肖麗， 劉萍， 秦冰

微小RNA-142-3p靶向Rictor誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡*

肖麗， 劉萍， 秦冰△

（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510630）

探討微小RNA-142-3p （miR-142-3p）對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）進(jìn)程中人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human aortic endothelial cells，HAECs）凋亡的影響及作用機(jī)制。HAECs經(jīng)氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）作用后，采用RT-qPCR檢測(cè)miR-142-3p的表達(dá)水平。Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）和caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。使用TargetScan等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-142-3p的潛在靶基因，雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-142-3p與Rictor mRNA 3′-UTR直接靶向結(jié)合。在ox-LDL誘導(dǎo)HAECs凋亡過程中miR-142-3p表達(dá)顯著上調(diào)（<0.05，<0.01）。過表達(dá)miR-142-3p促進(jìn)HAECs凋亡，相反，抑制miR-142-3p的表達(dá)水平可以部分程度緩解ox-LDL介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，為miR-142-3p的下游靶基因，沉默基因抑制了miR-142-3p抑制物（miR-142-3p inhibitor）的抗凋亡作用。Akt/eNOS信號(hào)通路參與了miR-142-3p對(duì)ECs凋亡的調(diào)控。抑制miR-142-3p表達(dá)可促進(jìn)靶基因表達(dá)并激活A(yù)kt/eNOS信號(hào)通路從而發(fā)揮抗凋亡的內(nèi)皮保護(hù)作用。

微小RNA-142-3p；人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；Rictor；動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種炎癥性疾病，其啟動(dòng)因素為血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）損傷［1］。氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）作為AS的重要危險(xiǎn)因素之一，可以誘導(dǎo)ECs發(fā)生凋亡，繼而導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤、脂質(zhì)沉積和斑塊破裂［2］。因此，抑制ox-LDL誘導(dǎo)的ECs凋亡對(duì)AS的預(yù)防和治療有重要意義。微小RNA（microRNA， miRNA， miR）是真核生物進(jìn)化中，一種高度保守的、新穎的、內(nèi)源性的非編碼小RNA，其通過降解或轉(zhuǎn)錄抑制靶RNA，負(fù)性調(diào)控超過30％的基因表達(dá)［3］。近年來有研究報(bào)道m(xù)iR-142-3p在心肌細(xì)胞凋亡、纖維化和內(nèi)皮屏障破壞等多種心血管疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用［4］。本研究通過制備ox-LDL誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human aortic endothelial cells， HAECs）凋亡模型，探討miR-142-3p對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HAECs凋亡的作用及機(jī)制，為AS的防治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1　材料

HAECs、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基和內(nèi)皮細(xì)胞生長因子購自ScienCell；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）、總RNA提取試劑Trizol、Opti-MEM培養(yǎng)基和Lipofectamine2000購自Invitrogen； ox-LDL購自北京協(xié)生生物有限公司； miRNA陰性對(duì)照模擬物（negative control mimic， NC mimic）、miR-142-3p模擬物（miR-142-3p mimic）、miRNA陰性對(duì)照抑制物（NC inhibitor）、miR-142-3p抑制物（miR-142-3p inhibitor）、siRNA和陰性對(duì)照siRNA （NC siRNA）購自廣州銳博生物科技有限公司； LY294002、L-NAME、caspase-3活性檢測(cè)試劑盒、CCK-8檢測(cè)試劑盒和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自江蘇碧云天生物科技有限公司； MTT購自AMRESCO； TaqMan MicroRNA Assays購自Applied Biosystems； mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（SYBR?Premix Ex TaqTMII Kit）購自TaKaRa；引物由上海生工生物工程有限公司合成；Western blot實(shí)驗(yàn)中所用的Ⅰ抗［Rictor （sc-81538）、p-Akt （Ser473）（sc-514032）、Akt （sc-81434）、p-eNOS （Ser1177 ）（sc-81510）、eNOS （sc-376751）、GAPDH （sc-32233）和β-actin （sc-130065）］購自Santa Cruz；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG購自KPL；pMIR-REPORT螢光素酶報(bào)告載體購自Ambion；抗CD31抗體（ab28364）購自Abcam； Alexa Fluor 488標(biāo)記的熒光Ⅱ抗購自EarthOx。

