEA處理后可以上調(diào)PERK、eIF2α和CHOP等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的水平（<0.01），見圖6A。同時AEA還可以提高IRE1α和ATF6α蛋白的水平（<0.01），見圖6B。以上結(jié)果說明AEA可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

Figure 6.　AEA promoted endoplasmic reticulum stress in the OVCAR3 ovarian cancer cells. The expression levels of endoplasmic reticulum stress-related proteins PERK, eIF2α, CHOP, IRE1α and ATF6α were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L AEA group.

7　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與AEA誘導(dǎo)的OVCAR3細(xì)胞凋亡

在確定AEA對卵巢癌細(xì)胞自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響作用后，我們嘗試進(jìn)一步探究自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在卵巢癌細(xì)胞凋亡過程中的具體作用。預(yù)先使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑衣霉素（tunicamycin，TMNI） 1.5 mg/L處理OVCAR3細(xì)胞1 h，能夠有效促進(jìn)AEA對卵巢癌細(xì)胞的抑制作用，抑制OVCAR3細(xì)胞的活力（圖7A）。而預(yù)先使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑牛磺熊去氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid， TUDC）500 mg/L處理OVCAR3細(xì)胞1 h，卻能夠顯著降低AEA抑制OVCAR3細(xì)胞活力的能力（圖7B）。同時，我們在使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑和抑制劑后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測AEA對卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑TMNI可促進(jìn)AEA誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡，而ERS抑制劑TUDC則減少了AEA誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡（圖7C）。從而提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可促進(jìn)AEA引起的卵巢癌細(xì)胞凋亡。

Figure 7.　Endoplasmic reticulum stress promoted apoptosis of OVCAR3 ovarian cancer cells induced by AEA. A: the viability of ovarian cancer cells treated with tunicamycin, according to the CCK-8 assay; B: the viability of OVCAR3 ovarian cancer cells treated with tauroursodeoxycholic acid, according to the CCK-8 assay; C: the apoptosis of OVCAR3 ovarian cancer cells treated with tunicamycin and tauroursodeoxycholic acid, according to the flow cytometry with PI/Annexin V-FITC staining. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs CON group; #P<0.05，##P<0.01 vs AEA group.

8　自噬影響AEA誘導(dǎo)的OVCAR3細(xì)胞凋亡

為了闡明自噬在AEA治療卵巢癌中的作用，預(yù)先使用3 mmol/L自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine， 3-MA）處理OVCAR3細(xì)胞1 h，能夠有效促進(jìn)AEA對卵巢癌細(xì)胞的抑制作用，抑制OVCAR3細(xì)胞的活力（圖8A）。同時利用Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示3-MA能顯著提高AEA誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的功能（圖8B）。

Figure 8.　Autophagy affected apoptosis of OVCAR3 ovarian cancer cells induced by AEA. A: the viability of OVCAR3 ovarian cancer cells treated with 3-MA, according to the CCK-8 assay; B: the protein levels of apoptosis related molecules in the OVCAR3 ovarian cancer cells treated with 3-MA determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05,**P<0.01 vs CON group; #P<0.05, ##P<0.01 vs AEA group.

9　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬的相互調(diào)控關(guān)系

為了研究自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系，我們預(yù)先使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑TUDC處理OVCAR3細(xì)胞1 h，能夠有效抑制AEA引起的LC3B-Ⅱ水平上調(diào)（圖 9A），從而提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)AEA引起的細(xì)胞自噬。預(yù)先使用自噬抑制劑3-MA處理OVCAR3細(xì)胞 1 h，能夠進(jìn)一步促進(jìn)AEA引起的CHOP水平上調(diào)（圖9B），從而提示自噬能夠抑制AEA引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

Figure 9.　The relationship between endoplasmic reticulum stress and autophagy in the OVCAR3 ovarian cancer cells. A: the expression of LC3B in OVCAR3 cells treated with TUDC, according to Western blot; B: the expression of CHOP in OVCAR3 treated with 3-MA, according to Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs CON group; #P<0.05, ##P<0.01 vs AEA group.

