李彎， 高瑞蘭， 余瀟苓， 尹利明， 唐比強(qiáng)， 蘭高琛， 蘭金劍， 趙燕娜

低極性人參皂苷F4抑制SHI-1和K562白血病細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)分化的研究*

李彎， 高瑞蘭， 余瀟苓， 尹利明， 唐比強(qiáng)， 蘭高琛， 蘭金劍， 趙燕娜△

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

觀察低極性人參皂苷F4（F4）抑制人單核系白血病細(xì)胞SHI-1和紅系白血病細(xì)胞K562增殖及誘導(dǎo)分化的作用。以不同濃度（0、40、80和120 mg/L）的F4處理SHI-1和K562細(xì)胞， MTT比色法和半固體集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)F4對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用；瑞氏-吉姆薩染色法觀察細(xì)胞趨向分化的形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光法檢測(cè)分化相關(guān)抗原CD11b和CD14陽(yáng)性表達(dá)率及其熒光反應(yīng)強(qiáng)度；免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot法分析SHI-1細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PU.1和K562細(xì)胞紅系分化相關(guān)GATA-1和γ-globin的蛋白表達(dá)水平； RT-qPCR法檢測(cè)PU.1和GATA-1的mRNA表達(dá)變化。與對(duì)照（0 mg/L）組比較， F4能夠抑制SHI-1和K562細(xì)胞增殖（<0.01），誘導(dǎo)白血病細(xì)胞趨向分化，表現(xiàn)為細(xì)胞核/質(zhì)比縮小，染色質(zhì)粗糙，核仁減少，可見(jiàn)空泡， SHI-1細(xì)胞核有扭曲。SHI-1細(xì)胞CD11b和K562細(xì)胞CD14陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高（<0.01），且免疫熒光反應(yīng)從弱陽(yáng)性轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)陽(yáng)性；但SHI-1細(xì)胞CD14和K562細(xì)胞CD11b陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)顯著變化。同時(shí)， F4上調(diào)PU.1和GATA-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平及γ-globin的蛋白表達(dá)水平（<0.05）。低極性人參皂苷F4具有抑制SHI-1和K562白血病細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)分化的抗白血病作用，其作用可通過(guò)調(diào)控分化相關(guān)PU.1、GATA-1和γ-globin的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

低極性人參皂苷F4；SHI-1細(xì)胞；K562細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞分化

髓系白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，惡性增殖和分化阻滯是其主要的發(fā)病機(jī)理。目前雖然運(yùn)用全反式維甲酸誘導(dǎo)分化治療取得了顯著的療效，但是其僅對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病有效，還會(huì)出現(xiàn)分化綜合征等致命副作用及耐藥等問(wèn)題。因此，尋找低毒高效的天然藥物逐漸成為研究的熱點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷具有抑制白血病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化的作用［1-4］，其作用的有效成分尚不明確。有研究報(bào)道，低極性人參皂苷F4（F4）具有一定的抗腫瘤作用，且其對(duì)正常細(xì)胞無(wú)不良作用，是相對(duì)安全和有效的藥物［5］。Chen等［6］顯示F4能夠抑制人淋巴細(xì)胞瘤JK細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，但是其對(duì)髓系白血病細(xì)胞的作用尚不明確。本項(xiàng)工作采用F4處理髓系白血病SHI-1和K562細(xì)胞，探討F4抑制白血病細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)分化的作用，為其深入研究及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1　實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及藥物

人單核系SHI-1白血病細(xì)胞由江蘇省血液病研究所陳子興教授惠贈(zèng)，紅系K562白血病細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液病研究所保存。人參皂苷F4購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，經(jīng)核磁共振譜、質(zhì)譜、紅外光譜和紫外吸收光譜鑒定其結(jié)構(gòu)，純度>98%，分子式為C42H70O12，分子量為767.01。

2　主要試劑

IMDM培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco；新生牛血清購(gòu)自杭州四季青公司； PE-CD11b抗體和FITC-CD14抗體購(gòu)自BD Pharmingen； GATA-1和PU.1抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology； γ-globin抗體購(gòu)自Santa Cruz；內(nèi)參照β-actin抗體購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司； RT-qPCR試劑盒購(gòu)自艾德萊生物科技有限公司； PCR引物由聯(lián)川生物技術(shù)有限公司合成。