2　方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)原代HAECs接種在含F(xiàn)BS（50 mg/L）、青/鏈霉素和生長因子的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%融合度進(jìn)行傳代，穩(wěn)定培養(yǎng)至第3～6代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞表型鑒定將細(xì)胞接種到12孔板，待細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)細(xì)胞至融合度達(dá)30%~50%。采用75%乙醇在室溫條件下固定細(xì)胞15 min， PBS洗滌3次后， 1% Triton-100室溫下破膜10 min，5% BSA室溫條件下封閉30 min。加入1∶100稀釋的抗CD31抗體4℃孵育過夜，PBS洗滌3遍，再加入1∶400稀釋的Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗兔IgG， 37℃避光孵育30 min，DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

取80%~90%融合的細(xì)胞，胰酶消化后，離心去上清，1% Triton X-100室溫破膜10 min， 5% BSA封閉30 min。加入1∶100稀釋的抗CD31抗體4℃孵育過夜， PBS清洗后再經(jīng)Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗兔IgG， 37℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和細(xì)胞處理按照說明書分別將50 nmol/L的miR-142-3p mimic和miR-142-3p inhibitor轉(zhuǎn)染至HAECs，陰性對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染NC mimic和NC inhibitor，之后再經(jīng)ox-LDL（100 mg/L）作用24 h。為檢測(cè)Akt/eNOS信號(hào)通路的作用，HAECs首先經(jīng)過生理鹽水、LY294002（20 μmol/L）或L-NAME（100 μmol/L）處理2 h，之后轉(zhuǎn)染miR-142-3p inhibitor或NC inhibitor，再經(jīng)ox-LDL（100 mg/L）作用24 h。救援實(shí)驗(yàn)：HAECs中分別共轉(zhuǎn)染miR-142-3p inhibitor和50 μmol/L Rictor siRNA或NC siRNA，之后再經(jīng)ox-LDL（100 mg/L）作用24 h。

2.4caspase-3活性檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡首先將待檢測(cè)的各組細(xì)胞密度調(diào)整為5×106/L，離心棄掉上清液，使用PBS洗滌2次，加入100 μL裂解緩沖液，冰上放置15 min，渦旋振蕩15 s，離心5 min。取10 μL蛋白上清液，加入90 μL caspase-3活性檢測(cè)液，再加入10 μL Ac-LEHD-pNA，避光反應(yīng)1~2 h后檢測(cè)結(jié)果。

將HAECs懸液以1×109/L的濃度接種至6孔板，收集經(jīng)不同處理后的細(xì)胞并用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。Annexin V-FITC+PI-細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，凋亡率（%）=早期凋亡細(xì)胞數(shù)/所檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.5CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力HAECs接種于96孔板，每孔100 μL，將培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，在不同處理組的每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后在450 nm波長下于酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度（）值。每個(gè)樣品重復(fù)5次。

2.6RT-qPCR檢測(cè)miRNA的水平Trizol提取總RNA，采用TaqMan MicroRNA Assay Kits在7900HT實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上檢測(cè)各組樣本中miR-142-3p的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參照，相對(duì)表達(dá)量按照2-ΔΔCt法計(jì)算。miR-142-3p的正向引物序列為5'-GGGTGTAGTGTTTCCTACTT-3'，反向引物序列為5'-TTTGGCACTAGCACATT-3'； U6的正向引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

2.7Western blot檢測(cè)蛋白水平提取各細(xì)胞樣本總蛋白，定量，與上樣緩沖液按比例混勻，100℃水浴加熱5 min，經(jīng)8% SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上， 5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入Ⅰ抗， 4℃孵育過夜， TBST洗滌3次，每10 min換液1次；加入Ⅱ抗， 37℃孵育45 min， TBST洗滌3次，每15 min換液1次，在暗室中壓片，然后顯影、定影。

