王栩越, 包雅麗, 張?zhí)穑?凌燦, 王一平, 吳振宏, 孫湛
rAAV9介導(dǎo)的siRNA敲減對壓力超負(fù)荷大鼠心肌纖維化和凋亡的影響*
王栩越, 包雅麗, 張?zhí)穑?凌燦, 王一平, 吳振宏, 孫湛△
(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830011)
探討重組腺相關(guān)病毒血清型9 (rAAV9)介導(dǎo)的敲減基因表達(dá)對壓力超負(fù)荷大鼠心功能的作用及可能機制。通過腹主動脈縮窄手術(shù)(AAC)構(gòu)造大鼠左心室肥厚模型。將造模的SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、AAC組、AAC+rAAV9-eGFP組和AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA組。假手術(shù)組大鼠開腹后直接關(guān)閉腹腔;其余3組大鼠開腹結(jié)扎腹主動脈后關(guān)閉腹腔,術(shù)后3 d對AAC大鼠分別尾靜脈注射生理鹽水、rAAV9-eGFP和rAAV9-eGFP-P65-siRNA。4周后,測定血流動力學(xué)相關(guān)指標(biāo);計算心臟質(zhì)量參數(shù); Masson染色檢測心肌纖維化程度; TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡水平; Western blot檢測心肌P65的表達(dá)水平; ELISA檢測各組大鼠血清腫瘤壞死因子α (TNF-α)和白細(xì)胞介素6 (IL-6)的含量。AAC組和AAC+rAAV9-eGFP組中P65表達(dá)量較假手術(shù)組上升(<0.05);AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA組中P65表達(dá)量較AAC組明顯降低(<0.05)。AAC組和AAC+rAAV9-eGFP組大鼠收縮壓、舒張壓、左室重量/體重、心肌細(xì)胞凋亡率及TNF-α和IL-6水平均較假手術(shù)組增高(<0.05);與AAC組相比,AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA組大鼠上述指標(biāo)均下降(<0.05)。Masson染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,AAC組和AAC+rAAV9-eGFP組大鼠心肌組織中膠原蛋白的沉積增多,而rAAV9-eGFP-P65-siRNA可以緩解高血壓誘導(dǎo)的AAC大鼠心肌纖維化發(fā)生。敲減基因表達(dá)可減輕壓力超負(fù)荷大鼠左心室纖維化和細(xì)胞凋亡程度,其機制與調(diào)節(jié)NF-κB通路,減少炎癥反應(yīng)有關(guān)。
重組腺相關(guān)病毒血清型9;P65蛋白;高血壓;心肌纖維化;細(xì)胞凋亡
心肌肥厚是多種心血管疾病,如高血壓和心肌梗死等發(fā)生發(fā)展過程共有的病理特征,其主要的病理生理變化包括心肌細(xì)胞體積增大、心肌成纖維細(xì)胞活化并導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增加等。心肌肥厚是一種代償性變化,但隨著心肌肥厚逐漸發(fā)展,最終會出現(xiàn)失代償而導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生[1]。隨著高血壓患者日益增加,壓力超負(fù)荷性心功能不全也引起人們的關(guān)注。越來越多的研究表明,NF-κB信號通路在心力衰竭、冠心病和高血壓等多種心血管疾病中發(fā)揮著重要作用[2],下調(diào)NF-κB信號通路可緩解心血管疾病病理表現(xiàn)[3-4]。P65作為NF-κB的重要組成部分,被證明可促進(jìn)心力衰竭的不良重塑和凋亡[5-6],有可能是涉及心肌異常的心血管炎性疾病的共同發(fā)生發(fā)展環(huán)節(jié)。本課題組前期在細(xì)胞實驗中證實了P65與心肌細(xì)胞重塑的相關(guān)性,因此,本研究通過腹主動脈縮窄術(shù)(abdominal aortic coarctation, AAC)構(gòu)建壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠模型,采用重組腺相關(guān)病毒血清型9 (recombinant adeno-associated virus serotype 9, rAAV9)介導(dǎo)RNA干擾技術(shù)下調(diào)基因的表達(dá),觀察其對壓力超負(fù)荷大鼠左心纖維化和凋亡的影響,為臨床壓力超負(fù)荷所致心功能不全治療策略提供新思路。
選取6周齡、體重20~24 g SPF級雄性SD大鼠,飼養(yǎng)環(huán)境溫度恒定(22±2)℃、濕度恒定(55±5)%由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號為SCXK(新)2018-0001]提供。所有操作程序經(jīng)過動物倫理委員會批準(zhǔn)。
rAAV9-eGFP-P65-siRNA病毒的構(gòu)建包裝純化由Virovek完成; Masson三色染色試劑盒購自Solarbio;細(xì)胞質(zhì)蛋白/核蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白定量分析試劑盒和ELISA試劑盒購自Sigma;抗體購自Cell Signaling Technology; TUNEL試劑盒購自Roche。高速低溫離心機購自Eppendorf; CKX41倒置顯微鏡購自O(shè)lympus。