討論

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)AEA在卵巢癌患者體內(nèi)表達(dá)下調(diào)，而給予AEA處理可以有效降低卵巢癌細(xì)胞的活力及遷移和侵襲能力，且能明顯抑制卵巢癌瘤組織的生長。本研究進(jìn)一步探討表明AEA通過抑制自噬、增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而增加卵巢癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而治療卵巢癌。

卵巢癌是主要的婦科惡性腫瘤之一，2018年全球新發(fā)病例295 414例，死亡184 799例［2］。且大多數(shù)患者在放化療后，預(yù)后依然很差［14-15］，因此，迫切需要開發(fā)新的卵巢癌治療靶點。自90年代初發(fā)現(xiàn)大麻素系統(tǒng)以來，內(nèi)源性大麻素已被證明對多種腫瘤具有明顯治療作用［16］。而AEA作為內(nèi)源性大麻素的一種，也是大麻的活性成分，可通過結(jié)合大麻素受體發(fā)揮抑制細(xì)胞生長、增加細(xì)胞凋亡等作用［16］。本研究中，我們檢測了卵巢癌患者和健康對照組體內(nèi)AEA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者體內(nèi)AEA的表達(dá)水平顯著下降，而ROC曲線評估表明AEA有成為卵巢癌患者早期靈敏性生物學(xué)標(biāo)志物的可能，這與前人研究中表明內(nèi)源性大麻素通過改變激素水平而影響機體生理功能，有望成為早期靈敏性生物學(xué)標(biāo)志物的結(jié)果相似［6］。

最新研究顯示，內(nèi)源性大麻素可以抑制多種腫瘤的細(xì)胞增殖［4， 17］。因此，在本實驗中，我們首先用CCK-8法檢測了AEA處理后OVCAR3卵巢癌細(xì)胞的活力，結(jié)果表明與對照組相比，經(jīng)AEA處理的卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率降低，且AEA處理的卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率的降低與AEA藥物濃度呈正相關(guān)。為了進(jìn)一步探討AEA的作用，本課題采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測AEA處理的OVCAR3卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示AEA可以增強或促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。同時Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果也再一次佐證AEA可以增強或促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。

上述實驗結(jié)果提示，AEA確實可以通過促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，從而抑制卵巢癌細(xì)胞生長。為進(jìn)一步明確AEA的治療作用，本實驗在動物水平上再一次驗證。當(dāng)給予AEA治療后，小鼠皮下卵巢癌的增長速率顯著下降，提示AEA治療可以延緩卵巢癌的進(jìn)展，有望成為治療卵巢癌的藥物。因此，本課題深入研究AEA發(fā)揮抑制卵巢癌作用的具體機制。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白合成加工最大的工廠，是細(xì)胞內(nèi)最重要的細(xì)胞器之一［18］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯誤折疊與未折疊蛋白聚集以及鈣離子平衡紊亂，可激活未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)和 caspase-12介導(dǎo)的凋亡通路等信號途徑，亦能獨立地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞重要的防御機制之一［18］。大量研究表明，大麻素與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)。Lee等［19］發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性大麻素激動劑可以誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這與本研究發(fā)現(xiàn)的AEA處理的卵巢癌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)都顯著上調(diào)的結(jié)果一致。

研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對腫瘤細(xì)胞死亡的影響也是不盡相同的［20］，且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在AEA誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡中的作用也仍不明確。而本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)隨著AEA劑量增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯增加，提示AEA可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激且呈一定劑量依賴性。而當(dāng)我們使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑后，卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞活力被顯著抑制，且流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑可以明顯增加卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡；同時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑呈現(xiàn)相反的結(jié)果。上述結(jié)果提示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)AEA誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡作用，從而抑制卵巢癌的進(jìn)展。

自噬是一種自我降解系統(tǒng)，在治療敏感和多藥耐藥癌癥時普遍出現(xiàn)。自噬對于多藥耐藥腫瘤來說可能是一把雙刃劍：它參與多藥耐藥的發(fā)展并保護腫瘤細(xì)胞免受化學(xué)治療，但也可以殺死凋亡途徑無活性的多藥耐藥癌細(xì)胞［10］?？鼓[瘤藥物誘導(dǎo)的自噬也可以激活多藥耐藥細(xì)胞中的凋亡信號通路，促進(jìn)多藥耐藥逆轉(zhuǎn)［10-11］。為了探討自噬在AEA誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡中的作用，我們首先檢測不同濃度AEA處理下及AEA藥物治療后腫瘤組織內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著AEA濃度增加，自噬相關(guān)蛋白ATG5、BECN1和LC3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而P62蛋白表達(dá)明顯減少，提示AEA處理可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞自噬。

