師勤瑩，張國良，李 蓉，楊 欣，王 琳，宋建波

放射治療是惡性腫瘤的主要治療手段，多項(xiàng)研究證實(shí)，乳腺癌、霍奇金淋巴瘤、食管癌、肺癌等胸部腫瘤病人接受放射治療后，心臟不可避免受到一定劑量/體積照射，發(fā)生放射性心臟損傷，可增加腫瘤病人心血管系統(tǒng)疾病發(fā)病率和死亡率，部分抵消放射治療帶來的生存獲益[1-3]，因此，需要臨床腫瘤醫(yī)生高度關(guān)注并及時干預(yù)，改善病人預(yù)后及生存質(zhì)量。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是機(jī)體重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，多項(xiàng)研究顯示，RAS在放射性心臟損傷發(fā)生發(fā)展中有重要作用[4-5]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)是RAS系統(tǒng)的新成員，其主要生理功能是高效催化血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)轉(zhuǎn)化為血管緊張素1-7(Ang1-7)，對RAS系統(tǒng)經(jīng)典軸血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)/AngⅡ/AT1進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，可發(fā)揮保護(hù)心血管的作用[6]，近年來引起越來越多學(xué)者關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，抗錐蟲藥乙酰甘氨酸重氮氨苯脒(DIZE)是ACE2的內(nèi)源性激動劑，能提高ACE2活性，改善高血壓、心肌梗死、糖尿病心肌病、心律失常等疾病導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常，保護(hù)心臟[7-10]。本研究探討DIZE對大鼠放射性心臟損傷的作用及其機(jī)制，從而為臨床放射性心臟損傷的防治提供新思路及參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 取健康成年雄性SD大鼠60只，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，體重250～300 g，均給予標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料和潔凈自來水，自由攝取。將大鼠隨機(jī)分為3組(每組20只)，對照組：不照射；照射組：心臟接受20 Gy照射；DIZE組：心臟接受20 Gy照射，在照射前1周至照射后1個月，每日給予皮下注射DIZE 15 mg/kg。每組實(shí)驗(yàn)大鼠分別在照射后3個月及6個月隨機(jī)選擇10只處死，進(jìn)行血清酶聯(lián)免疫吸附法測定(ELISA)、組織病理及反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測。

1.2 大鼠放射性心臟損傷模型構(gòu)建 照射組及DIZE組大鼠麻醉后取仰臥位，將四肢固定于自制木板上。射野大小為2.5 cm×2.5 cm，上界為胸骨角下緣，下界為上界向劍突方向下移2.5 cm，左界以中線向左旁開1.5 cm，右界為中線向右旁開1.0 cm。制作鉛塊以保護(hù)肺及腹部器官，位置驗(yàn)證后，以直線加速器照射，6 mV的X線，照射劑量20 Gy，劑量為300 cGy/min，源皮距100 cm，劑量計算點(diǎn)深度2.5 cm。對照組鼠不進(jìn)行照射。

1.3 ELISA檢測大鼠血清AngⅡ、Ang1-7水平 嚴(yán)格按照試劑盒說明書準(zhǔn)備，加入樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃水浴鍋溫浴60 min；重復(fù)洗板3次；將底物A、B按要求加入每孔中，37 ℃避光孵育15 min。重復(fù)洗板5次；每孔加入終止液50 mL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔光密度OD值。

1.4 組織病理檢測

14.1 蘇木精-伊紅(HE)染色 大鼠心肌組織常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，厚4 μm，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察心肌及間質(zhì)形態(tài)變化。

1.4.2 CD31免疫組化染色 心肌組織切片常規(guī)脫蠟、水化及封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，按照檢測試劑說明書，滴加CD31一抗4 ℃恒溫過夜，依次滴加試劑1(聚合物輔助劑)、試劑2(辣根酶標(biāo)記抗山羊IgG多聚體)，DAB顯色，CD31陽性細(xì)胞呈棕色或褐色顆粒。顯微鏡下觀察CD31陽性細(xì)胞表達(dá)情況，計數(shù)單位面積內(nèi)CD31陽性微血管數(shù)量(×200)，隨機(jī)選取5個視野，計算平均值，即得到微血管密度(MVD)。CD31陽性微血管計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：單個內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞簇、微小血管均計數(shù)，有較厚肌層區(qū)域的血管不計數(shù)。

