李雪菲， 張丁丁， 董丹丹， 凌晨， 孫煥欣， 杜秋

BIRC5高表達(dá)在胃癌中增強(qiáng)細(xì)胞活力、抑制凋亡并與預(yù)后不良相關(guān)*

李雪菲1， 張丁丁2△， 董丹丹2， 凌晨3， 孫煥欣2， 杜秋1

（1成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610000；2四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610054；3電子科技大學(xué)，四川 成都 610000）

探討含桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列蛋白5 （BIRC5）在胃癌組織中的表達(dá)及其與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，并通過(guò)敲減表達(dá)探討B(tài)IRC5對(duì)胃癌細(xì)胞活力和凋亡的影響。收集67例胃癌組織和癌旁組織，采用免疫組化檢測(cè)BIRC5表達(dá)，并分析BIRC5表達(dá)與胃癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。采用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN-1和MGC-803及正常胃上皮細(xì)胞系GES-1中BIRC5的mRNA和蛋白表達(dá)。將胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS分為blank組（不做任何處理）、Ctr-sh組（轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒）和BIRC5-sh組（轉(zhuǎn)染BIRC5-shRNA質(zhì)粒），用Western blot檢測(cè)BIRC5-shRNA的干擾效率， MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況， Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2的表達(dá)水平。BIRC5主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，胃癌組織中BIRC5陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織（<0.01）。TNM分期為Ⅲ~Ⅳ期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者BIRC5陽(yáng)性率分別高于TNM分期為Ⅰ~Ⅱ期及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者（<0.05）。BIRC5陽(yáng)性表達(dá)患者的生存期短于BIRC5陰性表達(dá)患者（=0.011 2）。在AGS細(xì)胞中敲減的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)48、72和96 h的BIRC5-sh組細(xì)胞活力均低于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的blank組和Ctr-sh組， BIRC5-sh組的細(xì)胞凋亡率高于blank組和Ctr-sh組， cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平高于blank組和Ctr-sh組， Bcl-2的蛋白表達(dá)低于blank組和Ctr-sh組（均<0.05）。胃癌中BIRC5高表達(dá)，這預(yù)示不良預(yù)后； BIRC5可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞凋亡。

BIRC5蛋白；胃癌；細(xì)胞活力；細(xì)胞凋亡；預(yù)后

胃癌是一類(lèi)起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，亦為全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率高，常見(jiàn)于東亞地區(qū)及發(fā)展中國(guó)家，可達(dá)到全球胃癌發(fā)病率的67%［1-2］。絕大多數(shù)胃癌由于早期癥狀隱匿，常與胃炎和胃潰瘍等胃慢性疾病混淆，當(dāng)疾病進(jìn)展至中晚期時(shí)才得以確診，患者常因此失去最佳治療時(shí)機(jī)，此時(shí)應(yīng)用傳統(tǒng)手術(shù)，放化療治療效果有限，生存率較低［3］。因此，探究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)對(duì)于提高胃癌病例的生存率至關(guān)重要。

含桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列蛋白5 （baculoviral inhibitor of apoptosis protein repeat-containing protein 5， BIRC5）是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein， IAP）家族的成員，是抑制凋亡細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂，抑制caspase-3和caspase-7的活性，最終發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用［4-5］。借助BIRC5在腫瘤組織中特異性高表達(dá)的特點(diǎn)及其強(qiáng)大的抗細(xì)胞凋亡作用，或許能夠找到有效治療胃癌的靶點(diǎn)藥物。

本研究首先通過(guò)免疫組化檢測(cè)胃癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中BIRC5表達(dá)量，分析其表達(dá)與胃癌臨床病理特征及預(yù)后間的關(guān)系，隨后利用RT-qPCR和Western blot法檢測(cè)多種胃癌細(xì)胞系和正常胃上皮細(xì)胞系中BIRC5的mRNA和蛋白表達(dá)量，最后通過(guò)shRNA敲減技術(shù)、Western blot、MTT法及流式細(xì)胞術(shù)探究BIRC5對(duì)胃癌細(xì)胞活力和凋亡的影響，以期揭示BIRC5在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及其生物學(xué)功能，為胃癌靶向藥物的研發(fā)提供理論指導(dǎo)。