2.8RT-qPCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)Trizol提取各組細(xì)胞樣本的總RNA，以β-actin為內(nèi)參照，檢測(cè)各樣本Rictor的mRNA表達(dá)水平。兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序?yàn)椋?95℃預(yù)變性30 s； 95℃ 5 s， 60℃ 30 s， 40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各樣本相對(duì)表達(dá)量。Rictor的正向引物為5'-GGAAGCCTGTTGATGGTGAT-3'，反向引物序列為5'-GGCAGCCTGTTTATGGTGT-3';GAPDH的正向引物序列為5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，反向引物序列為5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'。

2.9雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示miR-142-3p與Rictor的3'-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，將含有結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)的Rictor 3'-UTR片段分別插入螢光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建野生型載體pMIR-Rictor-3'-UTR與突變型載體pMIR-Rictor-3'-UTR Mutant，取生長狀態(tài)良好的HAECs，分別將pMIR-Rictor-3'-UTR、pMIR-Rictor-3'-UTR Mutant與NC mimic、miR-142-3p mimic共轉(zhuǎn)染并置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測(cè)各組細(xì)胞的螢光素酶活性。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間比較采用方差分析，以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定

原代HAECs接種在含F(xiàn)BS、青/鏈霉素和生長因子的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%融合度時(shí)進(jìn)行傳代，穩(wěn)定培養(yǎng)至第3～6代的細(xì)胞于倒置熒光顯微鏡下觀察示，所培養(yǎng)細(xì)胞CD31表達(dá)陽性，見圖1A。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，培養(yǎng)細(xì)胞CD31陽性表達(dá)率為（98.4±0.9）%，見圖1B。這說明本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。

Figure 1.　Identification of vascular endothelial cells. A: immunofluorescence staining of CD31 in the vascular endothelial cells (×400); B: the expression of CD31 in the vascular endothelial cells was measured by flow cytometry.

2　miR-142-3p在HAECs凋亡過程中表達(dá)上調(diào)

HAECs中加入ox-LDL （100 mg/L）分別培養(yǎng)不同時(shí)間（0~24 h），caspase-3活性測(cè)定和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示ox-LDL呈時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)HAECs發(fā)生凋亡（<0.05或<0.01），見圖2A、B，且細(xì)胞活力顯著下降（<0.05或<0.01），見圖2C。RT-qPCR檢測(cè)HAECs凋亡過程中miR-142-3p表達(dá)的變化，結(jié)果顯示隨著HAECs凋亡率的升高， miR-142-3p的表達(dá)逐漸上調(diào)（<0.05或<0.01），見圖2D。

Figure 2.　Effects of ox-LDL on the apoptotic and the expression of miR-142-3p in HAECs. A: caspase-3 activity of HAECs was detected; B: flow cytometric analysis of apoptosis and necrosis; C: the viability of HAECs was measured by CCK8 assay; D: relative expression level of miR-142-3p in HAECs was analyzed by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 h group.

