鄭舒展， 陳茂， 杜延飛， 陳雨露， 張偉

脂自噬通過減少巨噬細(xì)胞脂質(zhì)含量抑制泡沫細(xì)胞形成*

鄭舒展1△， 陳茂2， 杜延飛1， 陳雨露1， 張偉1

（1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 瀘州 646000；2四川大學(xué)華西醫(yī)院心內(nèi)科，四川 成都 610000）

觀察泡沫細(xì)胞形成不同時(shí)間脂自噬的水平，探討脂自噬是否參與調(diào)節(jié)泡沫細(xì)胞脂質(zhì)含量從而抑制泡沫細(xì)胞的形成。體外培養(yǎng)THP-1單核細(xì)胞，采用佛波酯誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞48 h分化成為巨噬細(xì)胞，再用50 mg/L氧化低密度脂蛋白（oxLDL）誘導(dǎo)形成泡沫細(xì)胞。油紅O染色脂質(zhì)觀察泡沫細(xì)胞形成，計(jì)算脂質(zhì)含量；采用膽固醇含量測定試劑盒測量泡沫細(xì)胞內(nèi)的總膽固醇（TC）和游離膽固醇（FC）含量，計(jì)算膽固醇酯（CE）含量及CE/TC比值；膽固醇外流試劑盒檢測泡沫細(xì)胞的膽固醇外流率； Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白5 （Atg5）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 （LC3）和P62的表達(dá)。熒光染料分別標(biāo)記脂滴（LD）和LC3抗體，激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞中LD與LC3的共定位以確定脂自噬水平，再分別采用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（Rap）和阻斷劑3-甲基腺嘌呤（3MA）干預(yù)泡沫細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)脂自噬水平、膽固醇含量及膽固醇外流的變化。50 mg/L oxLDL作用24 h后細(xì)胞內(nèi)LD大量聚集， CE/TC比值大于50%，泡沫細(xì)胞形成。泡沫細(xì)胞形成24 h內(nèi)膽固醇外流率升高，在48 h膽固醇外流率下降（<0.05）。Western blot結(jié)果顯示， oxLDL作用24 h， Atg5表達(dá)及LC3-II/LC3-I比值升高， P62表達(dá)降低（<0.05）；在48 h， Atg5和LC3-II/LC3-I均下降， P62表達(dá)增加（<0.05）。免疫熒光結(jié)果顯示， oxLDL作用24 h， LC3與LD共定位水平升高，而在48 h下降（<0.05）。自噬誘導(dǎo)劑Rap上調(diào)泡沫細(xì)胞Atg5表達(dá)，提高LC3II/LC3-I比值，降低P62水平，提高泡沫細(xì)胞內(nèi)LC3與LD的共定位水平（<0.05），促進(jìn)膽固醇外流，降低泡沫細(xì)胞內(nèi)TC和CE含量及CE/TC比值（<0.05）；自噬抑制劑3MA作用則相反，可抑制Atg5表達(dá)，降低LC3-II/LC3-I比值，同時(shí)升高P62的水平，降低LC3與LD的共定位水平（<0.05），抑制膽固醇外流，增加泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量（<0.05）。泡沫細(xì)胞形成24 h內(nèi)伴有脂自噬水平的增加，在48 h脂自噬能力減弱，膽固醇外流減少。脂自噬減少泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，增加膽固醇外流率，參與調(diào)節(jié)泡沫細(xì)胞的脂質(zhì)含量，從而抑制泡沫細(xì)胞的形成。

自噬；脂自噬；巨噬細(xì)胞；泡沫細(xì)胞；膽固醇外流

動脈粥樣硬化性疾病發(fā)病率高，極大地危害人類健康。粥樣斑塊的形成是動脈粥樣硬化的主要病理改變，其主要成分為泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞以富含脂滴（lipid droplets， LD）為特征。單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞是泡沫細(xì)胞的主要來源，巨噬細(xì)胞通過A型清道夫受體吞噬大量的氧化修飾低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein， oxLDL）形成泡沫細(xì)胞，后者分泌多種炎癥因子及基質(zhì)代謝酶引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致粥樣斑塊不穩(wěn)定和急性心血管事件的發(fā)生［1］，因此如何減輕泡沫細(xì)胞的形成是防治動脈粥樣硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