材料和方法

1　樣本資料

收集2014年2月~2015年2月入住我院行手術(shù)治療的胃癌患者的胃癌組織及相應(yīng)的癌旁組織（將距腫瘤邊緣>5 cm的組織定義為癌旁組織）標(biāo)本。要求患者未合并其他腫瘤或患有影響生命的重大疾病，且采樣前未進(jìn)行包括放療、化療、免疫治療等在內(nèi)的任何其他治療，經(jīng)病理診斷為胃癌，并且具有完整的病歷和隨訪資料，最終入組67例。67例標(biāo)本中，按年齡可分為34例60歲（含）以上患者和33例60歲以下患者；按性別則有男性患者45例，女性患者22例；按腫瘤分化程度，有35例呈中高分化程度，32例呈低分化表現(xiàn)； 54例為腺癌，13例為非腺癌； 20例TNM分期為Ⅰ~Ⅱ期，47例為Ⅲ~Ⅳ期； 23例腫瘤最大徑≥5 cm， 44例腫瘤最大徑<5 cm； 31例可見(jiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移， 36例未見(jiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移； 58例患者均合并不同程度的胃炎。本研究所收集的67例患者標(biāo)本均經(jīng)由患者及患者家屬簽署知情同意書(shū)并遵循倫理委員會(huì)制定的倫理標(biāo)準(zhǔn)。

2　細(xì)胞及主要試劑

3株人源胃癌細(xì)胞系（AGS、MKN-1和MGC-803）和正常胃上皮細(xì)胞系GES-1均購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基、RPIM-1640培養(yǎng)基、F12K培養(yǎng)基、10%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）、雙抗等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自Gibco； RNA提取試劑盒和RT-qPCR試劑盒等購(gòu)自QIAGEN；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自BIO-RAD；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購(gòu)自TaKaRa； MTT試劑盒購(gòu)自?shī)W淇洛譜生物科技有限公司； Annexin V-FITC試劑盒購(gòu)自Sigma；兔源抗BIRC5單抗購(gòu)自RD；細(xì)胞裂解液和HRP標(biāo)記的羊抗兔II抗購(gòu)自碧云天公司。BIRC5引物、內(nèi)參照引物及BIRC5-shRNA由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

3　方法

3.1引物設(shè)計(jì)、RNA提取及RT-qPCR設(shè)計(jì)合成BIRC5的上游引物序列為5'-ATGGGTGCCCCGACGT-3'，下游引物序列為5'-ACAGCAGTGAGTCTGTC-3'；內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5'-CTGACAGACTACCTCATGAAG-3'，下游引物序列為5'-TCAATCCATGGCAGC-3'；BIRC5-shRNA的序列為5'-GAAAGTGCGCCGTGCCATC-3'。

參照miRNeasy Mini Kit說(shuō)明書(shū)提取總RNA。使用Invitrogen的SuperScriptTMII First-Strand Synthesis System將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃ 2 min； 95℃ 10 s， 60℃ 30 s， 72℃ 30 s， 40個(gè)循環(huán)。參照miScript SYBR Green PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定樣品循環(huán)閾值（Ct值），檢測(cè)BIRC5在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況。

3.2細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞用F12K培養(yǎng)基+10% FBS培養(yǎng)；MKN-1和MGC-803細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基+10% FBS培養(yǎng)； GES-1細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基+10% FBS培養(yǎng)。

收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞并接種于6孔板中，接種密度以80%為宜。參照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，將50 μg BIRC5-sh質(zhì)?；駽tr-sh質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照（blank）組，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后更換為正常含有10% FBS的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。采用Western blot檢測(cè)BIRC5蛋白表達(dá)以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

3.3免疫組化染色將收集的胃癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本經(jīng)過(guò)甲醛固定48 h后常規(guī)制作切片，進(jìn)行BIRC5蛋白抗原免疫組化檢測(cè)。免疫組化抗原修復(fù)時(shí)間為8 min，封閉條件為室溫封閉30 min，Ⅰ抗為兔源抗BIRC5單克隆抗體（1∶40稀釋）， 4℃孵育過(guò)夜。在切片的陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)域隨機(jī)選擇5個(gè)視野，在顯微鏡下對(duì)染色進(jìn)行如下評(píng)分：（1）染色深淺按無(wú)著色（0分）、淡黃色（1分）、棕黃色（2分）和棕褐色（3分）評(píng)分；（2）染色細(xì)胞數(shù)量按沒(méi)有細(xì)胞染色（0分）、1%~10%細(xì)胞染色（1分）、11%~33%細(xì)胞染色（2分）、34%~66%染色（3分）和超過(guò)66%染色（4分）評(píng)分。兩項(xiàng)結(jié)果相加， <4分為陰性， ≥4分判斷為陽(yáng)性［4-5］。