3　Rictor是miR-142-3p在HAECs中的靶基因之一

利用生物信息學(xué)軟件（TargetScan、miRanda和miRDB）預(yù)測(cè)miR-142-3p可能的靶基因，挑選出作為下一步的研究對(duì)象。如圖3C所示，Rictor的3'-UTR含有miR-142-3p的結(jié)合位點(diǎn)，有可能是miR-142-3p的直接靶基因。為研究miR-142-3p對(duì)Rictor蛋白和mRNA表達(dá)的影響，將miR-142-3p mimic和miR-142-3p inhibitor轉(zhuǎn)染入HAECs。ox-LDL處理抑制了Rictor蛋白的表達(dá)，與miR-142-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)； miR-142-3p mimic顯著降低了Rictor蛋白的表達(dá)，而miR-142-3p inhibitor上調(diào)了Rictor蛋白的表達(dá)水平（<0.05），見圖3A。此外，miR-142-3p mimic和miR-142-3p inhibitor的轉(zhuǎn)染對(duì)Rictor mRNA的表達(dá)無明顯影響（圖3B），提示miR-142-3p有可能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-142-3p是否與Rictor mRNA的3’-UTR直接結(jié)合，我們采用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，與NC mimic組相比， miR-142-3p mimic與pMIR-Rictor-3'-UTR共同轉(zhuǎn)染后螢光素酶活性顯著降低（<0.01），而miR-142-3p mimic和pMIR-Rictor-3'-UTR Mutant共轉(zhuǎn)染組的螢光素酶活性則無明顯變化，見圖3D。這說明miR-142-3p可以通過結(jié)合Rictor 3'-UTR上的預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)直接抑制Rictor的表達(dá)，而將預(yù)測(cè)的靶位點(diǎn)突變后，miR-142-3p對(duì)Rictor的抑制作用基本消除。因此，在HAECs中是miR-142-3p的直接靶基因之一。

Figure 3.　Experimental validation of Rictor as a target gene of miR-142-3p in HAECs. The HAECs were transfected with NC mimic, miR-142-3p mimic, NC inhibitor and miR-142-3p inhibitor, and further exposed to ox-LDL at 100 mg/L for 24 h. A: the protein expression of Rictor was measured by Western blot; B: the mRNA expression of Rictor was measured by RT-qPCR; C: the putative target site of Rictor mRNA 3'-UTR was determined by computational predictions; D: the HAECs were transfected with pMIR-Rictor-3'-UTR or pMIR-Rictor-3'-UTR Mutant and miR-142-3p mimic or NC mimic, and luciferase activity was measured. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs NC mimic group; #P<0.05 vs NC mimic+ox-LDL group; △P<0.05 vs NC inhibitor group; ▲P<0.05 vs NC inhibitor+ox-LDL group.

4　下調(diào)miR-142-3p抑制HAECs的凋亡

與對(duì)照組相比，miR-142-3p過表達(dá)可以促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的HAECs凋亡，相反，轉(zhuǎn)染miR-142-3p inhibitor可顯著降低ox-LDL介導(dǎo)的HAECs凋亡（<0.05或<0.01），見圖4A、B。此外，在本實(shí)驗(yàn)中ox-LDL作用后HAECs的活力下降，過表達(dá)miR-142-3p使HAECs的活力進(jìn)一步下降，而下調(diào)miR-142-3p可以增強(qiáng)HAECs的活力（<0.05），見圖4C。

Figure 4.　Influence of miR-142-3p on apoptosis of HAECs induced by ox-LDL. A: the activity of caspase-3 was determined by luminescent substrate assays; B: the apoptosis and necrosis of HAECs were detected by flow cytometry; C: comparison of the viability of HAECs. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs NC mimic group; #P<0.05, ##P<0.01 vs NC mimic+ox-LDL group; △P<0.05, △△P<0.01 vs NC inhibitor group; ▲P<0.05 vs NC inhibitor+ox-LDL group.

5　miR-142-3p通過靶向Rictor調(diào)節(jié)HAECs凋亡

為進(jìn)一步明確基因在miR-142-3p調(diào)控HAECs凋亡中發(fā)揮的作用，我們進(jìn)行了救援實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-142-3p inhibitor上調(diào)了Rictor蛋白的表達(dá)（<0.05），而miR-142-3p inhibitor與si-Rictor共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致Rictor蛋白表達(dá)水平顯著下降（<0.01），見圖5A。caspase-3活性檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示， miR-142-3p inhibitor減輕了ox-LDL介導(dǎo)的HAECs凋亡（<0.05），而當(dāng)轉(zhuǎn)染si-Rictor抑制Rictor蛋白的表達(dá)后，miR-142-3p inhibitor的內(nèi)皮保護(hù)作用也相應(yīng)被消除（<0.05或<0.01），見圖5B、C。