自噬（autophagy）是細(xì)胞在自噬相關(guān)蛋白（autophagy-related protein， Atg）調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，自噬降解細(xì)胞長壽命蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器，具有維持細(xì)胞代謝平衡及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。研究表明，動脈粥樣硬化的發(fā)生與自噬有關(guān)，動脈粥樣硬化斑塊中存在自噬標(biāo)志物與巨噬細(xì)胞共存，動脈粥樣硬化晚期自噬功能減弱，同時(shí)自噬缺陷可導(dǎo)致膽固醇酯（cholesteryl ester， CE）的致命性堆積和促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生［2］。自噬影響動脈粥樣硬化的具體機(jī)制并不十分清楚，可能機(jī)制之一與脂自噬（lipophagy）有關(guān)。脂自噬是一種以LD為自噬對象發(fā)生的自噬過程，具有影響細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的作用［3］。目前研究顯示，脂自噬缺陷可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的堆積，引起脂肪肝和肥胖的發(fā)生［4］。Quimet等［5］初步報(bào)道巨噬細(xì)胞存在脂自噬現(xiàn)象，脂自噬參與了巨噬細(xì)胞的膽固醇代謝，有利于膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。泡沫細(xì)胞存在脂代謝紊亂，其形成過程中是否存在脂自噬的異常，通過調(diào)節(jié)脂自噬能否影響泡沫細(xì)胞的形成尚不清楚。因此，本項(xiàng)工作應(yīng)用細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，從脂自噬的角度研究泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步探討泡沫細(xì)胞參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制。

材料和方法

1　主要試劑

人單核細(xì)胞株THP-1購自武漢普諾賽生命科技有限公司。oxLDL購自廣州奕源生物科技有限公司；雷帕霉素（rapamycin， Rap）購自MedChemExpress； 3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine， 3MA）購自Sigma； RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自Thermo Fisher Scientific；油紅O染色液購自北京索萊寶科技有限公司；抗自噬相關(guān)蛋白5（autophagy-related protein 5， Atg5）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3， LC3）和P62抗體及Alexa Fluor 647標(biāo)記的II抗均購自Cell Signaling Technology；膽固醇測定試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；熒光標(biāo)記膽固醇外流分析試劑盒購自BioVison；其余試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

2　主要方法

2.1泡沫細(xì)胞模型建立培養(yǎng)THP-1細(xì)胞并傳代，取其對數(shù)生長期，接種于6孔板中，于含160 nmol/L 佛波酯的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞。再將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含終濃度為50 mg/L oxLDL的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24、48和72 h，觀察泡沫細(xì)胞的形成情況，以細(xì)胞內(nèi)CE與總膽固醇（total cholesterol， TC）的比值大于或等于50%作為泡沫細(xì)胞模型成功標(biāo)準(zhǔn)［6］。

2.2油紅O染色將密度為1×108/L的THP-1細(xì)胞接種于鋪有無菌蓋玻片的6孔板，每孔接種2×106個(gè)進(jìn)一步培養(yǎng)和處理，首先用佛波酯誘導(dǎo)分化48 h成巨噬細(xì)胞后，加入oxLDL干預(yù)，分別作用24、48和72 h，然后丟棄培養(yǎng)液，取出貼附有細(xì)胞的蓋玻片。各組分別處理步驟如下：預(yù)冷的PBS沖洗3次，每次5 min；10%甲醛室溫固定5 min；60%異丙醇清洗；PBS沖洗3次后加入油紅溶液（60%油紅∶40%去離子水）在室溫下作用20 min；再次60%異丙醇清洗1次，換蒸餾水沖洗掉剩余染料。光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，觀察紅染顆粒計(jì)數(shù)，計(jì)算單個(gè)細(xì)胞內(nèi)平均脂質(zhì)含量。

