張?jiān)隽?胡先同 張迎龍 趙彥濤 李南
作者單位:100048 北京,解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心骨科
代謝型谷氨酸受體 ( GRM ) 是 G 蛋白偶聯(lián)受體超家族中的一員,其在學(xué)習(xí)、記憶、疼痛傳導(dǎo)等神經(jīng)系統(tǒng)功能中起到重要作用[1-2]。其中,代謝型谷氨酸受體 4 ( GRM4 ) 主要參與維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。近年來,GRM4 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到重視。研究表明,GRM4 在結(jié)腸癌[3]、前列腺癌[4]和多發(fā)性骨髓瘤[5]等惡性腫瘤中高表達(dá)。然而,GRM4 在骨肉瘤中的研究相對較少,并且研究結(jié)論存在一定的分歧。例如,本課題組前期報(bào)道 GRM4 的高表達(dá)與骨肉瘤的良好預(yù)后呈正相關(guān)[6],而 Yang 等[7]發(fā)現(xiàn) GRM4 的高表達(dá)與骨肉瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
本研究通過 RNA 干擾技術(shù),敲低骨肉瘤細(xì)胞株 MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞中的 GRM4 基因,并對 GRM4 基因敲低后 MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞的增殖及遷移能力進(jìn)行研究,為探究 GRM4 基因在骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移中的作用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞 ( 購自于協(xié)和細(xì)胞庫,中國 );GRM4-siRNA ( 蘇州吉瑪基因,中國 );胎牛血清 ( Gibco,10091148,美國 );DMEM 培養(yǎng)基( Gibco,11965-092,美國 );0.25% 胰酶 ( Hyclone,SH30042.01B,美國 ); 脂質(zhì)體 3000 ( Invitrogen,L3000015,美國 );Trizol 試劑 ( Invitrogen,15596026,美國 );RT 試劑盒 ( Takara,RR047A,中國 );QPCR試劑盒 ( Takara,RR820A,中國 );QPCR 引物 ( 上海生工合成,中國 );CCK8 試劑 ( 大連美倫,MA0218,中國 );Transwell ( 康寧,3422,中國 );結(jié)晶紫染色( 索萊寶,C8470,中國 )。
1. 細(xì)胞培養(yǎng)與鋪板:MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境為 37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱。2~3 天換液一次,細(xì)胞 80%~90% 融合時,進(jìn)行鋪板。將細(xì)胞消化后接種于 24 孔板中,細(xì)胞密度 5×104/ ml。
2. RNA 干擾實(shí)驗(yàn):委托蘇州吉瑪基因合成三對針對人 GRM4 的 siRNA 以便進(jìn)行有效性篩選,siRNA 序列見表1。
細(xì)胞鋪板后 24 h,進(jìn)行 RNA 干擾實(shí)驗(yàn)。取 4 個1.5 ml 離心管,每管分別加入無血清 DMEM 培養(yǎng)基150 μl,然后分別加入 siRNA1、siRNA2、siRNA3和陰性對照各 6 μl,分別標(biāo)記為 s-1、s-2、s-3 和s-N。另取 4 個 1.5 ml 離心管,每管加入無血清DMEM 培養(yǎng)基 150 μl,然后每管加入 6 μl 脂質(zhì)體3000,標(biāo)記為 L1、L2、L3、L-N。5 min 后將 L1、L2、L3和 L-N 分別與 s-1、s-2、s-3 和 s-N 混合,室溫靜置。20 min 后取出 MG-63 細(xì)胞,棄去原培養(yǎng)液,用 PBS 洗滌細(xì)胞一次,每孔加入無血清 DMEM培養(yǎng)基 400 μl,然后各組加入上述混合溶液 100 μl,空白對照組加入無血清培養(yǎng)基 500 μl。放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)后 6 h,將干擾培養(yǎng)液更換為含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基。倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。Saos2 細(xì)胞干擾實(shí)驗(yàn)同 MG-63 細(xì)胞。
3. RNA 提取及 QPCR 實(shí)驗(yàn):RNA 干擾后 72 h,用 Trizol 法提取細(xì)胞總 RNA,紫外分光光度計(jì)檢測RNA 濃度和純度,并用 RT 試劑盒將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。按照以下條件進(jìn)行 QPCR 實(shí)驗(yàn):95 ℃~30 s,95 ℃~5 s,60 ℃~34 s~40 個循環(huán)。GRM4及內(nèi)參引物序列見表2,使用 2-ΔΔCT方法計(jì)算 mRNA的相對表達(dá)量。