Figure 5.　miR-142-3p modulated the apoptosis of HAECs by targeting Rictor. A: Rictor protein level in HAECs was decreased by transfection with si-Rictor (measured by Western blot); B: down-regulation of Rictor by si-Rictor blocked the suppressive effect of miR-142-3p inhibitor on caspase-3 activity in ox-LDL-treated HAECs; C: the apoptosis and necrosis of HAECs were detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NCinhibitor+ox-LDL group; #P<0.05, ##P<0.01 vs miR-142-3p inhibitor+NC siRNA+ox-LDL group.

6　Akt/eNOS信號(hào)通路參與了miR-142-3p對(duì)HAECs凋亡的調(diào)控

如圖6A、B所示， ox-LDL作用24 h可降低HAECs中磷酸化Akt （Ser473）和eNOS （Ser1177）水平，而抑制miR-142-3p的表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了這種趨勢(shì)；相反的，轉(zhuǎn)染miR-142-3p mimic可減弱Akt和eNOS的磷酸化（<0.05）。采用CCK-8法評(píng)估實(shí)驗(yàn)濃度的選擇性Akt阻斷劑LY294002和eNOS抑制劑L-NAME對(duì)HAECs的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比， 20 μmol/L LY294002和100 μmol/L L-NAME作用2 h對(duì)HAECs的活力無顯著影響，見圖6C。選擇性Akt阻斷劑LY294002顯著抑制了miR-142-3p inhibitor介導(dǎo)的Akt和eNOS磷酸化； eNOS抑制物L(fēng)-NAME僅減少eNOS的磷酸化而對(duì)Akt磷酸化無明顯影響，見圖6D。當(dāng)Akt/eNOS信號(hào)通路被LY294002或L-NAME阻斷后，miR-142-3p inhibitor保護(hù)HAECs免受ox-LDL誘導(dǎo)凋亡的作用也被相應(yīng)消除（<0.01），見圖6E、F。以上研究表明， miR-142-3p inhibitor對(duì)HAECs的保護(hù)作用是通過激活A(yù)kt/eNOS信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

Figure 6.　Down-regulation of miR-142-3p reduced the apoptosis of HAECs via Akt/eNOS signaling pathway activation. A and B: HAECs were exposed to ox-LDL (100 mg/L, 24 h) after miR-142-3p mimic or inhibitor transfection, and the phosphorylation of Akt and eNOS was detected by Western blot; C: HAECs were treated with LY294002 (LY, 20 μmol/L) or L-NAME (100 μmol/L) for 2 h, and the viability was measured by CCK-8 assay; D: the protein levels of Akt, p-Akt, eNOS and p-eNOS were measured by Western blot; E: the caspase-3 activity was detected by enzyme assay; F: the apoptosis and necrosis were detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NC mimic group; #P<0.05 vs NC mimic+ox-LDL group; △P<0.05, △△P<0.05 vs NC inhibitor group; ▲P<0.05，▲▲P<0.01 vs NC inhibitor+ox-LDL group; @P<0.05, @@P<0.01 vs miR-142-3p inhibitor+ox-LDL group.

討論

ECs凋亡在內(nèi)皮功能障礙和AS發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。ox-LDL是AS啟動(dòng)和發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，本研究以ox-LDL誘導(dǎo)的HAECs為模型探討AS進(jìn)程中與ECs凋亡相關(guān)的miRNAs。