2.3細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的檢測取各組細(xì)胞懸液加入離心管， 211×離心10 min；棄上清液，收集細(xì)胞后加入PBS，重新混勻離心，條件如上。棄上清液，保留底部的細(xì)胞沉渣；加入細(xì)胞裂解液吹打，使細(xì)胞充分得到裂解，13 523×離心5 min；收集上清液，按照膽固醇測定試劑盒采用比色法（吸收波長為570 nm）測定TC和游離膽固醇（free cholesterol， FC）的含量，每組樣本重復(fù)3次。CE含量按公式“CE=TC-FC”計(jì)算。

2.4膽固醇外流率的檢測泡沫細(xì)胞膽固醇外流按照熒光檢測試劑盒說明書進(jìn)行，計(jì)算公式：膽固醇流出率（%）=細(xì)胞上清液熒光測值/（細(xì)胞上清液熒光測值+細(xì)胞裂解液熒光測值）×100%。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn)細(xì)胞裂解法提取蛋白，酶標(biāo)儀測定蛋白濃度，蛋白上樣量為20μg。SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上， 5%脫脂牛奶封閉，加入I抗（抗Atg5、LC3、P62和GAPDH抗體，均按1∶1 000稀釋）， 4℃過夜； TBST清洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗，室溫孵育2 h；再次TBST清洗后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯影。以Quantity One圖像分析軟件對圖片進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH的比值表示蛋白相對表達(dá)量。

2.6免疫熒光實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)結(jié)束后，吸除培養(yǎng)液，加入適量Bodipy染液至終濃度1 μmol/L，繼續(xù)避光孵育10 min。吸除染液，PBS清洗1次， 4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。PBS洗滌細(xì)胞爬片3次，吸干，6%山羊血清封閉30 min。加入抗LC3抗體（1∶200）， 4℃孵育過夜后，再與Alexa Fluor 647標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶800） 37℃孵育60 min。細(xì)胞核采用DAPI染料避光孵育15 min，抗熒光淬滅劑封片。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像，熒光信號分析及重疊系數(shù)采用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0和OriginPro 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及繪圖。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　油紅O染色觀察泡沫細(xì)胞的形成

50 mg/L oxLDL作用于THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞24、48和72 h，油紅O染色結(jié)果顯示，與0 h組比較，oxLDL作用24 h可使細(xì)胞內(nèi)大量紅染的顆粒聚集，單個(gè)細(xì)胞平均脂質(zhì)含量顯著增加（<0.05）；隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)紅色顆粒呈增多趨勢，48 h紅染顆粒顯著增加，到72 h細(xì)胞內(nèi)紅染顆粒最多，見圖1。

Figure 1.　Lipid content in the macrophages stimulated by oxLDL at different time points (oil red O staining, scale bar=50 μm). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 h group.

2　oxLDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的變化

膽固醇含量檢測結(jié)果如表1所示， oxLDL作用于巨噬細(xì)胞24 h，細(xì)胞內(nèi)TC及CE含量明顯增加，在48 h TC及CE含量達(dá)最高（<0.05）。oxLDL作用不同時(shí)間， TC及CE含量各組間比較有顯著差異（<0.05）。與0 h組比較， oxLDL作用24 h細(xì)胞內(nèi)CE/TC比值顯著升高（<0.05），見表1。

表1　oxLDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量

*<0.050 h group;△<0.0524 h group.