2.1動物模型的建立與分組將實驗動物分為4組:假手術(shù)(sham)組、AAC、AAC+rAAV9-eGFP組和AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA組。SPF級雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,給予10%水合氯醛麻醉,待大鼠麻醉后仰面固定于操作臺。消毒備皮,正中線逐層打開腹腔,分離腹主動脈,仔細(xì)分離腹主動脈,用21G針頭(直徑0.7 mm)平行放置于腹主動脈上,將4號手術(shù)線從腹主動脈背側(cè)穿出,共同結(jié)扎針頭和腹主動脈后迅速移去針頭,形成腹主動脈50%~70%縮窄,逐層關(guān)閉腹腔。sham組不結(jié)扎手術(shù)線。術(shù)后3 d對AAC大鼠分別通過尾靜脈注射生理鹽水、rAAV9-eGFP和rAAV9-eGFP-P65-siRNA。飼養(yǎng)4周后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。
2.2大鼠血流動力學(xué)檢測將動物固定在實驗臺上,分離出一側(cè)的頸總動脈約1cm。插管前將導(dǎo)管和壓力換能器內(nèi)充滿0.3%肝素生理鹽水注射液,排走氣泡,并且準(zhǔn)備好記錄儀器。然后先將頸總動脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎,近心端用動脈夾夾住,在遠(yuǎn)心端結(jié)扎處的動脈壁上用眼科剪刀以45°角度剪口,將準(zhǔn)備好的頸總動脈插管向近心端插入約1cm,用近心端的穿線結(jié)扎動脈血管和導(dǎo)管,松開動脈夾將導(dǎo)管再送入,記錄各項指標(biāo)。用BL-420F生物信號采集處理系統(tǒng),記錄收縮壓(systolic blood pressure, SBP),舒張壓(diastolic blood pressure, DBP),左室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±d/dmax)。
2.3心臟組織HE染色及心肌Masson染色大鼠稱重后立即處死并取出心臟,在冰生理鹽水中洗凈血液,濾紙吸干,沿房室交界處去除左右心房,再剪去右心室游離壁,保留左心室稱出左心室質(zhì)量(left ventricular weight, LVW)。稱重后將心臟標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定24 h,石蠟包埋切片,脫蠟,常規(guī)HE染色,封片,顯微鏡下觀察病理改變。心肌組織Masson染色:組織切片脫蠟至水,依據(jù)Masson染色試劑盒說明書添加染液,分化、脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察膠原沉積,使用Image-Pro Plus軟件,計算膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen valume fraction, CVF),判斷心肌纖維化程度。
2.4TUNEL法分析心肌細(xì)胞凋亡率取小鼠左心室組織制作石蠟切片(4 μm),行TUNEL染色,明場下400倍隨機拍照,人工計數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞的比例,以評估心肌細(xì)胞凋亡率。
2.5Western blot檢測心肌細(xì)胞 P65和cleaved caspase-3的蛋白水平取40 μg各組左室心肌勻漿蛋白樣品,用SDS-PAGE分離,然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上,于5%牛血清白蛋白中室溫封閉1 h;再用抗P65抗體、抗cleaved caspase-3抗體和抗GAPDH抗體(1∶1 000)孵育,于4℃過夜;洗膜后再用Ⅱ抗孵育(37℃,1 h),再次洗膜后發(fā)光并使用Image Lab軟件分析結(jié)果。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值。
2.6ELISA檢測TNF-α和IL-6的含量4周后,取大鼠腹主靜脈血5 mL,離心后分離血清,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作,取出實驗板條,加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測血清樣品,37℃孵育2 h,PBS洗板,加入檢測A溶液100 μL至各孔,37℃孵育1 h;棄去孔內(nèi)液體,加入檢測B溶液100 μL至各孔,37℃孵育30 min,棄去孔內(nèi)液體,洗板,加入底物TMB,覆膜避光37℃孵育20 min,每孔加入50 μL終止液,混勻后在酶標(biāo)儀450 nm波長處測量各孔的吸光度()值。
采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。參數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗,組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,多重比較用LSD檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
對術(shù)后大鼠分別靜脈注射生理鹽水、rAAV9-eGFP和rAAV9-eGFP-P65-siRNA,4周后分別取4組大鼠心肌組織,Western blot檢測P65蛋白在心肌中的表達(dá),AAC組大鼠心肌組織中P65表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組(<0.05);靜脈注射rAAV9-EGFP- P65-siRNA后,大鼠心肌組織P65的表達(dá),發(fā)現(xiàn)P65表達(dá)水平較AAC組和AAC+rAAV9-eGFP組顯著降低(<0.05),見圖1。
Figure 1. The results of Western blot for determining the protein levels of P65. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs AAC group.