1.4.3 Masson染色 取心肌組織以10%甲醛固定，石蠟包埋后制備5 μm切片，脫蠟至水化，Masson染色后，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。通過全自動圖像分析系統(tǒng)對膠原進(jìn)行定量分析，計算間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)。

1.5 RT-PCR檢測心肌組織ACE2和ACE mRNA表達(dá) 按試劑盒說明以TRIzol?試劑(9108，TaKaRa，Japan)提取心肌組織總RNA。根據(jù)試劑盒提供的方案合成cDNA。引物由invitrogen公司設(shè)計并合成(引物序列見表1)。各組設(shè)置3個復(fù)孔，記錄各孔CT值，并采用2-△△CT對結(jié)果進(jìn)行分析。詳見表1。

表1 各基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 所有實(shí)驗(yàn)大鼠均順利完成整個實(shí)驗(yàn)過程。照射后3個月及6個月，照射組及DIZE組大鼠胸部及背部照射視野皮膚出現(xiàn)輕度脫毛，各組大鼠飲食、體重、精神狀態(tài)無明顯差異。

2.2 大鼠血清ELISA檢測結(jié)果 照射后3個月及6個月，照射組AngⅡ水平增高，DIZE干預(yù)后AngⅡ水平降低；與對照組比較，照射組Ang1-7未發(fā)生明顯改變，照射后6個月DIZE組Ang1-7增高。詳見圖1。

與同時間對照組比較，*P<0.05；與同時間照射組比較，#P<0.05。圖1 各組血清AngⅡ、Ang1-7比較

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞HE染色結(jié)果 與對照組比較，照射后3個月，照射組及DIZE組大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)水腫，排列紊亂，外膜下炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)改變不明顯；照射后6個月，照射組心肌損傷進(jìn)一步加重，心肌細(xì)胞出現(xiàn)水腫、空泡、溶解及萎縮改變，間質(zhì)纖維組織增生，DIZE組大鼠心肌損傷較照射組減輕。詳見圖2。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞HE染色圖像(×200)

2.4 CD31免疫組化染色結(jié)果 照射后3個月，照射組MVD較對照組明顯增加(P=0.01)，DIZE組MVD較照射組降低(P=0.015)；照射后6個月，與對照組比較，照射組和DIZE組MVD增高(P<0.01)；與照射后3個月相比，照射組照射后6個月大鼠心肌MVD未進(jìn)一步增加(P=0.77)，DIZE組MVD增加(P=0.01)。詳見表2。

表2 各組大鼠心肌MVD比較(±s) 單位：個/mm2

2.5 Masson染色結(jié)果 照射后3個月及6個月，照射組較對照組CVF均明顯增加(P<0.01)，DIZE組CVF均低于照射組(P<0.01)，高于對照組(P<0.01)。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌CVF比較(±s) 單位：%

2.6 RT-PCR心肌ACE mRNA、ACE2 mRNA檢測結(jié)果 照射后3個月，照射組和DIZE組ACE mRNA表達(dá)較對照組降低(P<0.05)；照射后3個月及6個月，DIZE組ACE2 mRNA表達(dá)明顯高于照射組及對照組，照射組和對照組ACE2 mRNA表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖3。

與同時間對照組比較，＊P<0.05；與同時間照射組比較，# P<0.05。圖3 各組大鼠心肌ACE、ACE2mRNA表達(dá)比較

3 討 論

放射性心臟損傷目前尚無特異有效的防治方法，一級預(yù)防是指改進(jìn)放療方案以減少心臟受照劑量/體積。隨著現(xiàn)代精確放療技術(shù)的應(yīng)用，如呼吸門控技術(shù)、三維適形放射治療、調(diào)強(qiáng)放射治療、容積弧形調(diào)強(qiáng)放射治療、質(zhì)子放射治療等，心臟受照劑量/體積較二維放療時代明顯減小，放射性心臟損傷發(fā)病呈下降趨勢，但心臟受照射不能完全避免，仍有部分心臟接受一定的劑量/體積照射[11]。因此，二級預(yù)防(隨訪和藥物治療)是至關(guān)重要的[12]。

