黃思博， 孫月， 梁鈞澤， 高桂彬， 梁曉玲，鐘利葉， 方潤東， 汪洋△， 黃盛玲△

蛋白質(zhì)組學分析腎透明細胞癌中的乙?；鞍踪|(zhì)*

黃思博1， 孫月2， 梁鈞澤2， 高桂彬2， 梁曉玲2，鐘利葉2， 方潤東2， 汪洋2△， 黃盛玲1△

（1暨南大學附屬第一醫(yī)院，2暨南大學生命與健康工程研究院，廣東 廣州 510630）

為探究蛋白質(zhì)乙酰化在腎透明細胞癌（ccRCC）中的角色，本研究采用乙?；褞觳呗裕治鯿cRCC臨床組織樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，全面鑒定ccRCC相關(guān)的乙?；鞍?、乙?；稽c及差異表達蛋白，并分析其所參與的信號通路，為尋找臨床診斷的分子標志物及治療靶點提供信息。通過檢索ProteomeXchange質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，篩選8對ccRCC和癌旁組織樣本數(shù)據(jù)。通過不同的搜庫策略鑒定分析差異表達蛋白及乙?；鞍祝镁垲惙治?、GO富集分析、KEGG通路分析等生物信息學手段對差異蛋白進行深入探討，并應(yīng)用Western blot技術(shù)對3對ccRCC及癌旁組織中的蛋白乙?；竭M行驗證。本次質(zhì)譜數(shù)據(jù)挖掘，總共鑒定到464個差異蛋白，其中上調(diào)蛋白104個，下調(diào)蛋白360個。通過GO富集和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)蛋白主要參與了血管收縮、補體和凝血級聯(lián)系統(tǒng)、血小板激活等過程。另外，我們鑒定到乙?；鞍?03個，包含乙?；稽c1 397個，與癌旁組織相比， 8組ccRCC組織中的蛋白乙?；骄@著下調(diào)。Western blot實驗確證ccRCC組織中的乙?；鞍姿捷^癌旁組織顯著減少。從乙?；|(zhì)譜鑒定結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶κ1 （GSTK1）蛋白的K158、K163和K165位點乙?；皆赾cRCC中顯著下降。補體與凝血級聯(lián)、血管收縮、血小板激活等相關(guān)蛋白可能參與ccRCC的發(fā)生發(fā)展過程。ccRCC中蛋白的乙酰化水平總體下降，其中GSTK1的去乙?；赡苁莄cRCC惡性進程的關(guān)鍵分子事件，有作為潛在的臨床生物標志物的可能性。

腎透明細胞癌；定量乙?；鞍踪|(zhì)組學；谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶κ1

腎細胞癌（renal cell carcinoma， RCC）簡稱腎癌，是全球十大癌癥之一，其發(fā)病率占全球癌癥總數(shù)的2%，且呈逐年上升的趨勢［1］。根據(jù)起源于腎小管的部位不同，腎癌可分為多種組織學亞型，其中起源于近端腎小管細胞的腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma， ccRCC）是最常見的腎癌，也是所有泌尿生殖系統(tǒng)癌癥中惡性程度最高的腫瘤［2］。在初診病例中，約30%的ccRCC已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，且發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后較差，平均5年存活率僅有10%［3］。ccRCC由于早期臨床表現(xiàn)隱匿、早期診斷困難，缺乏有效的腫瘤標志物，且對放化療不敏感，因此，越來越多的研究關(guān)注于探索ccRCC診療的關(guān)鍵分子。目前， ccRCC的分子標志物主要有低氧誘導(dǎo)因子1 （hypoxia-inducible factor-1， HIF-1）、p53、程序性死亡蛋白4 （programmed cell death 4， PDCD4）及CD分子等［4］。但由于一些分子標志物具有局限性，不能廣泛應(yīng)用于臨床，因此挖掘高準確度和高靈敏度的分子標志物，有助于為ccRCC的臨床診療提供全新的方案。

乙酰化修飾是生物體內(nèi)廣泛存在的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾（post-translational modification， PTM）類型，參與調(diào)控表觀遺傳、細胞代謝、細胞應(yīng)激等過程，并在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。越來越多的研究表明，蛋白質(zhì)的乙?；娇梢宰鳛榕R床診療的新型分子標志物。目前，關(guān)于ccRCC的乙?；芯恐饕性诮M蛋白及p53參與的乙?；^程［5］，缺少大規(guī)模全局性的乙?；鞍踪|(zhì)組研究。因此，深入研究參與ccRCC惡性進展過程的乙?；鞍鬃兓闆r將有助于為ccRCC分子標志物的開發(fā)提供重要線索。

