樊芳芳，胡曉蕓

蛋白C系統(tǒng)作為人體抗凝系統(tǒng)的重要組成部分，在血液中以無活性的酶原形式存在，保持正常機(jī)體凝血與抗凝功能平衡[1]，是體液抗凝的主要成分之一。蛋白C系統(tǒng)參與抗凝的不同階段，不僅影響蛋白C活化，而且抑制活化蛋白C活性[2-3]。Fukudome等[4]從內(nèi)皮細(xì)胞表面分離出蛋白C和活化蛋白C的結(jié)合蛋白——內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(endothelialcellprotein C receptor，EPCR)，其存在于細(xì)胞膜表面的跨膜蛋白，與蛋白C/活化蛋白C特異性結(jié)合后將其呈遞給鄰近的凝血酶/血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物，使蛋白C活化效率提高5倍，同時(shí)參與調(diào)節(jié)血液凝固反應(yīng)。EPCR有兩種存在形式，一種是內(nèi)皮細(xì)胞表面的膜聯(lián)EPCR(mEPCR)，通過與蛋白C結(jié)合增強(qiáng)蛋白C/活化蛋白C活性，提高蛋白C活化率[5]，但其本身無任何直接的抗凝活性；另一種是存在于血漿的可溶性EPCR(sEPCR)，其作用是抑制蛋白C/活化蛋白C活性[5-6]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，血漿sEPCR升高可增加動(dòng)靜脈血栓形成風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。本研究將香煙煙霧提取物(CSE)作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，觀察CSE對(duì)sEPCR表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 HUVECs株為ATCC來源細(xì)胞株，購(gòu)自上海門諜塔生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自杭州四季青公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、HEPES、胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco；青霉素、鏈霉素均購(gòu)自華北制藥股份有限公司；人sEPCR酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)自上海西唐公司。

1.2 CSE的制備 參照文獻(xiàn)[8]方法，將1個(gè)50 mL注射器驅(qū)動(dòng)裝置連續(xù)抽吸兩支過濾嘴香煙，每支煙吸5 min，以-5 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)負(fù)壓持續(xù)吸引，經(jīng)三通管另一負(fù)壓驅(qū)動(dòng)出口將產(chǎn)生的煙霧溶于50 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)制成懸液[5]，將獲得的CSE溶液通過0.22 μm微孔濾膜過濾，以除去細(xì)菌和大顆粒。將CSE-PBS緩沖液以1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4，并將獲得的儲(chǔ)備溶液濃度定義為100%的CSE，并使用PBS將溶液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需的最終濃度。每次實(shí)驗(yàn)前立即準(zhǔn)備CSE溶液。

1.3 HUVECs培養(yǎng)與分組 將含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液與HUVECs共同孵育，培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5%CO2，48 h換液1次，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)，以0.25%的胰蛋白酶消化液1∶2傳代，將傳代的細(xì)胞接種于培養(yǎng)板上，每孔約2 mL，待細(xì)胞約80%融合后可用于實(shí)驗(yàn)[5]。實(shí)驗(yàn)分為以下兩部分，①不同濃度CSE作用：分別將0%、2.5%、5.0%及10.0%的CSE與HUVECs共同孵育，8 h后收集各濃度組上清液。②同一濃度不同作用時(shí)間CSE對(duì)細(xì)胞的影響：將選出的5.0%CSE與HUVECs分別孵育0 h、4 h、8 h、12 h及24 h，并設(shè)立對(duì)照組，對(duì)照組采用相同體積的PBS同步培養(yǎng)，分別收集各組上清液。實(shí)驗(yàn)需保證各組除處理因素外其余實(shí)驗(yàn)條件均相同。每個(gè)樣本均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[1]。

1.4 ELISA檢測(cè)sEPCR含量 sEPCR標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為4 000 pg/mL、2 000 pg/mL、1 000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL，檢測(cè)過程嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

較采用單因素方差分析(ANOVA)及重復(fù)測(cè)量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HUVECs形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡下觀察HUVECs，可見細(xì)胞大量貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)不規(guī)則，呈橢圓形、多角形、扁平或梭形，為單層鵝卵石鑲嵌樣排列，細(xì)胞單層融合時(shí)呈典型的“鋪路石”樣外觀。詳見圖1。

圖1 HUVECs顯微鏡下圖像

2.2 不同濃度CSE對(duì)HUVECs表達(dá)sEPCR的影響 HUVECs與不同濃度CSE孵育8 h后，5.0%、10.0%CSE組sEPCR較0%CSE組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2.5%CSE組與0%CSE組sEPCR比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組sEPCR比較(±s) 單位：pg/mL

2.3 同一濃度不同作用時(shí)間CSE對(duì)sEPCR的影響 顯微鏡下圖像可見10.0% CSE組大部分細(xì)胞已死亡，故本研究實(shí)驗(yàn)采用5.0%CSE。5.0%CSE與HUVECs分別孵育0 h、4 h、8 h、12 h及24 h后，8 h、12 h及24 h sEPCR表達(dá)較對(duì)照組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 同一濃度不同作用時(shí)間CSE對(duì)sEPCR的影響(±s) 單位：pg/mL