3　oxLDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞膽固醇外流的變化

膽固醇外流檢測結(jié)果顯示，隨著oxLDL作用時(shí)間的延長， 12及24 h細(xì)胞的膽固醇外流均增加，在24 h達(dá)高峰，與0 h組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）；至48 h膽固醇外流出現(xiàn)下降趨勢，與24 h組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），見圖2。

Figure 2.　Cholesterol efflux in foam cells at different time points. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 h group; #P<0.05 vs 24 h group.

4　oxLDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成不同時(shí)點(diǎn)Atg5、LC3和P62的表達(dá)變化

Western blot結(jié)果顯示， 50 mg/L oxLDL作用于THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞12和24 h，自噬標(biāo)志蛋白Atg5和LC3表達(dá)均增加，到24 h作用最明顯（與0 h組比較<0.05），到48 h LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Atg5水平均顯著下降（<0.05）； 24 h以內(nèi)P62蛋白的表達(dá)則隨著時(shí)間的增加呈下降趨勢，到48 h P62蛋白水平較24 h顯著升高（<0.05），見圖3。

Figure 3.　The relative protein expression of Atg5, LC3 and P62 in foam cells at different time points. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 h group; #P<0.05 vs 24 h group.

5　泡沫細(xì)胞脂自噬水平的變化

免疫熒光結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞內(nèi)LC3的熒光信號比較彌散，有少量紅色LC3熒光信號與LD的綠色熒光信號相重疊； oxLDL作用24 h后， LC3紅色熒光信號和LD綠色熒光信號均增加，與0 h組比較，兩者重疊系數(shù)顯著升高（<0.05）；與24 h組比較，48 h泡沫細(xì)胞LC3與LD的熒光信號重疊系數(shù)顯著下降（<0.05），見圖4。

Figure 4.　Lipophagy in foam cells at different time points. Scale bar=5 μm. LD: lipid droplets. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 h goup; #P<0.05 vs 24 h group.

6　自噬誘導(dǎo)劑及阻斷劑對泡沫細(xì)胞內(nèi)Atg5、LC3和P62表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比， oxLDL組泡沫細(xì)胞的Atg5表達(dá)降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，P62水平升高（<0.05）；與oxLDL組相比， oxLDL+Rap組泡沫細(xì)胞內(nèi)Atg5表達(dá)增加， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高， P62表達(dá)降低（<0.05）；而3MA的作用相反，進(jìn)一步下調(diào)泡沫細(xì)胞的Atg5表達(dá)，降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，增加P62的水平（<0.05），見圖5。

Figure 5.　The effect of rapamycin (Rap) and 3-methyladenine (3MA) on Atg5, LC3 and P62 expression in foam cells treated with 50 mg/L oxLDL for 48 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs oxLDL group.

7　自噬誘導(dǎo)劑和阻斷劑對泡沫細(xì)胞脂自噬水平的影響

激光共聚焦結(jié)果顯示，與空白組相比， oxLDL組LC3紅色熒光信號與LD綠色熒光信號重疊系數(shù)顯著升高（<0.05）；與oxLDL組相比， Rap增強(qiáng)泡沫細(xì)胞內(nèi)的LC3的紅色熒光信號，同時(shí)紅色LC3熒光信號與LD的綠色熒光信號重疊系數(shù)顯著升高（<0.05）；3MA的作用與之相反，表現(xiàn)為LC3與LD的熒光信號重疊系數(shù)顯著降低（<0.05），見圖6。

Figure 6.　Lipophagy in foam cells treated with rapamycin (Rap) or 3-methyladenine (3MA). Scale bar=5 μm. LD: lipid droplets. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs blank group; #P<0.05 vs oxLDL group.