術(shù)后4周測定大鼠動脈血壓。與假手術(shù)組相比, AAC組的SBP和DBP上升(<0.05),左室壓力最大上升速率及左室壓力最大下降速率均有明顯下降(<0.05);與AAC組相比, AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA組的+d/dmax和-d/dmax明顯上升(<0.05),見表1。
表1 血流動力學(xué)結(jié)果
*<0.05sham group;#<0.05AAC group.
術(shù)后4周測定體重(body weight, BW)和左心室重。與假手術(shù)組相比,AAC組、AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA組及AAC+rAAV9-eGFP組大鼠的體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(>0.05)。與假手術(shù)組比, AAC組和AAC+rAAV9-eGFP組的左心室質(zhì)量指數(shù)升高(<0.05);與AAC組比,AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA組的左心室質(zhì)量指數(shù)降低(<0.05),見表2。
表2 體重、左心室指數(shù)及血清TNF-α與IL-6的檢測結(jié)果
*<0.05sham group;#<0.05AAC group.
術(shù)后4周取心室測量心室壁厚度后取部分左心包埋切片后行HE染色。與假手術(shù)組比,AAC組和AAC+rAAV9-eGFP組左心室壁明顯增厚,HE染色顯示心肌橫截面積明顯增大,而AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA組與假手術(shù)組則無明顯差異;與ACC組比,AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA組的心室壁厚度明顯降低,HE染色顯示心肌橫截面積降低,而AAC+rAAV9-eGFP組心肌橫截面積則無明顯變化,見圖2。
Figure 2. The results of HE staining. Scale bar=50 μm.
術(shù)后4周取部分左心包埋切片后行Masson染色。使用Image-ProPlus軟件,計算膠原容積分?jǐn)?shù)。顯微鏡下,心肌組織為紅色,膠原纖維為藍(lán)色。CVF=膠原纖維染色面積/切片總面積×100%。與假手術(shù)組相比,AAC組和AAC+rAAV9-eGFP組大鼠心肌細(xì)胞可見大量藍(lán)色膠原纖維沉積,出現(xiàn)明顯的心肌纖維化,CVF 明顯升高(<0.05);與AAC組相比,AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA組大鼠心肌細(xì)胞膠原沉積明顯減少,心肌纖維化程度降低,CVF明顯降低(<0.05),而AAC+rAAV9-eGFP組CVF則無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(>0.05),見圖3。
Figure 3. The results of Masson staining.The scale bar=10 μm. Mean±SD.n=9.*P<0.05 vs sham group; # P<0.05 vs AAC group.
術(shù)后4周取部分左心包埋切片后行TUNEL染色,高倍顯微鏡下計數(shù)凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量所占百分比。與假手術(shù)組相比,AAC組和AAC+rAAV9-eGFP組的凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞的比例明顯增大(<0.05);與AAC組相比,AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA組凋亡細(xì)胞數(shù)所占總細(xì)胞比例明顯降低(<0.05),而AAC+rAAV9-eGFP組的凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞的比例則無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(>0.05),見圖4。
Figure 4. The results of TUNEL staining.The scale bar=50 μm.Mean±SD.n=9.*P<0.05 vs sham group; # P<0.05 vs AAC group.
與假手術(shù)組相比,AAC組和AAC+rAAV9-eGFP組的cleaved caspase-3蛋白水平明顯升高(<0.05);與AAC組相比,AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA組的cleaved-caspase-3蛋白水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,(<0.05),而AAC+rAAV9-eGFP組的cleaved caspase-3蛋白水平無顯著變化(>0.05),見圖5。
Figure 5. The results of Western blot for determining the protein levels of cleaved caspase-3.Mean±SD.n=3.* P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs AAC group.