表1 針對 GRM4 的 siRNA 序列Tab.1 siRNA sequence for GRM4
表2 QPCR 引物序列Tab.2 QPCR primer sequences
4. GRM4 基因敲低后 MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn):MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞接種到 96 孔板,細(xì)胞密度 2×104/ ml,培養(yǎng)后 24 h,進(jìn)行 GRM4的 RNA 干擾實(shí)驗(yàn),然后繼續(xù)培養(yǎng)后 72 h,每孔加入10 μl CCK-8 溶液,37 ℃ 孵育 30 min 后,450 nm 波長下檢測吸光度,計(jì)算各組細(xì)胞增殖率,評價細(xì)胞增殖情況。
5. GRM4 基因敲低后 MG-63 細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn):MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞接種到 24 孔板,細(xì)胞密度5×104/ ml,培養(yǎng)后 24 h,進(jìn)行 GRM4 的 RNA 干擾實(shí)驗(yàn),繼續(xù)培養(yǎng)后 72 h,用 0.25% 胰酶消化細(xì)胞,然后用含 2% 胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種到Transwell 小室的上室中,Transwell 小室的下室中加入含 10% 胎牛血清的培養(yǎng)基。將 Transwell 小室放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 12 h。用 PBS 清洗 Transwell 小室的上室,然后用 4% 多聚甲醛固定細(xì)胞 15 min,用0.5% 結(jié)晶紫溶液對細(xì)胞進(jìn)行染色,棉簽擦除小室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞,然后在倒置顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)。
采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3 次,定量資料采用x-±s表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)行后 6 h,顯微鏡下可見帶有 FAM標(biāo)記的 siRNA 呈綠色的點(diǎn)狀,均勻的散布在 MG-63細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中 ( 圖1 ),表明 siRNA 能夠較好的轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)。
干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 72 h 后,QPCR 結(jié)果表明,陰性對照組 GRM4 的 mRNA 表達(dá)量與空白對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;MG-63 細(xì)胞中三個干擾組 GRM4的 mRNA 表達(dá)量分別為對照組的 55.23%、65.12%、39.86% ( 圖1 ),均明顯低于對照組 ( P<0.05 ),從中選擇干擾效率最高的 siRNA3 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Saos2細(xì)胞中三個干擾組 GRM4 的 mRNA 表達(dá)量分別為對照組的 63.89%、55.56%、38.89% ( 圖1 ),均明顯低于對照組 ( P<0.05 ),從中選擇干擾效率最高的siRNA3 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
圖1 GRM4 siRNA 轉(zhuǎn)染效果Fig.1 Transfection effect of GRM4 siRNA
MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞的 GRM4 基因敲低后,對其進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測,結(jié)果表明,GRM4 基因敲低組細(xì)胞增殖率明顯高于對照組 ( P<0.05 ) ( 圖2 )。
MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞的 GRM4 基因敲低后,使用 Transwell 小室對其進(jìn)行細(xì)胞遷移能力的檢測,結(jié)果表明,GRM4 基因敲低組遷移的細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組 ( P<0.05 ) ( 圖3 )。