本研究結(jié)果顯示，大鼠心臟照射后3個月及6個月AngⅡ水平增加，心肌損傷隨著時間延長呈進(jìn)行性加重，這與相關(guān)文獻(xiàn)報道[4-5，13]一致。阻斷AngⅡ可能是治療放射性心臟損傷的重要手段。目前，臨床研究較多的是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(angiotensin receptor blocker，ARB)，這兩類藥物理論上可抑制AngⅡ的產(chǎn)生及其生物學(xué)效應(yīng)，起到保護(hù)心肌的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，ACEI及ARB可緩解心、肺、腦的放射性損傷[14-16]。Salata等[4]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠放化療后心臟ACE表達(dá)下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，大鼠心肌照射后AngⅡ水平升高，而心肌組織ACE表達(dá)照射后3個月下調(diào)，照射后6個月與對照組相比未發(fā)生明顯改變。Yarom等[17]應(yīng)用卡托普利雖然減少了大鼠放射性心臟損傷心肌纖維化和左室毛細(xì)血管密度下降，但未阻止心功能進(jìn)行性下降。推測原因可能是存在非ACE依賴的AngⅡ生成途徑，ACEI對AngⅡ抑制是不完全的，長期服用ACEI后體內(nèi)AngⅡ水平逐步升高，產(chǎn)生ACE逃逸現(xiàn)象[18]，不能充分發(fā)揮保護(hù)心臟的作用。

RAS系統(tǒng)另外一個軸ACE2/Ang(1-7)/線粒體組裝受體的發(fā)現(xiàn)為放射性心臟損傷治療提供了新的靶點(diǎn)和思路，ACE2是該途徑的中心成分。相關(guān)研究顯示，心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生與ACE2、Ang1-7水平降低有關(guān)；ACE2基因的缺失導(dǎo)致AngⅡ水平增加、心臟缺氧誘導(dǎo)基因上調(diào)、血管炎性因子增加、膠原纖維沉積增多等，惡化高血壓、心肌梗死、冠狀動脈粥樣硬化、糖尿病心肌病等所致心功能障礙，增加了ACE2活性，進(jìn)而改善心臟功能[19-20]。目前常用的ACE2激動劑有DIZE和呫噸酮(Xanthenone，XNT)，與呫噸酮相比，DIZE具有較好的生物利用度、藥理作用和理化性質(zhì)。Badae等[21]發(fā)現(xiàn)DIZE較ACEI能較好地恢復(fù)急性心肌梗死小鼠心功能。本研究中實(shí)驗(yàn)大鼠心臟照射前至照射后1個月注射DIZE，可促進(jìn)大鼠心肌ACE2表達(dá)，降低血清AngⅡ水平，增加Ang1-7，增加微血管密度，降低間質(zhì)纖維化，改善心肌損傷。與以往文獻(xiàn)報道[22-24]心血管病變所致心肌損傷后ACE2及Ang1-7降低不同的是，本研究照射后3個月及6個月照射組大鼠心臟ACE2 mRNA、Ang1-7水平均未發(fā)生明顯改變，結(jié)合同期病理檢測，推測原因是ACE2主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞而非心肌細(xì)胞，照射后心肌微血管密度代償性增加，可抵消內(nèi)皮損傷導(dǎo)致的ACE2表達(dá)降低，Ang1-7未發(fā)生明顯改變。照射后6個月DIZE組ACE表達(dá)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；照射后6個月DIZE組心肌ACE表達(dá)較照射組呈下降趨勢，間接體現(xiàn)了DIZE對心肌的保護(hù)作用，心肌損傷減輕，間接抑制ACE的激活。

本研究中大鼠心肌受照后MVD呈代償性增加，但與照射后3個月比較，照射后6個月MVD未進(jìn)一步增長；間質(zhì)纖維化及心肌細(xì)胞損傷隨時間延長呈進(jìn)行性加重。DIZE組MVD隨時間延長呈進(jìn)行性增加，心肌間質(zhì)纖維化及心肌細(xì)胞損傷較照射組明顯減輕。結(jié)合相關(guān)研究內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)ACE2可刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移和成管能力[25]，推測DIZE能保護(hù)放射性心臟損傷的內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)照射心肌微血管生成，增加血流灌注，減輕間質(zhì)纖維化，保護(hù)受照射的心肌。

綜上所述，ACE2激動劑DIZE可促進(jìn)放射性心臟損傷大鼠心肌ACE2表達(dá)，降低AngⅡ水平，增加血清Ang1-7，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，降低間質(zhì)纖維化，改善心肌損傷，可能是治療放射性心臟損傷的有效藥物。