3.4Western blot實(shí)驗(yàn)首先配制細(xì)胞裂解液于1.5 mL離心管中，置于冰上待用。預(yù)冷的PBS洗滌待收取細(xì)胞樣品2次，加入裂解液后用細(xì)胞刮輕輕刮取細(xì)胞，收集細(xì)胞至1.5 mL離心管中，冰浴30 min，超聲裂解儀瞬時(shí)超聲破碎（功率35 W，超聲3 s，停2 s，總時(shí)間10 min）， 12 000 r/min離心10 min，收集上清并測(cè)定蛋白濃度。取100 μL上清液加入20 μL 6× protein loading buffer，沸水浴10 min后直接跑膠。分別配制12%分離膠和5%濃縮膠， 65 V恒壓電泳30 min，使蛋白樣品在濃縮膠中充分濃縮，待進(jìn)入分離膠后，120 V電泳2 h。恒流250 mA轉(zhuǎn)印60 min，轉(zhuǎn)印結(jié)束后PBST漂洗3次，浸于5%脫脂乳中室溫封閉1 h。PBST漂洗3次，加入Ⅰ抗稀釋液稀釋好的兔源抗BIRC5單克隆抗體， 4℃孵育過(guò)夜。回收Ⅰ抗， PBST漂洗3次，加入5%脫脂乳稀釋的Ⅱ抗，室溫震蕩孵育1 h。PBST漂洗每次3次，加入顯色液顯色后置于曝光儀中曝光保存圖片分析結(jié)果。

Western blot檢測(cè)cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白水平的方法同上，Ⅰ抗更換成抗相應(yīng)蛋白的抗體。

3.5MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力收集轉(zhuǎn)染2 d后BIRC5-sh組、Ctr-sh組及blank組細(xì)胞，制備密度為2×107/L的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100 μL，每組細(xì)胞鋪3個(gè)板，分別測(cè)定24、48、72和96 h后的490值，每孔設(shè)置3個(gè)重復(fù)。每孔加入10 μL MTT工作液后置于37℃培養(yǎng)箱中孵育3 h，加入10 μL MTT溶解液后置于低俗搖床上震蕩15 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490值，記錄分析數(shù)據(jù)。

3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡待6孔板中細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。取5×104個(gè)重懸細(xì)胞， 300×離心5 min，棄上清液，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻。室溫避光孵育10 min， 300×離心5 min，加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液后重懸細(xì)胞，最后加入10 μL碘化丙啶（propidium iodide， PI）染色液混勻，冰浴避光后置于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

3.7隨訪隨訪期間記錄病例復(fù)發(fā)、死亡、刪失情況及對(duì)應(yīng)的時(shí)點(diǎn)，且每間隔3個(gè)月復(fù)查1次， 2年后每間隔6個(gè)月復(fù)查1次，直至患者死亡，記錄患者的總生存期（overall survival， OS）， OS的終點(diǎn)事件為任何原因引起的死亡。隨訪終止時(shí)間為2020年2月。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料的檢驗(yàn)方法為2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法及l(fā)og-rank檢驗(yàn)。當(dāng)<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　BIRC5在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示， BIRC5主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，顏色呈棕黃色，見(jiàn)圖1；在胃癌組織中， BIRC5陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織（<0.01），見(jiàn)表1。

Figure 1.　Expression of BIRC5 in gastric cancer and paracancerous tissues (immunohistochemistry, ×200).

表1　胃癌組織和癌旁組織中BIRC5陽(yáng)性表達(dá)率的比較

2　BIRC5表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

TNM分期為Ⅲ~Ⅳ期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌患者的BIRC5陽(yáng)性率高于TNM分期為Ⅰ~Ⅱ期及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌患者（<0.05）；而不同年齡、性別、分化程度、組織學(xué)類(lèi)型和腫瘤最大徑的胃癌患者間BIRC5陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（>0.05），見(jiàn)表2。

表2　BIRC5表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

3　BIRC5表達(dá)與胃癌預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)隨訪患者的總生存期，繪制Kaplan-Meier生存曲線，并用log-rank檢驗(yàn)比較BIRC5陽(yáng)性表達(dá)的54例患者與BIRC5陰性表達(dá)的13例患者生存期差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BIRC5陽(yáng)性表達(dá)患者生存期短于BIRC5陰性表達(dá)患者（=0.011 2），見(jiàn)圖2。

Figure 2.　Survival curves of gastric cancer patients with positive and negative expression of BIRC5.