近年來，隨著高通量質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學成為了研究癌癥等疾病的重要方法。通過定量蛋白質(zhì)組學，我們能夠比較細胞或組織在不同生理或病理條件下蛋白質(zhì)表達的異同，并對差異蛋白質(zhì)進行分類和鑒定［6-7］。其中，非標記（label-free）定量蛋白質(zhì)組學能夠通過肽段的質(zhì)譜計數(shù)或色譜積分面積來得到肽的信號強度，進而獲得肽段和蛋白質(zhì)的定量信息。該技術(shù)不需要對樣本進行同位素標記，可廣泛運用在臨床病例組織的蛋白鑒定中［8］。因此，利用非標記定量蛋白質(zhì)組學能夠通過比較差異蛋白來區(qū)分ccRCC和癌旁組織間的差異，有望找到新的ccRCC診療分子標志物。在本研究中，我們利用基于非標記定量蛋白質(zhì)組學的方法，針對ccRCC及癌旁組織的組學數(shù)據(jù)展開乙酰化搜庫，通過生物信息學方法分析差異蛋白及發(fā)生乙?；揎椀牡鞍?，以探究ccRCC惡性進展的生物學過程，并發(fā)現(xiàn)ccRCC新的分子標志物。

材料和方法

1　數(shù)據(jù)的選擇與臨床標本

在ProteomeXchange蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫中搜索“kidney cancer”，以為研究對象，以ccRCC為單一類型，臨床ccRCC和癌旁組織作為直接樣本，采用非標記定量方法進行質(zhì)譜鑒定，尋找數(shù)據(jù)。其中，編號為PXD011681的蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)較為符合（https：//www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD011681），下載原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)RAW文件。

收集2019年12月~2020年4月在暨南大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科手術(shù)的患者ccRCC新鮮組織標本及相對應(yīng)的癌旁組織標本6對，其中男4例，女2例，年齡43~75歲，平均55.2歲。所獲得的ccRCC和癌旁組織均經(jīng)過病理診斷而確診，見圖1。本研究方案經(jīng)過暨南大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，術(shù)前患者均簽署了知情同意書。

Figure1.　Pathological changes of ccRCC and paracancerous tissues （HE staining, ×100）.

2　方法

2.1質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜庫

2.1.1全蛋白搜庫分析用質(zhì)譜搜庫軟件Proteome Didcoverer 2.1 （Thermo Fisher Scientific）對RAW文件進行數(shù)據(jù)檢索，使用UniProt人類蛋白數(shù)據(jù)庫（2019年12月下載自https：//www.uniprot.org），參數(shù)設(shè)置：母離子偏差為10 ppm；子離子偏差為0.5 Da；以半胱氨酸的酰胺甲基化為固定修飾，蛋氨酸的氧化為可變修飾，容錯率設(shè)置為1%。

2.1.2乙?；鞍姿褞旆治鲈谏鲜鋈鞍姿褞斓幕A(chǔ)上，加上賴氨酸乙酰化作為可變修飾，并進行搜庫比對分析。

2.2數(shù)據(jù)處理及繪圖首先對質(zhì)譜定量結(jié)果進行分數(shù)標準化，然后刪除定量缺失數(shù)據(jù)，并對數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2變換及z-score歸一化處理，繪制聚類分析熱圖。采用PLEGM （power law global error model）分析數(shù)據(jù)可信度并繪制火山圖，對<0.05的數(shù)據(jù)進行下一步分析；將差異倍數(shù)>1.5且<0.05定義為上調(diào)蛋白，差異倍數(shù)<0.67且<0.05定義為下調(diào)蛋白。

2.3GO富集及KEGG通路分析使用Cytoscape 3.7.2軟件中的clueGO程序?qū)Σ町惖鞍走M行GO富集及KEGG通路分析。其中， GO富集包括了生物學過程（biological process， BP）和分子功能（molecular function， MF）分析。采用已有實驗數(shù)據(jù)為檢索源，僅展示<0.01的分子通路。