3　主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)將SHI-1和K562細(xì)胞分別培養(yǎng)于含15%和10%新生牛血清的IMDM完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，隔天換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2MTT比色法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SHI-1和K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×108/L，接種于96孔培養(yǎng)板，分別加入不同濃度的F4，每孔2×104個(gè)細(xì)胞（200 μL），重復(fù)6孔。F4終濃度分別為0、40、80和120 mg/L。上述培養(yǎng)體系置37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，加入5 g/L的MTT溶液20 μL，孵育4 h。離心去上清，每孔加入150 μL DMSO，微量振蕩器振蕩5 min，使結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度（）值，計(jì)算F4對(duì)各組細(xì)胞活力的抑制率（%）=（對(duì)照組值-實(shí)驗(yàn)組值）/對(duì)照組值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

3.3半固體集落形成實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)并調(diào)整SHI-1和K562細(xì)胞懸液濃度為5×106/L，進(jìn)行半固體集落培養(yǎng)，分別加入不同濃度的F4，使F4終濃度為0、40、80和120 mg/L。培養(yǎng)體系為IMDM培養(yǎng)液、30%新生牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 U青/鏈霉素和0.3%瓊脂，每孔2.5×102細(xì)胞（0.5 mL），接種于24孔培養(yǎng)板，重復(fù)3孔。上述培養(yǎng)體系置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)白血病細(xì)胞集落數(shù)（≥40個(gè)細(xì)胞），計(jì)算F4對(duì)各組細(xì)胞的抑制率（%）=（對(duì)照組集落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組集落數(shù)）/對(duì)照組集落數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

3.4瑞氏-吉姆薩染色法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SHI-1和K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×108/L，接種于6孔培養(yǎng)板，分別加入不同濃度的F4，使F4終濃度為0、40、80和120 mg/L。上述培養(yǎng)體系置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。收集細(xì)胞懸液，經(jīng)離心涂片機(jī)71×離心甩片5 min，制成細(xì)胞涂片。常規(guī)瑞氏-吉姆薩染色，油鏡下放大1 000倍觀察細(xì)胞形態(tài)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.5流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光法用0、40、80和120 mg/L的F4分別處理SHI-1和K562細(xì)胞7 d，收集細(xì)胞，PBS洗滌，分別加入PE標(biāo)記的CD11b和FITC標(biāo)記的CD14單克隆抗體，室溫孵育30 min，PBS洗去未結(jié)合的抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞率，每個(gè)標(biāo)本檢測(cè)記錄10 000個(gè)細(xì)胞。DIVA軟件作陽(yáng)性率的分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。免疫熒光法的細(xì)胞處理與抗體標(biāo)記方法同上，標(biāo)記熒光抗體的細(xì)胞經(jīng)離心涂片機(jī)71×離心甩片5 min，制成細(xì)胞涂片，熒光顯微鏡放大630倍觀察細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.6免疫細(xì)胞化學(xué)法用0、40、80和120 mg/L的F4分別處理SHI-1和K562細(xì)胞7 d，收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液經(jīng)離心涂片機(jī)71×離心甩片5 min，制成細(xì)胞涂片，4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100破膜。SHI-1細(xì)胞加I抗PU.1， K562細(xì)胞加Ⅰ抗GATA-1和γ-globin，置于4℃濕盒孵育過(guò)夜，加Ⅱ抗工作液， 37℃孵育30 min，DAB顯色10 min。PU.1和GATA-1用蘇木精復(fù)染， γ-globin用甲基綠復(fù)染。中性樹(shù)脂封片，放大1 000倍油鏡下觀察出現(xiàn)褐色反應(yīng)的陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性程度判斷標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)褐色反應(yīng)為“-”；褐色淺淡成云絮狀為“+”；深褐色凝塊狀為“+++”；介于兩者之間為“++”。隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算不同陽(yáng)性程度細(xì)胞的百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.7Western blot法用0、40、80和120 mg/L的F4分別處理SHI-1和K562細(xì)胞7 d，收集細(xì)胞，加入裂解液提取細(xì)胞總蛋白。每孔40 μg總蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分離，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至NC膜上，室溫下用5% BSA封閉1 h， SHI-1細(xì)胞加PU.1抗體， K562細(xì)胞加GATA-1和γ-globin抗體， 4℃孵育過(guò)夜，加II抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光劑顯影。采用灰度掃描系統(tǒng)測(cè)定并分析目的條帶蛋白。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.8RT-qPCR法用0、40、80和120 mg/L的F4分別處理SHI-1和K562細(xì)胞3 d，收集細(xì)胞，按Trizol試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別采用特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5'-CATCAAGGAGAAACTGTGT-5'，下游引物序列為5'-AGGCAACTCGTAACTCTT-3'； PU.1的上游引物序列為5'-CCATAGCGACCATTACTG-3'，下游引物序列為5'-CTCCGTGAAGTTGTTCTC-3'； GATA-1的上游引物序列為5'-CCTCTATCACAAGATGAATGG-3'，下游引物序列為5'-GCCCGTTTACTGACAATC-3'。PCR擴(kuò)增條件為： 95℃ 3 min； 95℃ 10 s， 60℃ 30 s， 39個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　F4抑制SHI-1和K562細(xì)胞增殖