4　敲減BIRC5表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞活力

首先檢測(cè)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN-1和MGC-803及正常胃上皮細(xì)胞系GES-1中BIRC5的mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中BIRC5的mRNA和蛋白表達(dá)均高于正常胃上皮細(xì)胞（<0.05），見(jiàn)圖3A、B。在AGS細(xì)胞中敲減的表達(dá)， Western blot檢測(cè)敲減有效（<0.05），見(jiàn)圖3C； MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在48、72和96 h， BIRC5-sh組細(xì)胞活力均低于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的blank組和Ctr-sh組（<0.05），見(jiàn)圖3D。

Figure 3.　Knock-down of BIRC5 inhibited the viability of gastric cancer cells. A: RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of BIRC5 in AGS, MKN-1, MGC-803 and GES-1 cells; B: Western blot was used to detect the protein expression of BIRC5 in AGS, MKN-1, MGC-803 and GES-1 cells; C: Western blot was used to detect the protein expression of BIRC5 in AGS cells to verify the knock-down efficiency; D: MTT assay was used to measure the viability of AGS cells in each group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs GES-1cells; #P<0.05 vs blankgroup.

5　敲減BIRC5表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BIRC5-sh組的細(xì)胞凋亡率高于blank組和Ctr-sh組（<0.05），見(jiàn)圖4A。Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BIRC5-sh組的cleaved caspase-3和Bax蛋白水平高于blank組和Ctr-sh組，而B(niǎo)cl-2的蛋白表達(dá)低于blank組和Ctr-sh組（<0.05），見(jiàn)圖4B。

Figure 4.　Knock-down of BIRC5 expression promoted the apoptosis of gastric cancer AGS cells. A: flow cytometry analysis; B: Westeren blot analysis. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs blank group.

討論

胃癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤，由于具有發(fā)病初期癥狀隱匿的特點(diǎn)，常被患者忽視，從而錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，嚴(yán)重影響該病的治愈率和生存期。盡管近年來(lái)有多種胃癌靶向治療方法的相關(guān)研究，但總體療效并不理想。因此，從分子學(xué)角度探究胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)對(duì)胃癌的臨床治療有非常重要的意義。

細(xì)胞凋亡對(duì)于維持機(jī)體細(xì)胞的正常功能具有非常重要的作用。正常情況下，機(jī)體可通過(guò)啟動(dòng)凋亡程序清除受損的DNA或循環(huán)周期異常的細(xì)胞。但是，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生惡變時(shí)，凋亡機(jī)制受損，機(jī)體不能主動(dòng)清除惡變細(xì)胞，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及產(chǎn)生耐藥性。IAP是一類(lèi)進(jìn)化高度保守的抗細(xì)胞凋亡因子，主要通過(guò)抑制caspase活性及調(diào)節(jié)NF-κB的作用而抑制細(xì)胞凋亡。作為基因家族最小的成員，全長(zhǎng)14.7 kb，位于染色體17q25，于1997年從人類(lèi)基因組庫(kù)中篩選分離鑒定得出［6］。BIRC5具有多種生物學(xué)功能：（1）在抑制細(xì)胞凋亡方面效果顯著：目前的研究表明， BIRC5可通過(guò)多種途徑直接或間接抑制caspase-3和caspase-7的活性，最終阻止細(xì)胞凋亡［7］；（2）促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂： BIRC5羧基末端的α螺旋結(jié)構(gòu)可協(xié)助校準(zhǔn)有絲分裂中期的染色體分裂過(guò)程及有絲分裂早期的微管運(yùn)動(dòng)；（3）促進(jìn)血管生成；（4）作為腫瘤診斷、治療及預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物［8］。因此，抑制BIRC5的活性，或有助于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，提示BIRC5可能成為腫瘤治療的潛在新靶點(diǎn)。