2.4Western blot驗證取備用的ccRCC和癌旁組織，用PBS洗凈后剪碎，在SDS裂解液（Beyotime）中裂解30 min，分別用勻漿儀和超聲波細胞粉碎機打散并研磨組織， 4℃、12 000 r/min離心30 min后提取上清液；用BCA試劑盒（Thermo Fisher Scientific）進行濃度測定，分別取20 μg蛋白在10% SDS-PAGE凝膠中分離1 h，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜（BIO-RAD）上；轉(zhuǎn)膜成功后，用5%脫脂牛奶封閉1 h，洗膜后加入Ⅰ抗（乙酰化賴氨酸抗體， 1∶1 000稀釋；購自杭州景杰生物科技有限公司）孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min；孵育鼠Ⅱ抗（IgG， 1∶5 000稀釋； Proteintech）1 h， TBST洗滌3次，每次5 min，加入ECL試劑（BIO-RAD）顯影。利用ImageJ軟件進行Western blot條帶灰度值計算，將目的蛋白灰度值除以內(nèi)參照的灰度值，以校正誤差，所得結(jié)果即為目的蛋白相對含量。

3　統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.1軟件進行統(tǒng)計學分析。首先進行方差齊性檢驗，當方差齊時，兩組間比較采用Student's檢驗，當方差不齊時，采用校正檢驗。GO富集和KEGG通路分析差異蛋白數(shù)據(jù)均使用Fischer精確檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1　全蛋白組數(shù)據(jù)處理及分析

在ProteomeXchange質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中，數(shù)據(jù)集PXD011681包含8對ccRCC和癌旁組織的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，我們針對該數(shù)據(jù)集進行重搜庫分析，先進行全蛋白組搜庫，再以賴氨酸乙酰化為可變修飾進行乙?；鞍捉M搜庫，具體流程圖如圖2所示。

Figure 2.　Flow chart for the study design.

在8組ccRCC與癌旁組織樣本的全蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中總共鑒定到6 572個蛋白，進一步將8組標志物與癌旁分別鑒定到的共同蛋白進行交集分析，發(fā)現(xiàn)其中有1 290個是ccRCC與癌旁組織共同鑒定到的蛋白（圖3A）。我們進一步對數(shù)據(jù)進行z-score歸一化處理，利用R語言繪制聚類熱圖（圖3B），圖中表明ccRCC與癌旁組織具有較明顯的差異特征。為了分析差異表達蛋白，我們利用PLGEM算法對共同鑒定到的蛋白進行可信度分析（圖3C~F），結(jié)果提示數(shù)據(jù)質(zhì)量較好（=0.996），可進行下一步分析。

Figure 3.　The comparison of protein expression changes in ccRCC and paracancerous tissues. A: Venn diagram showing the identification of overlapped proteins in ccRCC and paracancerous tissues; B: heat map showing the overview of protein expression among 8 pairs of ccRCC and paracancerous tissues; C~F: the overlapped proteins were subjected to a power law global error model (PLGEM) algorithm, including PLGEM ?tting of the abundance of ccRCC proteins (C), residual distribution along with the rank of mean abundance (D), histogram of residuals of identified proteins (E), and Q-Q plot of the residuals versus standard normal (F).

我們根據(jù)PLGEM算法所計算出的值及差異變化倍數(shù)進行火山圖分析（圖4A），鑒定差異蛋白。共篩選到了464個差異蛋白，其中上調(diào)蛋白104個，下調(diào)蛋白360個。將104個上調(diào)蛋白進行GO生物學過程富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要與血管收縮（positive regulation of vasoconstriction）、外部刺激的負調(diào)控（negative regulation of response to external stimulus）、糖原代謝（glycogen metabolic process）、細胞外基質(zhì)組成（extracellular matrix organization）、肽交聯(lián)（peptide cross-linking）等相關(guān)（圖4B）。KEGG通路分析顯示，上調(diào)蛋白主要富集在胰高血糖素信號通路（glucagon signaling pathway）、ECM受體相互作用（ECM-receptor interaction）、補體和凝血級聯(lián)（complement and coagulation cascades）、血小板激活（platelet activation）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）五大通路（圖4C）。其中，補體和凝血級聯(lián)、血小板激活及血管收縮過程均與凝血系統(tǒng)相關(guān)，說明凝血系統(tǒng)相關(guān)蛋白的紊亂調(diào)節(jié)很可能是ccRCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。

Figure 4.　Screening and enrichment analysis of differentially expressed proteins (DEPs). A: volcano plot showing the DEPs in ccRCC, where red represents the up-regulated proteins, and blue represents the down-regulated proteins; B: the 104 up-regulated DEPs were subjected to GO analysis using Cytoscape software; C: the 104 up-regulated DEPs were subjected to KEGG pathways analysis using Cytoscape software.