近年來研究表明，miRNAs廣泛參與了血管新生、損傷、炎癥和衰老等眾多病理生理過程［5］。此外，越來越多的研究證實(shí)在AS背景下，存在很多差異表達(dá)的miRNAs調(diào)控ECs的活力和死亡［6］。尋找凋亡相關(guān)的miRNAs及其下游靶基因?yàn)檠芯縀Cs功能障礙和AS治療提供了新的策略。本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-142-3p的表達(dá)可以上調(diào)靶基因并激活A(yù)kt/eNOS信號(hào)通路從而發(fā)揮抗凋亡的內(nèi)皮保護(hù)作用。

miR-142-3p定位于人染色體17q22，已被證實(shí)在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)。例如， miR-142-3p通過靶向調(diào)控HMGB1在非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma， NSCLC）中抑制腫瘤細(xì)胞增生并誘導(dǎo)凋亡［7］。此外，miR-142-3p與心血管系統(tǒng)疾病也密切相關(guān)，在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和纖維化過程中miR-142-3p是重要的調(diào)節(jié)因子［8］。另一項(xiàng)新近研究表明，血小板來源的miR-142-3p通過血小板來源的微粒轉(zhuǎn)移至ECs，作用于下游靶基因從而誘導(dǎo)ECs凋亡［9］。與此相一致，我們研究也發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p在ox-LDL誘導(dǎo)HAECs凋亡過程中表達(dá)明顯上調(diào)。過表達(dá)miR-142-3p促進(jìn)了HAECs凋亡，而抑制miR-142-3p可以發(fā)揮抗凋亡的內(nèi)皮保護(hù)作用。ox-LDL根據(jù)作用的濃度和時(shí)間不同，可以誘導(dǎo)ECs發(fā)生凋亡、壞死和增生［10］。ox-LDL濃度小于10 mg/L可以促進(jìn)ECs增生；濃度大于50 mg/L促進(jìn)ECs凋亡；濃度大于250 mg/L主要誘導(dǎo)ECs發(fā)生壞死［11］。在本研究的實(shí)驗(yàn)條件下，100 mg/L ox-LDL作用24 h顯著抑制了HAECs的存活和生長，過表達(dá)miR-142-3p加重了這種抑制作用，而下調(diào)miR-142-3p削弱了這種抑制作用。100 mg/L ox-LDL處理（0~24） h對(duì)HAECs壞死率無顯著影響，轉(zhuǎn)染miR-142-3p inhibitor可以輕微降低細(xì)胞壞死率，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

mTOR是一種進(jìn)化上高度保守的非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶（phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase，PIKK）蛋白家族。近年來大量的研究表明，mTOR信號(hào)通路異常與衰老、2型糖尿病、腫瘤和神經(jīng)退行性疾病等多種重大疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。mTOR在生物體內(nèi)以mTOR-Raptor復(fù)合物（mTORC1）和mTOR-Rictor復(fù)合物（mTORC2）的形式存在。mTORC2是由mTOR、mLST8/GβL及Rictor（rapamycin-insensitive companion of mTOR）和mSin1（mammalian stress-activated protein kinase- interacting protein 1）組成的多蛋白激酶復(fù)合物，其中Rictor是mTORC2特異性的組成蛋白，并是其發(fā)揮生物學(xué)作用必不可少的組成部分。mTORC2的主要功能是作為蛋白激酶B（PKB/Akt）的激酶磷酸化其473位絲氨酸（Ser473），在PKB/Akt的激活中起重要作用［12］。Akt激活后可通過磷酸化下游靶蛋白eNOS、BAD caspase-9、Fox1、Fox3， YAP和MDM2發(fā)揮促進(jìn)存活和抑制凋亡作用［13］。在這些靶蛋白中，eNOS活性障礙使NO生物活性降低，導(dǎo)致AS發(fā)生。研究表明，Rictor/Akt/eNOS途徑在調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和功能障礙方面發(fā)揮重要作用。下調(diào)Rictor表達(dá)抑制Akt活化，減少了ECs增生、遷移和血管新生［14］，促進(jìn)了ECs凋亡［15］、炎癥［16］和衰老［17］。相反的，成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）［18］和14，15-環(huán)氧二十碳烯酸［17］可促進(jìn)Rictor蛋白表達(dá)及Akt磷酸化，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和衰老。ox-LDL誘導(dǎo)的ECs衰老和氧化應(yīng)激通過抑制Akt/eNOS通路實(shí)現(xiàn)［19］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-142-3p降低了Rictor的表達(dá)并抑制Akt磷酸化活化，而miR-142-3p表達(dá)抑制可以促進(jìn)Rictor蛋白的表達(dá)水平和Akt活化。進(jìn)一步采用螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)是miR-142-3p的直接靶基因之一。沉默之后miR-142-3p inhibitor的內(nèi)皮保護(hù)作用也相應(yīng)消除。ox-LDL抑制了Akt/eNOS活性，HAECs的凋亡率相應(yīng)增加。盡管miR-142-3p inhibitor增強(qiáng)了Akt/eNOS活性，加入LY294002和L-NAME減少了Akt/eNOS磷酸化，同時(shí)也逆轉(zhuǎn)了miR-142-3p inhibitor的抗凋亡作用。