MTT比色法結(jié)果顯示， F4分別處理SHI-1和K562細(xì)胞72 h后， 40、80和120 mg/L組的值顯著低于0 mg/L組（<0.01）， IC50分別為（132.6±19.0） mg/L和（101.1±7.8） mg/L，見(jiàn)表1。

表1　MTT法檢測(cè)不同濃度F4對(duì)SHI-1和K562細(xì)胞活力的抑制作用

**<0.010 mg/L group.

半固體集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， F4分別處理SHI-1和K562細(xì)胞7 d后， 80和120 mg/L組的集落內(nèi)細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯減少，多為細(xì)胞叢或單個(gè)細(xì)胞，見(jiàn)圖1； 40、80和120 mg/L組的集落數(shù)顯著低于0 mg/L組（<0.01）， IC50分別為（89.5±14.0） mg/L和（64.2±8.9） mg/L，見(jiàn)表2。

Figure 1.　The numbers of cells in SHI-1 and K562 cell colonies were reduced by F4. The arrows indicate clusters or individual cells. A: control group; B: 40 mg/L F4 group; C: 80 mg/L F4 group; D: 120 mg/L F4 group. The scale bar=100 μm.

表2　集落形成實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度F4對(duì)SHI-1和K562細(xì)胞增殖的抑制作用

**<0.010 mg/L group.

綜合參照以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中F4的IC50，我們將40、80和120 mg/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中F4的低、中、高濃度。

2　誘導(dǎo)SHI-1和K562細(xì)胞趨向分化的形態(tài)學(xué)

結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的升高，SHI-1和K562細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的核/質(zhì)比例縮小，染色質(zhì)粗糙，核仁減少，可見(jiàn)空泡，SHI-1細(xì)胞核有扭曲或折疊，見(jiàn)圖2。

Figure 2.　The morphological changes of SHI-1 and K562 cells with differentiation tendency induced by F4. The arrows indicate lower nucleus/cytoplasm ratio and the SHI-1 cells with broad-bean shaped nuclei. A: control group; B: 40 mg/L F4 group; C: 80 mg/L F4 group; D:120 mg/L F4 group. The scale bar=20 μm.

3　細(xì)胞表面分化相關(guān)抗原陽(yáng)性表達(dá)率顯著增加

流式細(xì)胞術(shù)顯示，隨著藥物濃度的升高，SHI-1細(xì)胞表面標(biāo)記CD11b和K562細(xì)胞表面標(biāo)記CD14的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于對(duì)照組（<0.01），而SHI-1細(xì)胞表面標(biāo)記CD14和K562細(xì)胞表面標(biāo)記CD11b陽(yáng)性表達(dá)率沒(méi)有顯著變化，見(jiàn)圖3。免疫熒光法的結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致，隨著藥物濃度的升高，SHI-1細(xì)胞表面標(biāo)記CD11b和K562細(xì)胞表面標(biāo)記CD14的熒光程度逐漸增強(qiáng)，見(jiàn)圖4。

Figure 3.　Expression of CD11b in SHI-1 cells and CD14 in K562 cells detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3. **P<0.01vs control group．

Figure 4.　The fluorescence intensity of CD11b in SHI-1 cells and CD14 in K562 cells observed by immunofluorescence method. A: control group; B: 40 mg/L F4 group; C: 80 mg/L F4 group; D: 120 mg/L F4 group. The scale bar=32 μm.