與假手術(shù)組相比,AAC組與AAC+rAAV9-eGFP組的TNF-α含量均有明顯升高(<0.05);AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA組與AAC組相比,TNF-α明顯降低(<0.05)。與假手術(shù)組相比,AAC組、AAC+rAAV9-eGFP組的IL-6水平均有明顯升高(<0.05);AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA組與AAC組相比,IL-6含量的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(>0.05),見表2。
心肌肥厚是壓力負(fù)荷過重的情況下,心肌總量增加,收縮力加強,使心臟得以維持正常的血循環(huán)的一種代償功能。但這種代償功能也有其不利之處,主要因為肥大的心肌需氧增加,而冠狀動脈的供血量往往不能予以滿足,造成心肌缺血,這將最后導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生[7- 8]。雖眾多研究表明NF-κB信號通路的激活與心肌肥厚等多種心血管疾病有著密切的聯(lián)系[9- 10],但其中的分子機制卻始終有待探索。在NF-κB信號通路激活中,被稱為NF-κB的p50/P65異源二聚體發(fā)揮主要的生理作用[11],且與心血管疾病密切相關(guān)[12]。有研究表明P65含有DNA結(jié)合域負(fù)責(zé)結(jié)合啟動子改變下游基因轉(zhuǎn)錄,下調(diào)P65后可提高心肌細(xì)胞抗氧化的能力[10]。本研究中壓力超負(fù)荷組大鼠P65含量明顯高于正常組。因此,P65很可能成為治療壓力超負(fù)荷性心功能不全的有效靶標(biāo)。
高血壓是心血管疾病最普遍的病理刺激因素之一[13],因此壓力負(fù)荷型模型常用于心血管疾病的研究[14],其中腹主動脈縮窄模型為壓力負(fù)荷模型中較為理想的一種。有研究證實rAAV9-eGFP對心肌有極強的靶向親和力,可長期穩(wěn)定地表達(dá)外源基因[15]。高效特異性的RNAi 技術(shù)作為新興的基因阻斷技術(shù)具有傳統(tǒng)反義技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢。據(jù)此,本研究通過建立腹主動脈縮窄模型復(fù)制壓力超負(fù)荷動物模型,觀察rAAV-9 介導(dǎo) siRNA 靶向干預(yù)大鼠心肌細(xì)胞基因表達(dá)載體對壓力超負(fù)荷大鼠左心室的影響。本研究中,行腹主動脈結(jié)扎術(shù)后4周大鼠與正常組比較,表現(xiàn)明顯呼吸困難、收縮壓和舒張壓明顯上升、左心室心功能明顯下降、心臟肥大,左心室纖維化嚴(yán)重,心肌凋亡明顯。與假手術(shù)組比較感染rAAV9-eGFP-P65-siRNA組大鼠左心室P65含量明顯降低,表明腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)能有效沉默。
本研究發(fā)現(xiàn),與未感染和感染rAAV9-eGFP組大鼠相比,感染rAAV9-eGFP-P65-siRNA組大鼠左室壓力最大上升速率和左室壓力最大下降速率均明顯上升、左心室質(zhì)量指數(shù)下降,膠原沉著減少,心肌凋亡數(shù)量減少。這說明干預(yù)大鼠心肌細(xì)胞基因表達(dá)可改善壓力超負(fù)荷大鼠左心室功能,緩解心臟肥大、心肌纖維化并減少心肌凋亡,對壓力超負(fù)荷大鼠左心功能具有保護(hù)作用。
越來越多的研究表明,NF-κB信號通路的激活會導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥,從而導(dǎo)致組織損傷,引起器官功能障[16-17]。抑制NF-κB信號通路活性可抑制炎性細(xì)胞因子,如TNF-α和IL-6的釋放[18]。炎癥反應(yīng)被證明在心力衰竭等心血管疾病的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用[19]。因此抑制大鼠心肌細(xì)胞基因可能通過抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放進(jìn)而緩解壓力超負(fù)荷大鼠各種病理表現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn),與未感染和感染rAAV9-eGFP組大鼠相比,感染rAAV9-eGFP-P65-siRNA組大鼠血清中TNF-α含量明顯下降,而IL-6則無統(tǒng)計學(xué)意義的變化。表明抑制大鼠心肌細(xì)胞基因可能通過抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α的釋放,進(jìn)而對壓力超負(fù)荷大鼠左心功能起到保護(hù)作用。
有研究表明心肌細(xì)胞敲除可促進(jìn)壓力過負(fù)荷引起的心肌肥大并向心衰發(fā)展[20]。在該研究中選用的動物模型為12周齡,且壓力過載6周的經(jīng)多次雜交而形成的心肌細(xì)胞特異性無P65表達(dá)的小鼠。此種動物模型雖有較強的心肌P65缺失特異性,但大周齡且長時間的壓力過載更利于氧化應(yīng)激的形成從而加劇不可逆性心肌損傷及心力衰竭的嚴(yán)重程度從而觸發(fā)相關(guān)信號通路對P65的調(diào)節(jié)功能有一定影響;此外,經(jīng)多次雜交后的小鼠模型的生理特性與本實驗選用SD大鼠有一定差異。本實驗中選用6周齡壓力過載4周大鼠和對心肌有較強靶向作用的rAAV9-eGFP靶向干預(yù)P65,雖一定程度上減輕了氧化應(yīng)激所致的不可逆心肌損傷及觸發(fā)相關(guān)通路的干擾卻不足以形成心力衰竭,且P65降低對其它組織的影響及對其他組織與心肌間影響的相互作用還有待進(jìn)一步研究。
綜上所述,本研究采用9型腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)建立的P65低表達(dá)壓力超負(fù)荷動物模型實驗,提示重組腺相關(guān)病毒rAAV-9 介導(dǎo) siRNA 靶向干預(yù)大鼠心肌細(xì)胞基因表達(dá)可改善壓力超負(fù)荷大鼠左心室功能,緩解心臟肥大、心肌纖維化,其機制可能與抑制炎癥細(xì)胞因子TNF-α的釋放相關(guān)。