綜上所述，抑制miR-142-3p可以通過激活Rictor/Akt/eNOS信號(hào)通路而緩解HAECs的凋亡。本研究為防治內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和AS提供新的治療靶點(diǎn)和思路。

［1］ Paone S， Baxter AA， Hulett MD， et al. Endothelial cell apoptosis and the role of endothelial cell-derived extracellular vesicles in the progression of atherosclerosis［J］. Cell Mol Life Sci， 2019， 76（6）：1093-1106.

［2］ Kattoor AJ， Pothineni NVK， Palagiri D， et al. Oxidative stress in atherosclerosis［J］. Curr Atheroscler Rep， 2017， 19（11）：42.

［3］ Khor ES， Wong PF. The roles of MTOR and miRNAs in endothelial cell senescence［J］. Biogerontology， 2020， 21（5）：517-530.

［4］ Zhao Z， Qu F， Liu R， et al. Differential expression of miR-142-3p protects cardiomyocytes from myocardial ischemia-reperfusion via TLR4/NFκB axis［J］. J Cell Biochem， 2020， 121（8/9）：3679-3690.

［5］譚曉勇，方丹，吳劍波，等. miR-21對(duì)血管內(nèi)皮功能及血管生成調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展［J］. 中國病理生理雜志， 2017， 33（12）：2299-2304.

Tan XY， Fang D， Wu JB， et al. Advances on studies of miR-21 in vascular endothelial function and angiogenesis ［J］. Chin J Pathophysiol， 2017， 33（12）：2299-2304.

［6］王玨，趙海蘋. MicroRNA調(diào)控缺血性及出血性腦血管病過程中免疫反應(yīng)的研究進(jìn)展［J］. 中國病理生理雜志， 2017， 33（2）：369-374.

Wang J， Zhao HP.Progress in study of immune response regulated by microRNAs in process of ischemic and hemorrhagic cerebrovascular diseases［J］. Chin J Pathophysiol， 2017， 33（2）：369-374.

［7］ Xiao P， Liu WL. MiR-142-3p functions as a potential tumor suppressor directly targeting HMGB1 in non-small-cell lung carcinoma［J］. Int J Clin Exp Pathol， 2015， 8（9）：10800-10807.

［8］ Wang Y， Ouyang M， Wang Q， et al. MicroRNA-142-3p inhibits hypoxia/reoxygenationinduced apoptosis and fibrosis of cardiomyocytes by targeting high mobility group box 1 ［J］. Int J Mol Med， 2016， 38（5）： 1377-1386.

［9］ Bao H， Yao QP， Huang K， et al. Platelet-derived miR-142-3p induces apoptosis of endothelial cells in hypertension ［J］. Cell Mol Biol （Noisy-le-grand）， 2017， 63（4）： 3-9.

［10］ Zhang Y， Xie Y， You S， et al. Autophagy and apoptosis in the response of human vascular endothelial cells to oxidized low-density lipoprotein ［J］. Cardiology， 2015， 132（1）： 27-33.

［11］ Chen XP， Xun KL， Wu Q， et al. Oxidized low density lipoprotein receptor-1 mediates oxidized low density lipoprotein-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells： role of reactive oxygen species［J］. Vascul Pharmacol， 2007， 47（1）：1-9.