此外，我們還發(fā)現(xiàn)，顯著上調(diào)的纖維蛋白原γ鏈（fibrinogen gamma chain， FGG）、纖維蛋白原β鏈（fibrinogen beta chain， FGB）和纖維蛋白原α鏈（fibrinogen alpha chain， FGA）同時參與血管收縮、補體和凝血級聯(lián)及血小板激活3個過程（表1）。

表1　在血管收縮、補體和凝血級聯(lián)及血小板激活過程中共同鑒定到的3個蛋白質(zhì)

2　乙酰化蛋白組數(shù)據(jù)處理及分析

2.1乙?；鞍椎蔫b定為了深入探討ccRCC的乙酰化差異表達譜，我們采用非富集法對乙?；鞍走M行鑒定，即是在最大程度保留原始數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，通過改變搜庫策略，針對賴氨酸位點的乙?；揎?，進行乙?；|(zhì)譜搜庫。該舉措不僅可以提高質(zhì)譜圖譜的利用率，也可為探索乙?；町愄峁┬碌姆椒ā１敬我阴；鞍椎乃褞熘?，共鑒定到503個乙?；鞍?，含1 397個乙?；稽c。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，ccRCC組織中乙酰化蛋白量顯著下調(diào)（圖5A），說明蛋白的整體乙酰化水平下調(diào)，可能在ccRCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

2.2Western blot驗證在ccRCC中蛋白總體的乙?；较抡{(diào)為了驗證乙酰化質(zhì)譜搜庫結(jié)果，我們選取6對ccRCC和癌旁新鮮樣本組織進行Western blot驗證。結(jié)果顯示，與癌旁組織比較， ccRCC組織中總體乙?；鞍姿斤@著下降（<0.05），與蛋白質(zhì)組學分析結(jié)果一致（圖5B）。以上結(jié)果說明ccRCC中蛋白質(zhì)乙?；较抡{(diào)。這一發(fā)現(xiàn)可能為ccRCC診斷和治療提供新的方向與思路。

Figure 5.　Proteomics analysis of acetylation level and Western blot verification. A: comparison of acetylated proteins identified in 8 pairs of ccRCC and paracancerous tissues; B: the expression of acetylated proteins in ccRCC and paracancerous tissues verified by Western blot. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs paracance group.

2.3乙?；鞍椎腉O分析接下來我們從質(zhì)譜列表中，挑選乙?；鞍阻b定數(shù)最多的3對樣本進行下一步分析。在這3對數(shù)據(jù)中，共同鑒定到25個蛋白發(fā)生乙酰化修飾（圖6A），詳細信息見表2。GO生物學過程富集分析結(jié)果顯示，這25個蛋白主要與核糖體組裝和氧化還原酶活性相關(guān)（圖6B）。其中我們關(guān)注到了下調(diào)變化最明顯的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶κ1 （glutathione-transferase kappa 1， GSTK1）蛋白，其K158、K163和K165位點乙?；皆诎┡越M織中較高，而在ccRCC組織中乙酰化水平明顯下降（圖6C）。這說明該蛋白乙酰化水平的變化很可能成為診斷ccRCC的標志。

Figure 6.　Enrichment analysis of acetylated proteins. A: Venn diagram showing the identification of overlapped proteins in 3 pairs of ccRCC and paracancerous tissues (#39, #44 and #53); B: the 25 acetylated proteins were subjected to GO analysis using Cytoscape software; C: the acetylation level of glutathione S-transferase kappa 1 (GSTK1) in 3 pairs of ccRCC and paracancerous tissues (#39, #44 and #53).