4　F4上調(diào)細(xì)胞分化相關(guān)蛋白的表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的升高， F4能夠上調(diào)SHI-1細(xì)胞中PU.1及K562細(xì)胞中GATA-1和γ-globin的蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖5、6。

Figure 5.　The protein expression of PU.1 in SHI-1 cells was detected by immunocytochemistry. A: control group; B: 40 mg/L F4 group; C: 80 mg/L F4 group; D: 120 mg/L F4 group. The scale bar=20 μm.

Figure 6.　The protein expression of GATA-1 and γ-globin in K562 cells was detected by immunocytochemistry. A: control group; B: 40 mg/L F4 group; C: 80 mg/L F4 group; D: 120 mg/L F4 group. The scale bar=20 μm.

經(jīng)40、80和120 mg/L的F4處理， SHI-1細(xì)胞表達(dá)PU.1蛋白強(qiáng)陽(yáng)性（“+++”）率顯著高于對(duì)照組（<0.05或<0.01），見(jiàn)表3； K562細(xì)胞表達(dá)GATA-1和γ-globin蛋白強(qiáng)陽(yáng)性（“+++”）率顯著高于對(duì)照組（<0.05或<0.01），見(jiàn)表4。

表3　F4誘導(dǎo)SHI-1細(xì)胞上調(diào)PU.1蛋白的表達(dá)

*<0.05,**<0.010 mg/L group.

表4　F4誘導(dǎo)K562細(xì)胞上調(diào)GATA-1和γ-globin蛋白的表達(dá)

*<0.05,**<0.010 mg/L group.

Western blot分析結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果一致， F4處理后SHI-1細(xì)胞表達(dá)PU.1及K562細(xì)胞表達(dá)GATA-1和γ-globin的特異性條帶灰度值顯著高于對(duì)照組（<0.05或<0.01），見(jiàn)圖7。

Figure 7.　The protein expression of PU.1 in SHI-1 cells and GATA-1 and γ-globin in K562 cells was analyzed by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

5　F4上調(diào)細(xì)胞分化相關(guān)mRNA的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比， 40、80和120 mg/L組SHI-1細(xì)胞PU.1和K562細(xì)胞GATA-1的mRNA顯著上調(diào)（<0.05或<0.01），見(jiàn)圖8。

Figure 8.　The mRNA expression of PU.1 in SHI-1 cells and GATA-1 in K562 cells was detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

討論

近年來(lái)低極性人參皂苷的生物學(xué)活性研究取得了很大進(jìn)展，在抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力及清除自由基等方面的活性要高于原人參皂苷［7-8］。低極性人參皂苷F4對(duì)HL-60白血病細(xì)胞有抑制增殖的作用［9］。本研究以人單核系SHI-1和人紅系K562白血病細(xì)胞為靶細(xì)胞，結(jié)果顯示低極性人參皂苷F4（40~120 mg/L）能夠顯著抑制SHI-1和K562細(xì)胞增殖。白血病細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)以SHI-1和K562細(xì)胞群中原始細(xì)胞作為觀察對(duì)象，顯示40~120 mg/L的F4能顯著減少SHI-1和K562細(xì)胞形成集落的數(shù)目，抑制其原始細(xì)胞的增殖，抑制率達(dá)到26.1%~64.2%和35.0%~74.1%。MTT比色法以SHI-1和K562細(xì)胞群為觀察對(duì)象， 40~120 mg/L的F4抑制細(xì)胞增殖，抑制率達(dá)到20.1%~45.7%和26.0%~57.7%，提示低極性人參皂苷F4能夠有效地抑制SHI-1和K562白血病細(xì)胞增殖。