3 討 論

血管內(nèi)皮是人體重要的組成部分，相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)其具有多種生理功能，可維持血管通透性、調(diào)節(jié)白細(xì)胞和血小板黏附、維持血管細(xì)胞增殖、抗凝等作用，血管內(nèi)皮既是血液和組織之間的天然屏障，也是人體最大的自分泌和旁分泌器官[1，9]，能合成和分泌多種抗凝和促凝因子，對(duì)維持凝血系統(tǒng)的平衡具有直接或間接作用，是血栓形成中重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)。血管內(nèi)皮對(duì)血液成分和血流變化敏感，較多因素和相關(guān)疾病如吸煙、高脂血癥、高血壓、糖尿病等均可引起血管內(nèi)皮功能障礙[1，10-11]，導(dǎo)致凝血和纖溶功能失衡。其中吸煙是重要的危險(xiǎn)因素之一。

香煙煙霧包含超過5 600個(gè)不同成分[12]，其中200多個(gè)確定為致癌物和呼吸道毒素。吸煙是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成，與急性冠脈綜合征和心源性猝死發(fā)生率增加有關(guān)[13]。尸檢和臨床研究表明，吸煙對(duì)受損的內(nèi)皮細(xì)胞具有直接毒性作用，對(duì)動(dòng)脈血栓的形成有重要作用，導(dǎo)致止血系統(tǒng)改變，血小板反應(yīng)性增加，與動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成有關(guān)[14-15]，血栓形成受抗凝和止血系統(tǒng)影響。然而，吸煙通過抗凝系統(tǒng)引起血栓形成的機(jī)制尚不清楚[16]。

血液凝血是一系列酶促連鎖反應(yīng)過程，其中高分子激肽原、因子Ⅴ和因子Ⅷ是血液凝血過程的限速因素。蛋白C系統(tǒng)是針對(duì)因子Ⅴ和因子Ⅷ的抑制物，在人體抗凝過程中發(fā)揮重要作用，凝血酶激活凝血過程，引起血小板活化，與內(nèi)皮細(xì)胞表面血栓調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合后，啟動(dòng)蛋白C抗凝系統(tǒng)?；罨鞍證一方面與輔因子蛋白S結(jié)合，滅活因子Ⅴa和Ⅷa，限制凝血酶產(chǎn)生；另一方面通過加速溶解組織纖維蛋白溶解酶原依賴性血凝塊，從而發(fā)揮纖溶作用。EPCR是體內(nèi)蛋白C系統(tǒng)新發(fā)現(xiàn)的成員[17]，可選擇性地表達(dá)于大血管內(nèi)皮細(xì)胞，不僅與蛋白C和活化蛋白C特異結(jié)合，提高蛋白C活化效率，還參與防御炎癥反應(yīng)和抗凋亡等過程，是近年來發(fā)現(xiàn)的在炎癥和抗凝過程中具有重要意義的多功能糖蛋白[18]。EPCR分為兩種，一種是內(nèi)皮細(xì)胞表面的膜聯(lián)EPCR，一種是血漿中sEPCR，兩者對(duì)蛋白C/活化蛋白C的親和力相同，但作用相反，sEPCR抑制蛋白C/活化蛋白C活性，抑制活化蛋白C對(duì)凝血因子Ⅴa和Ⅷ的滅活作用。

EPCR表達(dá)具有組織特異性，在胎盤、肝、肺和心肌組織呈高表達(dá)[1，19]，表明血管內(nèi)皮細(xì)胞EPCR表達(dá)水平與組織發(fā)生血栓概率有關(guān)。故本研究選擇HUVECs作為細(xì)胞模型，通過觀察不同實(shí)驗(yàn)條件CSE對(duì)體外培養(yǎng)的HUVECs表達(dá)sEPCR含量變化[1]，從細(xì)胞水平揭示吸煙對(duì)血管內(nèi)皮凝血功能的影響[16，20]。有研究表明，CSE呈劑量依賴性降低HUVECs存活率[1，21]。本研究結(jié)果顯示，10.0%CSE組HUVECs存活率與0%CSE組相比明顯下降，而5.0%CSE對(duì)HUVECs存活率基本無影響，5.0%、10.0%CSE與細(xì)胞共同孵育后，與0%CSE組相比，上清液sEPCR明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，5.0%與10.0%CSE比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2.5%CSE組與0%CSE組相比，sEPCR表達(dá)下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明高濃度CSE與細(xì)胞共同孵育后，引起內(nèi)皮細(xì)胞部分死亡，而低濃度CSE對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損害不大，與以往研究結(jié)果[1，22]一致。因此，本研究采用5.0%CSE為最佳濃度，以最佳濃度CSE孵育細(xì)胞，觀察不同時(shí)間后sEPCR含量變化，結(jié)果顯示：隨著時(shí)間延長(zhǎng)，上清液sEPCR含量逐漸增高，且不同時(shí)間5.0%CSE組sEPCR蛋白含量均高于對(duì)照組，其中8 h、12 h及24 h sEPCR表達(dá)較對(duì)照組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示CSE對(duì)HUVECs表達(dá)sEPCR的影響在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間依賴性。

綜上所述，內(nèi)皮細(xì)胞損傷與CSE作用密切相關(guān)，CSE導(dǎo)致sEPCR升高，抑制蛋白C/活化蛋白C活性，引起凝血功能障礙，從而導(dǎo)致血栓性疾病的發(fā)生，本研究為進(jìn)一步探討血栓性疾病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。