表2　共同鑒定到的25個乙酰化蛋白列表

討論

ccRCC是腎癌中最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升且趨于年輕化，嚴重威脅患者的生命健康，但目前對其發(fā)生、發(fā)展的分子機制尚未完全闡明，使臨床診斷與治療受到很大的限制，因此探究腎癌診斷的分子指標及治療靶點迫在眉睫。本文通過對ccRCC臨床組織樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行挖掘分析，并利用生物信息學方法分析差異蛋白及差異乙?；鞍?，探究ccRCC的發(fā)病機理，以期發(fā)現(xiàn)ccRCC新的診療分子標志物。在本研究中，我們通過ProteomeXchange蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫，尋找到一組較為充分的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)以ccRCC臨床樣本為研究對象，對其進行了非標記定量蛋白質(zhì)組學鑒定。本研究通過對該組質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行重搜庫分析，比較了ccRCC與癌旁組織中蛋白質(zhì)表達譜及乙?；磉_譜的差異情況。在全蛋白水平上發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的蛋白主要與血管收縮、外界刺激的負調(diào)控、糖原代謝、細胞外基質(zhì)組成、肽交聯(lián)等相關(guān)。其中，與血管收縮過程相關(guān)蛋白所占比例達到了54.55%，說明了血管收縮相關(guān)蛋白在ccRCC的惡性進程扮演重要角色。另外， KEGG通路分析顯示， ccRCC組織中上調(diào)的蛋白主要富集在胰高血糖素信號通路、ECM受體相互作用、補體和凝血級聯(lián)、血小板激活、淀粉和蔗糖代謝五大通路。以上結(jié)果意味著，參與血管收縮、補體和凝血級聯(lián)及血小板激活的蛋白表達上調(diào)，可能在ccRCC惡性轉(zhuǎn)化中扮演重要角色。

凝血級聯(lián)反應(yīng)是一系列鈣依賴性的酶原-絲氨酸蛋白酶協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)化而最終形成凝血酶的過程［9］。在此過程中，凝血酶將可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性纖維蛋白網(wǎng)，從而發(fā)揮其凝血功能［10］。補體，即抗體發(fā)揮作用的必要補充條件，是機體固有免疫系統(tǒng)的重要輔助效應(yīng)體系［11］，補體作用因子可以直接增強凝血效應(yīng)。而凝血酶同樣能夠激活G蛋白偶聯(lián)受體，作為先天免疫的介質(zhì)起作用。有報道稱，在多種惡性腫瘤中，機體的免疫系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)均會產(chǎn)生異常［12］，凝血系統(tǒng)影響了腎細胞癌的轉(zhuǎn)移［13］。本研究中，我們從分子水平鑒定到補體和凝血級聯(lián)過程與ccRCC相關(guān)， ccRCC的發(fā)生伴有補體及凝血級聯(lián)的蛋白上調(diào)。同時我們發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)的FGG、FGB和FGA蛋白均參與血管收縮、補體和凝血級聯(lián)及血小板激活3個過程， FGG、FGB和FGA這3個蛋白復(fù)合物結(jié)合形成功能性纖維蛋白原。因此，我們推斷，F(xiàn)GG、FGB和FGA參與調(diào)控了ccRCC的補體與凝血級聯(lián)過程，導(dǎo)致血小板過度激活，影響了血管收縮過程，進而導(dǎo)致凝血系統(tǒng)過度激活，血液黏度升高促使血栓形成，從而促進了癌栓及ccRCC的轉(zhuǎn)移。

可逆的賴氨酸乙?；揎椖軌蚓_地調(diào)控胞內(nèi)各種代謝路徑，而蛋白乙酰化修飾異常與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［14］。近年來隨著高通量質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，可實現(xiàn)對乙?；鞍踪|(zhì)大規(guī)模定性定量分析。本研究通過對數(shù)據(jù)進行乙?；鞍姿褞?，總共鑒定到了503個乙?；鞍?，有趣的是， ccRCC樣本中的乙?；鞍讛?shù)量遠低于癌旁組織。同時我們應(yīng)用Western blot檢驗乙?；鞍自赾cRCC中表達水平，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學分析結(jié)果一致，提示本蛋白質(zhì)組學分析結(jié)果是可靠的，共同說明了蛋白質(zhì)的乙?；较抡{(diào)很可能影響了ccRCC的發(fā)生發(fā)展過程。