8　自噬誘導(dǎo)劑和阻斷劑參與泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量及膽固醇外流的調(diào)節(jié)

如表2所示， oxLDL作用前預(yù)防性加入Rap可抑制泡沫細(xì)胞內(nèi)TC和CE含量的增加，引起CE/TC比值下降（與oxLDL組相比，<0.05）； 3MA的作用則相反，增加泡沫細(xì)胞內(nèi)TC和CE含量，引起CE/TC比值升高（與oxLDL組相比<0.05）。與oxLDL組相比， oxLDL+Rap組膽固醇外流率顯著升高（<0.05）；與oxLDL組相比，預(yù)防性加入3MA明顯抑制泡沫細(xì)胞的膽固醇外流（<0.05），見圖7。

表2　自噬誘導(dǎo)劑Rap及阻斷劑3MA對泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響

*<0.05control group;△<0.05oxLDL group.

Figure 7.　The effects of rapamycin (Rap) and 3-methyladenine (3MA) on cholesterol efflux of foam cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs oxLDL group.

討論

正常情況下，巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的代謝是一個(gè)動態(tài)平衡的過程，依賴于膽固醇的攝入和流出。泡沫細(xì)胞的產(chǎn)生是由于脂質(zhì)負(fù)荷導(dǎo)致巨噬細(xì)胞不受調(diào)控的攝入脂質(zhì)，同時(shí)膽固醇的外流受損，從而造成細(xì)胞內(nèi)CE聚集，并形成LD［7］。

泡沫細(xì)胞中的主要脂質(zhì)成分為游離或酯化的膽固醇。oxLDL被巨噬細(xì)胞攝取并運(yùn)送至溶酶體，存在于溶酶體中的水解酶將CE水解成FC；為了避免過多FC產(chǎn)生細(xì)胞毒性， FC又在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶1 （acetyl-coenzyme A acetyltransferase 1， ACAT1）作用下酯化成CE，儲存在胞漿的LD中，因此FC和CE的比例平衡對于泡沫細(xì)胞調(diào)節(jié)其細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量至關(guān)重要［8］。本實(shí)驗(yàn)通過油紅O染色及細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的測定顯示， oxLDL呈時(shí)間依賴性地增加巨噬細(xì)胞內(nèi)LD含量，主要增加TC和CE含量，升高CE比例。50 mg/L oxLDL作用于THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞24 h后CE/TC比值大于50%，提示泡沫細(xì)胞形成。正常功能的巨噬細(xì)胞，即使在脂質(zhì)負(fù)荷的情況下攝取脂質(zhì)成分增加，但細(xì)胞可通過代償性地增加CE的水解和外流，來達(dá)到細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的穩(wěn)態(tài)。若oxLDL攝取增加而膽固醇外流受損，則會導(dǎo)致CE堆積和泡沫細(xì)胞形成［9］。本實(shí)驗(yàn)觀察到，泡沫細(xì)胞形成早期， oxLDL作用于THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞24 h內(nèi)，膽固醇外流增加，說明泡沫細(xì)胞形成早期可代償性地增加膽固醇外流，從而減少細(xì)胞內(nèi)CE堆積；但48 h的泡沫細(xì)胞出現(xiàn)膽固醇外流的減少，膽固醇外流能力受損是引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚積的重要原因。

自噬是細(xì)胞進(jìn)化中的一種相對保守的自我保護(hù)機(jī)制，是將胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解和再利用的過程。自噬過程受30余種自噬相關(guān)基因的調(diào)控，其中Atg5主要參與自噬的啟動；LC3是吞噬體雙膜形成的重要組成部分，LC3有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，細(xì)胞質(zhì)中LC3-Ⅰ在酶切作用下轉(zhuǎn)變成LC3-Ⅱ，與自噬體膜相結(jié)合，其水平可反映自噬體的數(shù)量，LC3-II/LC3-Ⅰ升高意味著自噬過程的活化［10］。另外，SQSTM1/P62蛋白復(fù)合物（簡稱P62）可連接LC3和泛素化底物蛋白，被自噬過程所降解，與自噬流呈負(fù)相關(guān)［11］。目前主要通過檢測這些自噬相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)來反映自噬的水平。一般情況下，細(xì)胞自噬是非選擇性的過程，其對象可以是胞內(nèi)錯誤折疊蛋白、細(xì)胞器或胞吞物質(zhì)等，但在特定的情況下，自噬的發(fā)生可以是選擇性的［12］，其中，脂自噬是細(xì)胞選擇性針對LD發(fā)生的自噬過程，富含LC3的吞噬膜結(jié)構(gòu)可包繞或局部發(fā)生于LD表面，然后雙層膜逐漸向LD中心延伸、彎曲、閉合，完成LD的隔離后形成自噬體［13］。因此， LC3和LD的共定位可反映脂自噬水平。脂質(zhì)含量的變化及持續(xù)的饑餓狀態(tài)可誘導(dǎo)脂自噬的發(fā)生［13］。為了確定泡沫細(xì)胞脂自噬的水平，我們使用紅色熒光標(biāo)記的LC3抗體和使自噬體作用的LD染色的綠色熒光染料，通過免疫熒光的方法觀察LD和LC3的共定位情況。