誘導(dǎo)分化是指在分化誘導(dǎo)劑的作用下，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化為正?；蚪咏５募?xì)胞，其基本特點(diǎn)在于可不殺傷腫瘤細(xì)胞，而是誘導(dǎo)其細(xì)胞形態(tài)、功能及生物學(xué)行為等綜合指標(biāo)向正常方向變化。本實(shí)驗(yàn)表明，在40~120 mg/L的劑量范圍內(nèi)F4可誘導(dǎo)SHI-1和K562細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)分化的特征。與對(duì)照組比較，各組SHI-1和K562細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的核/質(zhì)比例縮小，染色質(zhì)粗糙，核仁減少，可見(jiàn)空泡，且SHI-1細(xì)胞核有扭曲或折疊，初步證明F4可誘導(dǎo)SHI-1、K562細(xì)胞分化。K562細(xì)胞具有多向分化的能力，體內(nèi)外研究表明，其在誘導(dǎo)劑作用下可以向紅系、粒系和巨核系分化［10-12］。GATA-1調(diào)控K562細(xì)胞向紅系、巨核系分化，其表達(dá)能力能夠反應(yīng)K562細(xì)胞的分化成熟程度［13-14］。本研究顯示F4能夠提高GATA-1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)， γ-globin蛋白表達(dá)水平也有所提高。進(jìn)一步研究表明CD14在K562細(xì)胞的表達(dá)水平也有所提高，提示F4可誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系和粒單系分化。為了研究F4誘導(dǎo)髓系白血病細(xì)胞向粒單系分化的作用，本實(shí)驗(yàn)采用F4處理SHI-1細(xì)胞，觀察誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化的作用。SHI-1細(xì)胞屬于單核白血病細(xì)胞，構(gòu)成性表達(dá)單核細(xì)胞分化特異的轉(zhuǎn)錄因子PU.1，提高PU.1表達(dá)能夠促進(jìn)SHI-1細(xì)胞分化成熟。CD11b主要表達(dá)在中性粒細(xì)胞，其表達(dá)水平與粒細(xì)胞分化成熟具有相關(guān)性［15］。F4能夠提高CD11b在SHI-1細(xì)胞的表達(dá)，表明其能夠提高中性粒細(xì)胞分化基因的表達(dá)，提示F4可能具有表觀遺傳調(diào)控的作用。

綜上所述，低極性人參皂苷F4具有抑制髓系白血病細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)分化的作用，為F4抗白血病的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其誘導(dǎo)分化的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

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Effect of low-polarity ginsenoside F4on proliferation and differentiation of SHI-1 cells and K562 cells

LI Wan， GAO Rui-lan， YU Xiao-ling， YIN Li-ming， TANG Bi-qiang， LAN Gao-chen， LAN Jin-jian， ZHAO Yan-na

（，310006，）

To investigate the effects of low-polarity ginsenoside F4（F4） on the proliferation and differentiation of human monocytic leukemia SHI-1 cells and erythroid leukemia K562 cells.The SHI-1 cells and K562 cells were treated with F4at different concentrations （0， 40， 80 and 120 mg/L）. The suppressive effect of F4on cell proliferation was detected by MTT assay and colony formation assay with semi-solid culture. The morphologic features of the cells were observed under inverted microscope with Wright-Giemsa staining. The positive expression rates and fluorescence intensity of differentiation-associated antigens CD11b and CD14 were detected by flow cytometry and immunofluorescence method. The protein expression of differentiation-related transcription factor PU.1 in SHI-1 cells， and GATA-1 and γ-globin related to erythroid differentiation in K562 cells was analyzed by immunocytochemistry and Western blot. The mRNA expression of PU.1 and GATA-1 was detected by RT-qPCR.Compared with control （0 mg/L） group， F4inhibited the proliferation of SHI-1 cells and K562 cells （<0.01）， and induced these leukemic cells to differentiate， showing reduced nucleus/cytoplasm ratio， rough chromatin， reduced nucleoli， increased vacuoles， and distortion of SHI-1 cell nucleus. The positive expression rates of CD11b in SHI-1 cells and CD14 in K562 cells were increased significantly （<0.01）， and the immunofluorescence reaction changed from weak positive to strong positive. No significant change in the positive expression rates of CD14 in SHI-1 cells and CD11b in K562 cells was observed. At the same time， F4up-regulated the mRNA and protein expression levels of PU.1 and GATA-1， and the protein level of γ-globin （<0.05）.The low-polarity ginsenoside F4possesses anti-leukemia effect that inhibits the proliferation of SHI-1 cells and K562 cells， and induces differentiation by regulating the expression of differentiation-related PU.1， GATA-1 and γ-globin.

Low-polarity ginsenoside F4； SHI-1 cells； K562 cells； Cell proliferation； Cell differentiation

R730.23； R733.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.010

1000-4718（2020）11-1988-08

2020-06-09

2020-08-11

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81774068）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.LY20H290004; No.LQ19H290002）

Tel: 0571-87071625; E-mail: zyn77@126.com

（責(zé)任編輯：林白霜，羅森）