我們將乙?；鞍阻b定數(shù)最多的3對樣本進行了比較，發(fā)現(xiàn)有25個乙?；鞍妆还餐b定到。其中我們發(fā)現(xiàn)GSTK1蛋白的乙?；皆赾cRCC中下調(diào)最為明顯。GSTK1是GST超家族中線粒體型GST家族的代表成員，位于谷胱甘肽過氧化物酶體中，催化谷胱甘肽與多種疏水性物質(zhì)的結(jié)合，有助于從細胞中去除這些化合物。目前研究發(fā)現(xiàn)GSTK1參與多種腫瘤疾病，其中有研究表明GSTK1通過調(diào)控有絲分裂來調(diào)控luminal B型乳腺癌的發(fā)生發(fā)展［15］；另外，有研究表明GSTK1的高表達與白血病及乳腺癌等腫瘤的耐藥性相關(guān)［16］。目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于GSTK1與腎癌相關(guān)的研究，而本文經(jīng)過乙?；褞旒皵?shù)據(jù)整理，發(fā)現(xiàn)GSTK1的乙?；脚cccRCC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，推測GSTK1乙?；兓赡芘cccRCC預(yù)后密切相關(guān)。因此， GSTK1的乙?；较陆祷蛟S將成為診斷ccRCC有效的檢測方法及潛在治療靶點。

綜上所述，本研究通過對ccRCC臨床組織樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行挖掘，采用全蛋白搜庫聯(lián)合乙?；鞍姿褞觳呗裕l(fā)現(xiàn)補體與凝血級聯(lián)、血管收縮及血小板激活等相關(guān)蛋白參與ccRCC的發(fā)生發(fā)展過程，ccRCC中蛋白的乙酰化水平總體下降，其中GSTK1蛋白的去乙?；赡苁莄cRCC惡性進程的關(guān)鍵分子事件。以上結(jié)果為解析ccRCC發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找ccRCC臨床診斷的分子標志物及治療靶點提供了參考。

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Proteomics analysis of acetylated protein in clear cell renal cell carcinoma

HUANG Si-bo1， SUN Yue2， LIANG Jun-ze2， GAO Gui-bin2， LIANG Xiao-ling2， ZHONG Li-ye2， FANG Run-dong2， WANG Yang2， HUANG Sheng-ling1

（1，2，，510630，）

To comprehensively analyze clear cell renal cell carcinoma （ccRCC）-associated acetylated proteins， acetylation sites and differentially expressed proteins （DEPs）， and to identify potential molecular markers and therapeutic targets for clinical application.The open search strategy was applied to re-analyze the mass spectrometric data of ccRCC clinical tissue samples including 8 pairs of cancer and paracancerous tissues. Mass spectrometric data of ccRCC containing 8 pairs of cancer and paracancerous tissues were downloaded from ProteomeXchange proteomics database， and subjected to database searching for the identification of acetylated proteins and acetylation sites. The DEPs were analyzed by power law global error model （PLGEM） algorithm and uploaded to cluster analysis， GO enrichment and KEGG pathway analysis. The expression of acetylated proteins was verified by Western blot using specific lysine acetylation antibody.A total of 464 DEPs were identified by non-labeled quantitative proteomics， including 104 up-regulated and 360 down-regulated proteins. The GO enrichment and KEGG pathway analysis showed that the up-regulated proteins were mainly involved in the processes of vasoconstriction， complement and coagulation cascade system， and platelet activation. More importantly， a total of 503 acetylated proteins including 1 397 acetylation sites were identified. We found that the protein acetylation level in ccRCC was significantly down-regulated as compared with paracancerous tissues， which was verified by Western blot analysis. We also found that the acetylation levels of glutathione-transferase kappa 1 （GSTK1） at sites K158， K163 and K165 were decreased in ccRCC as compared with paracancerous tissues.The proteins involved in complement and coagulation cascade， vasoconstriction and platelet activation may play an important role in ccRCC malignant progression. The total acetylation level was significantly decreased in ccRCC tissues， suggesting an overall suppression of acetylation in renal cancer. Deacetylation of GSTK1 is likely a key molecular event in the renal malignant progression and a potential clinical biomarker.

Clear cell renal cell carcinoma； Quantitative acetylproteomics； Glutathione-transferase kappa 1

R737.11； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.011

1000-4718（2020）11-1996-09

2020-05-11

2020-07-09

廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金自然科學基金項目-面上項目（No.2019A1515010196）

汪洋 Tel： 13570904008； E-mail： 373506762@qq.com; 黃盛玲 Tel： 020-38688228； E-mail： huangshengling@126.com

（責任編輯：宋延君，羅森）