谷氨酸 ( Glu ) 是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),主要負(fù)責(zé)傳遞興奮性突觸信號。Glu 可以通過其受體影響很多生理功能,例如學(xué)習(xí)、記憶等。Glu 有兩種受體:代謝型谷氨酸受體 ( GRM ) 和離子型谷氨酸受體 ( iGluR )。其中,GRM 分為 3 個亞組,亞組 I 包括 GRM1 和 GRM5,亞組 II 包括 GRM2 和 GRM3,亞組 III 包括 GRM4、GRM6、GRM7、GRM8[8]。
圖2 GRM4 基因敲低后 MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞增殖情況Fig.2 Proliferation of MG-63 cells and Saos2 cells after GRM4 gene knockdown
圖3 GRM4 基因敲低后 MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞的遷移情況Fig.3 Migration of MG-63 cells and Saos2 cells after GRM4 gene knockdown
最初的研究認(rèn)為 Glu 信號通路僅存在于神經(jīng)系統(tǒng)中,但后來證實(shí)該信號通路在骨、皮膚、心臟、肺、胰腺等非神經(jīng)組織中廣泛存在。同時有研究表明,Glu 及其受體與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Boer 等[9]發(fā)現(xiàn) GRM1 的異常表達(dá)與結(jié)節(jié)性硬化癥患者室管膜下巨細(xì)胞腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Brocke 等[10]報(bào)道GRM5 在正常腦組織中的表達(dá)比成神經(jīng)管細(xì)胞瘤患者的腦組織中少。另外,Onofrio 等[11]報(bào)道,GRM3可以在體內(nèi)和體外促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87MG 的增殖。本課題組前期研究證實(shí),GRM4 在骨肉瘤組織中有表達(dá),并且發(fā)現(xiàn)陽性表達(dá)的患者預(yù)后明顯較好[6]。然而,GRM 在腫瘤發(fā)生中的作用機(jī)制尚不明確,并且對于 GRM 特別是 GRM4 與腫瘤預(yù)后的關(guān)系,目前研究結(jié)論尚不統(tǒng)一。本研究通過 RNA 干擾技術(shù),敲低骨肉瘤細(xì)胞株 MG-63 和 Saos2 中的 GRM4 基因,并對 GRM4 基因敲低后 MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞的增殖及遷移能力進(jìn)行研究,旨在為探究 GRM4 基因在骨肉瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
本研究采用的小干擾 RNA ( siRNA ) 轉(zhuǎn)染技術(shù)已被廣泛用在抑制靶基因的表達(dá),闡明基因功能以及鑒定藥物靶點(diǎn)等方面。通過熒光示蹤及 QPCR 驗(yàn)證顯示,本研究設(shè)計(jì)的 GRM4 siRNA 的轉(zhuǎn)染及 GRM4基因的敲低效果明顯。而 GRM4 在骨腫瘤細(xì)胞中的作用通過 GRM4 基因敲低后細(xì)胞的增殖和遷移行為來驗(yàn)證。結(jié)果顯示,GRM4 基因敲低后,骨腫瘤細(xì)胞系 MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞的增殖作用顯著高于對照組,表明 GRM4 的存在抑制 MG-63 細(xì)胞和Saos2 細(xì)胞的增殖。而 GRM4 基因敲低后 MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞的遷移作用明顯增強(qiáng),表明 GRM4能夠顯著抑制 MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞的遷移。抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移是腫瘤預(yù)后良好的表現(xiàn),因此,本研究的結(jié)果與本課題組前期研究結(jié)果一致。但該結(jié)果與 Yang 等[7]的研究結(jié)果存在一定差異,因此還需更多相關(guān)的研究來確定 GRM4 與骨肉瘤預(yù)后的相關(guān)性。此外,本研究僅從 GRM4 敲低方面研究 GRM4 的作用,存在一定的局限性,后續(xù)會通過 GRM4 的過表達(dá)技術(shù),進(jìn)一步研究 GRM4 在骨腫瘤中的作用。
總之,本研究通過 RNA 干擾技術(shù),敲低骨肉瘤細(xì)胞系 MG-63 和 Saos2 細(xì)胞中的 GRM4 基因,發(fā)現(xiàn)MG-63 細(xì)胞和 Saos2 細(xì)胞的增殖和遷移行為顯著增強(qiáng),表明 GRM4 的存在能夠顯著抑制 MG-63 細(xì)胞和Saos2 細(xì)胞的增殖和遷移作用。