［12］ Zou Z， Chen J， Yang J， et al. Targeted inhibition of Rictor/mTORC2 in cancer treatment： a new era after rapamycin［J］. Curr Cancer Drug Targets， 2016， 16（4）： 288-304.

［13］ Abeyrathna P， Su Y. The critical role of Akt in cardiovascular function［J］. Vascul Pharmacol， 2015， 74：38-48.

［14］ Aimi F， Georgiopoulou S， Kalus I， et al. Endothelial Rictor is crucial for midgestational development and sustained and extensive FGF2-induced neovascularization in the adult［J］. Sci Rep， 2015， 5：17705.

［15］ Jin YP， Valenzuela NM， Ziegler ME， et al. Everolimus inhibits anti-HLA I antibody-mediated endothelial cell signaling， migration and proliferation more potently than sirolimus［J］. Am J Transplant， 2014， 14（4）：806-819.

［16］ Barilli A， Visigalli R， Sala R， et al. In human endothelial cells rapamycin causes mTORC2 inhibition and impairs cell viability and function［J］. Cardiovasc Res， 2008， 78（3）：563-571.

［17］ Yang C， Pan S， Yan S， et al. Inhibitory effect of 14，15-EET on endothelial senescence through activation of mTOR complex 2/Akt signaling pathways［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2014， 50（5）：93-100.

［18］ Dormond O， Madsen JC， Briscoe DM. The effects of mTOR-Akt interactions on anti-apoptotic signaling in vascular endothelial cells［J］. J Biol Chem， 2007， 282（32）：23679-2386.

［19］ Yao Y， Wang Y， Zhang Y， et al. Klotho ameliorates oxidized low density lipoprotein （ox-LDL）-induced oxidative stress via regulating LOX-1 and PI3K/Akt/eNOS pathways ［J］. Lipids Health Dis， 2017， 16（1）：77-86.

MicroRNA-142-3p modulates atherosclerosis-associated endothelial cell apoptosis via targeting Rictor

XIAO Li， LIU Ping， QIN Bing

（，，510630，）

To investigate the role of microRNA-142-3p （miR-142-3p） in endothelial cell apoptosis during atherosclerosis （AS） and the underlying mechanism.Human aortic endothelial cells （HAECs） were treated with oxidized low-density lipoprotein （ox-LDL）. The expression level of miR-142-3p was detected by RT-qPCR. Apoptosis was determined via flow cytometry （FCM） and caspase-3 activity assay. Prediction of the binding site between miR-142-3p and 3’-UTR of Rictor mRNA was performed by bioinformatics analysis and confirmed by dual-luciferase reporter assay.The expression of miR-142-3p was substantially up-regulated during the ox-LDL-elicited apoptosis in HAECs （<0.05，<0.01）. Forced expression of miR-142-3p exacerbated apoptosis in HAECs whereas inhibition of miR-142-3p partly alleviated apoptotic cell death mediated by ox-LDL. Further analysis identifiedas a direct target gene of miR-142-3p， andknock-down abolished the anti-apoptotic effect of miR-142-3p inhibitor. Moreover， the Akt/endothelial nitric oxide synthase （eNOS） signaling pathway was found to mediate the beneficial effect of miR-142-3p inhibitor on endothelial cells apoptosis.Down-regulation of miR-142-3p inhibits endothelial cell apoptosis and atherosclerotic development by up-regulating the expression of Rictor and activating the Akt/eNOS signaling pathway.

MicroRNA-142-3p； Human aortic endothelial cells； Apoptosis； Rictor； Atherosclerosis

R543.5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.002

1000-4718（2020）11-1928-10

2020-05-25

2020-10-06

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 81701167）; 廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 2017A030310360）

Tel： 020-85252336； E-mail： qinbingsx@aliyun.com

（責(zé)任編輯：盧萍，宋延君）