目前， oxLDL對巨噬細(xì)胞自噬的影響結(jié)論不一。有研究認(rèn)為oxLDL可通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬的發(fā)生［14］；另一方面，oxLDL作用于巨噬細(xì)胞后存在自噬關(guān)鍵蛋白Atg5及LC3B表達(dá)的降低［15］。而且，在oxLDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成過程中其對特異性脂自噬的影響暫未見相關(guān)報(bào)道。本研究顯示，在泡沫細(xì)胞形成24 h內(nèi)， Atg5表達(dá)增加， LC3-II/LC3-I比值升高，伴隨有LC3與LD的共定位水平增加，說明脂自噬水平增加；同時(shí)膽固醇外流率增加，說明早期脂自噬可能作為代償機(jī)制減少泡沫細(xì)胞內(nèi)的膽固醇水平。到48 h，泡沫細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)下降，LC3與LD共定位減少，說明此時(shí)脂自噬水平開始降低。另一方面，我們觀察到泡沫細(xì)胞形成24 h內(nèi)P62水平降低，至48 h表達(dá)增加，說明自噬流先增加后受阻，可能是脂自噬水平變化的一個(gè)重要原因。因此，對于文獻(xiàn)報(bào)道的oxLDL對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)或者抑制自噬的相反作用，我們分析可能與oxLDL作用時(shí)間不一以及使用的濃度不同有關(guān)。有研究表明，高濃度的脂質(zhì)水平對于自噬產(chǎn)生抑制作用［16］。對于脂自噬的變化，持續(xù)的脂質(zhì)負(fù)荷可造成細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)超載，引起脂自噬的降解工具溶酶體的損傷［17］，可能也是脂自噬能力下降的原因之一。

Quimet等［5］的研究顯示，自噬參與了巨噬細(xì)胞的膽固醇代謝過程，缺乏的巨噬細(xì)胞不能有效清除膽固醇，膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制，這一過程與脂自噬有關(guān)。為進(jìn)一步證實(shí)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量受脂自噬過程調(diào)節(jié)，我們使用自噬誘導(dǎo)劑Rap和阻斷劑3MA分別干預(yù)泡沫細(xì)胞。Rap是經(jīng)典的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）抑制劑，主要解除mTOR對自噬啟動復(fù)合物的抑制作用，可誘導(dǎo)自噬，誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對oxLDL的自噬性降解［18］。3MA是Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶的抑制劑，實(shí)驗(yàn)中常被用來抑制自噬早期自噬體前體的形成［19］。本研究結(jié)果顯示，自噬誘導(dǎo)劑Rap增強(qiáng)泡沫細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的同時(shí)降低泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，促進(jìn)膽固醇外流，而3MA抑制自噬后，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量增加，膽固醇外流減少，說明干預(yù)自噬可調(diào)節(jié)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的代謝，與既往文獻(xiàn)結(jié)論一致［20］。為證實(shí)這一效果與具體影響脂自噬的過程有關(guān)，我們觀察LC3與LD共定位水平的變化，自噬誘導(dǎo)劑能增加LC3與LD的共定位，而3MA則起抑制作用，說明脂自噬通過特異性針對LD的自噬作用參與LD的代謝，促進(jìn)膽固醇外流，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量，具有抑制泡沫細(xì)胞形成的作用。