BIRC5在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如鼻咽癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌等，而在正常組織表達(dá)量很低或不表達(dá)［7， 9-12］，已證實(shí)BIRC5參與腫瘤細(xì)胞的惡變及抗細(xì)胞凋亡生理過(guò)程，提示BIRC5可以作為抗腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。在本研究中，通過(guò)對(duì)67例胃癌患者的胃癌組織樣本進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中的BIRC5陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，說(shuō)明BIRC5的高表達(dá)與胃癌的發(fā)生存在正相關(guān)［13］；同時(shí)， Zou等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，該項(xiàng)指標(biāo)可作為胃癌患者腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因子。之后，我們將BIRC5的表達(dá)與腫瘤的臨床病理特征進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，BIRC5高表達(dá)與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者OS具有顯著相關(guān)性，該結(jié)論與Krieg等［15］通過(guò)收集20個(gè)研究中共2 695名胃癌患者的臨床病理信息進(jìn)行數(shù)據(jù)分析所得的結(jié)論一致，說(shuō)明BIRC5的高表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良具有一定相關(guān)性。為了探究BIRC5與腫瘤增殖及凋亡的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)敲減的表達(dá)，檢測(cè)到BIRC5-sh組的細(xì)胞活力低于blank組和Ctr-sh組，而細(xì)胞凋亡率高于blank組和Ctr-sh組，結(jié)合細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的變化，表明BIRC5的激活可具有增強(qiáng)胃癌細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞凋亡的作用。據(jù)報(bào)道， BIRC5的表達(dá)與胃癌的血管形成具有密切關(guān)系，提示BIRC5促進(jìn)胃癌發(fā)生的作用機(jī)制可能與其促進(jìn)腫瘤新生血管生成作用機(jī)制相關(guān)： BIRC5表達(dá)上調(diào)后抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF），促進(jìn)微血管生成，為腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；與此同時(shí)，VEGF也可反饋促進(jìn)BIRC5的表達(dá)上調(diào)，二者協(xié)同促進(jìn)腫瘤的快速發(fā)展［16-17］。但本研究并未揭示BIRC5在胃癌組織中異常表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究以確定BIRC5確切的調(diào)控及作用機(jī)制，以改善胃癌的診療現(xiàn)狀。

綜上所述，本研究證實(shí)BIRC5在胃癌組織中的高表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡；高表達(dá)BIRC5的胃癌患者相較于低表達(dá)BIRC5的患者預(yù)后更差。因此，BIRC5的表達(dá)程度可作為判斷胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一，同時(shí)抑制BIRC5的活性在未來(lái)可能成為胃癌靶向治療的新方向。

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High expression of BIRC5 enhances cell viability, inhibits apoptosis and is associated with poor prognosis in gastric cancer

LI Xue-fei1， ZHANG Ding-ding2， DONG Dan-dan2， LING Chen3， SUN Huan-xin2， DU Qiu1

（1，，610000，；2，610054，；3，610000，）

To investigate the expression of baculoviral inhibitor of apoptosis protein repeat-containing protein 5 （BIRC5） in gastric cancer tissue and its relationship with prognosis of gastric cancer patients， and to explore the effect ofknock-down on the viability and apoptosis of gastric cancer cells.The expression of BIRC5 was detected by immunohistochemistry in 67 cases of gastric cancer tissues and paracancerous tissues for analyzing the relationships with clinicopathological characteristics. The mRNA and protein expression levels of BIRC5 in gastric carcinoma cell lines （AGS， MKN-1 and MGC-803） and normal gastric epithelial cell line GES-1 were detected by RT-qPCR and Western blot. The AGS cells were divided into blank group （no treatment）， Ctr-sh group （blank plasmid transfection） and BIRC5-sh group （BIRC5-shRNA plasmid transfection）. The interference efficiency of BIRC5-shRNA was evaluated by Western blot. The cell viability was measured by MTT assay， the apoptosis was analyzed by flow cytometry， and the levels of apoptosis-related proteins cleaved caspase-3， Bax and Bcl-2 were determined by Western blot.BIRC5 was mainly expressed in cytoplasm， and the positive expression rate of BIRC5 in the gastric cancer tissues was higher than that in the adjacent tissues （<0.01）. The positive rates of BIRC5 in the gastric cancer patients at TNM Ⅲ~Ⅳ stages and with lymph node metastasis were higher than those in the patients at TNM Ⅰ~Ⅱ stages and without lymph node metastasis， respectively （<0.05）. The survival time of the patients with positive BIRC5 expression was shorter than that of the patients with negative BIRC5 expression （=0.011 2）. The cell viability in BIRC5-sh group was lower than that in blank group and Ctr-sh group at time points of 48， 72 and 96 h. The apoptotic rate in BIRC5-sh group was increased compared with blank group and Ctr-sh group. The protein levels of cleaved caspase-3 and Bax in BIRC5-sh group were higher than those in blank group and Ctr-sh group， while the protein expression of Bcl-2 in BIRC5-sh group was lower than that in blank group and Ctr-sh group （<0.05）.High expression of BIRC5 in gastric cancer indicates poor prognosis. BIRC5 promotes the growth of gastric cancer cells and inhibits apoptosis.

BIRC5 protein； Gastric cancer； Cell viability； Apoptosis； Prognosis

R735.2； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.013

1000-4718（2020）11-2013-07

2020-04-24

2020-07-09

2016年四川省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題（No.16PJ019）

Tel: 18782982083； E-mail: lynnlclc@163.com

（責(zé)任編輯：余小慧，羅森）