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Effects of rAAV9-mediated siRNA forknockdown on myocardial fibrosis and apoptosis in rats with pressure overload
WANG Xu-yue, BAO Ya-li, ZHANG Tian, LING Chan, WANG Yi-ping, WU Zhen-hong, SUN Zhan
(,830011,)
To investigate the effect ofgene knock-down mediated by recombinant adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) on the cardiac function of pressure overload rat and its possible mechanism.The rat model of left ventricular hypertrophy was established by abdominal aortic coarctation(AAC). SD rats were randomly divided into sham operation group, AAC group, AAC+rAAV9-eGFP group and AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA group. The abdominal cavity was closed directly after laparotomy in the rats of sham operation group, the abdominal cavity was closed after ligation of the abdominal aorta in the rats of AAC group, and normal saline, rAAV9-eGFP and rAAV9-eGFP-P65-siRNA were injected into the tail vein 3 d after operation. After 4 weeks, the hemodynamic indexes were measured, the heart mass parameters were calculated, the degree of myocardial fibrosis was detected by Masson staining, the expression level of myocardial P65 was detected by Western blot, the degree of apoptosis was detected by TUNEL staining, and the serum contents of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) of the rats in each group were measured by ELISA.The expression of P65 in AAC group and AAC+rAAV9-eGFP group was higher than that in sham operation group, while the expression of P65 in AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA group was significantly lower than that in AAC group. The levels of systolic blood prossure (SBP), diastolic blood pressure (DBP), left ventricular weight/body weight (LVW/BW), cardiomyocyte apoptotic rate and TNF- α and IL-6 in AAC group and AAC+rAAV9-eGFP group were higher than those in sham operation group, while SBP, DBP, LVW/BW, cardiomyocyte apoptosis rate and TNF-α in AAC+rAAV9-eGFP-P65-siRNA group were significantly lower than those in AAC group. The results of Masson staining showed that the deposition of collagen in cardiac tissue in AAC group and AAC+rAAV9-eGFP group was higher than that in sham operation group, and treatment with rAAV9-eGFP-P65-siRNA alleviated hypertension-induced fibrosis.Knockdown ofgene reduces the degree of left ventricular fibrosis and apoptosis in rats with stress overload, and its mechanism is related to the regulation of NF-κB pathway and the reduction of inflammatory response.
Recombinant adeno-associated virus serotype 9; P65 protein; Hypertension; Heart failure; Myocardial fibrosis; Apoptosis
R542.2+3; R363.2
A
10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.003
1000-4718(2020)11-1938-07
2020-07-16
2020-10-27
國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81560078);新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項目(No.2019D01C207)
Tel: 0991-4365064; E-mail: sunzhan724@126.com
(責(zé)任編輯:宋延君,余小慧)