本研究結(jié)果表明，脂自噬參與泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的調(diào)節(jié)，泡沫細(xì)胞形成的晚期伴有脂自噬能力的受損，增強(qiáng)脂自噬可抑制泡沫細(xì)胞的形成。但是，脂自噬參與泡沫細(xì)胞在動脈粥樣硬化過程的具體作用及調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

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Lipophagy inhibits foam cell formation by reducing cholesterol content

ZHENG Shu-zhan1， CHEN Mao2， DU Yan-fei1， CHEN Yu-lu1， ZHANG Wei1

（1，，646000，；2，，，610000，）

To observe the changes of lipophagy during foam cells formation， and to determine the effect of lipophagy on the lipid content and cholesterol outflow of foam cells.Human THP-1 monocytes were induced by phorbol-12-myristate-13-acetate for 48 h to differentiate into macrophages， and then were incubated with 50 mg/L oxidized low-density lipoprotein （oxLDL） to form foam cells. Lipids in foam cell were stained by oil red O， and the lipid content was determined. The total cholesterol （TC） and free cholesterol （FC） levels in foam cells were measured by cholesterol testing kit. Cholesteryl ester （CE） and CE/TC ratio were calculated. The cholesterol efflux rate was detected by cholesterol efflux assay kit. The expression of autophagy-related proteins， including autophagy-related protein 5 （Atg5）， microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3） and P62， were detected by Western blot. The colocalization of lipid droplets （LD） and LC3 was detected by immunofluorescence staining. The autophagy inducer rapamycin （Rap） or blocker 3-methyladenine （3MA） was used to intervene foam cells， and the expression of Atg5， LC3 and P62， the co-expression of LD and LC3， the cholesterol content and the cholesterol efflux rate were determined.Formation of foam cells was observed at 24 h after stimulation with oxLDL at 50 mg/L， as indicated by intracellular CE/TC ratio exceeding 50%.Cholesterol efflux assay revealed that the cholesterol efflux rate increased within 24 h during foam cell formation but decreased after 48 h （<0.05）. Western blot results displayed that the expression of Atg5 and LC3-II/LC3-I ratio were increased within 24 h of foam cell formation， but was deceased after 48 h （<0.05）. The expression of P62 was decreased within 24 h but was increased at 48 h （<0.05）. The colocalization of LD and LC3 was increased at 24 h but was decreased at 48 h after oxLDL stimulation. Treatment with Rap up-regulated the expression of Atg5 and LC3-II/LC3-I ratio， reduced the level of P62， increased the colocalization of LD and LC3， promoted the cholesterol efflux， anf reduced cholesterol content in foam cells （<0.05）. On the contrary， 3MA inhibited the expression of Atg5， reduced LC3-II/LC3-I ratio， elevated the level of P62， decreased the colocalization of LD and LC3， reduced the outflow of cholesterol， increased the content of TC and CE， and elevated CE/TC ratio in foam cells （<0.05）.Lipophagy is enhanced at 24 h but decreased at 48 h during foam cell formation. Lipophagy inhibited foam cell formation by reducing cholesterol content and increasing cholesterol efflux.

Autophagy； Lipophagy； Macrophages； Foam cells； Cholesterol efflux

R363.2； R329.2+5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.009

1000-4718（2020）11-1980-08

2020-04-16

2020-07-17

瀘州市人民政府-西南醫(yī)科大學(xué)科技戰(zhàn)略合作項(xiàng)目基金資助（No.2017LZXNYD-J03）

Tel: 13378261229; E-mail: toshuzhan@126.com

（責(zé)任編輯：林白霜，羅森）