自噬是不同于細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡機制，其在細(xì)胞存活和死亡中具有重要作用，對人類的健康產(chǎn)生重要影響［21-22］。為闡明AEA處理的卵巢癌細(xì)胞中自噬的作用，我們使用自噬抑制劑預(yù)先處理卵巢癌細(xì)胞，而后檢測細(xì)胞的活力，結(jié)果表明抑制自噬可以有效增強AEA抑制卵巢癌細(xì)胞活力的作用。并進(jìn)一步使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測自噬抑制劑對AEA處理的卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，自噬抑制劑可以增強AEA誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡。且用Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，自噬抑制劑可以增加AEA處理的卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果提示，自噬在AEA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起保護作用，而抑制自噬可以增強AEA的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。

細(xì)胞自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激間的緊密聯(lián)系已被學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可。報道證實［23］，利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑可以激活自噬反應(yīng)，而自噬可以平衡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，促進(jìn)細(xì)胞存活。與此相似，本課題中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激顯著增強卵巢癌細(xì)胞凋亡，而自噬卻抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡發(fā)生，因此探索兩者間的關(guān)系顯得尤為重要。而我們發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑處理卵巢癌細(xì)胞，能夠明顯降低細(xì)胞的自噬水平。同時，我們也觀察到預(yù)先給予自噬抑制劑 3-MA 處理卵巢癌細(xì)胞，能夠進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生。以上研究結(jié)果可以認(rèn)為自噬是一個“有益的監(jiān)護人”，通過負(fù)反饋機制抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，調(diào)節(jié)AEA誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡。

總之，我們發(fā)現(xiàn)AEA可以抑制卵巢癌細(xì)胞的活力和遷移侵襲能力，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，抑制卵巢癌組織增長，機制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)。這些結(jié)果提供了通過AEA增強人類卵巢癌細(xì)胞生長抑制作用從而達(dá)到誘導(dǎo)其凋亡的新治療策略，為探索卵巢癌的治療提供了新思路。

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Role of endoplasmic reticulum stress and autophagy mediated by endocannabinoid-arachidonic acid aminoethanol in ovarian cancer cells

HUANG Jing-ying， CHEN Xuan， RAO Jing-hong

（，，362000，）

To study the effect of endocannabinoid-arachidonic acid aminoethanol （AEA） on ovarian cancer and its mechanism.The serum levels of AEA in healthy control group and ovarian cancer group were analyzed by ELISA， and the diagnostic value of AEA in ovarian cancer patients was evaluated by ROC curve. The effects of AEA on the viability， migration and invasion abilities of the ovarian cancer cells were detected by CCK-8 assay， Transwell cell invasion test and Scratch test. The effect of AEA on ovarian cancer was further verified by the measurement of tumor volume， tumor weight and visual map of tumor tissue. Meanwhile， flow cytometry and Western blot were used to determine the effect of AEA on the apoptosis of ovarian cancer cells， so as to explore the mechanism of AEA promoting the apoptosis of ovarian cancer cells through detecting the endoplasmic reticulum stress and autophagy related proteins by Western blot.The serum levels of N-arachidonic aminoethanol in the patients with ovarian cancer were significantly decreased. ROC results suggested that AEA was a sensitive biological marker to distinguish the patients with ovarian cancer from healthy dedividuals. In addition， AEA inhibited the cell viability， migration and invasion abilities of ovarian cancer cells， and inhibited the growth of ovarian cancer tissues.By promoting endoplasmic reticulum stress and affecting autophagy of ovarian cancer cells， AEA promotes apoptosis of ovarian cancer cells.

Endogenous cannabinoids；-arachidonic acid aminoethanol； Ovarian cancer； Autophagy； Endoplasmic reticulum stress

R737.32； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.014

1000-4718（2020）11-2020-10

2019-10-25

2020-09-11

福建省泉州市科技計劃項目（No.2018Z073）

Tel: 15259762388； E-mail: Huangjy0235@yeah.net

（責(zé)任編輯：宋延君，余小慧）