楚麗麗， 宛蕾**, 徐菁霞

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 藥理教研室, 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學附屬白云醫(yī)院 消化內(nèi)科， 貴州 貴陽 550014)

復方燈盞花滴丸(dengzhanhua dripping pills，F(xiàn)DD)是由含有燈盞花素活性成分的復方中藥滴丸，可用于心腦血管疾病的預防和治療[1-3]。研究報道，F(xiàn)DD可改善心梗的臨床癥狀、縮小心肌梗死范圍、抑制血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性的升高，對急性心肌梗死有一定保護作用[4]；同時，F(xiàn)DD還可顯著降低腦含水量、減輕腦組織的病理損害，顯著降低血清中LDH活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量，并且可明顯提高血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性，對急性腦缺血再灌注損傷有顯著保護作用，其機制與抗脂質(zhì)過氧化相關[5]。研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DD可對谷氨酸致大鼠原代海馬神經(jīng)元的損傷和凋亡具有保護作用，顯著提高神經(jīng)元存活率[6]；缺血性腦病缺血再灌注時可產(chǎn)生大量的活性氧自由基，引發(fā)細胞的氧化應激反應，導致細胞結(jié)構(gòu)損傷和功能代謝障礙[7-8]。本研究將FDD作用于H2O2處理的PC12細胞，觀察其對細胞存活率和形態(tài)的影響，并從細胞膜、自由基含量、脂質(zhì)過氧化能力和一氧化氮(nitric oxide,NO)水平，研究其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞株 PC12細胞系為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤分化的細胞株[9-10]，購自中科院昆明細胞庫。

1.1.2實驗藥物及試劑 FDD，貴州神奇制藥有限公司；過氧化氫(批號201001051111)，重慶川江化學試劑廠；維生素E(國藥準字H36020415)，江西天海藥業(yè)股份有限公司。四甲基偶氮唑藍(MTT，批號H20083478，北京鼎國生物技術有限責任公司)；LDH酶聯(lián)免疫試劑盒(批號20110823)、MDA酶聯(lián)免疫試劑盒(批號20111116)、SOD酶聯(lián)免疫試劑盒(批號20111005)、NO 酶聯(lián)免疫試劑盒(批號20111223)、一氧化氮合酶(nitric oxid-esynthase，iNOS)酶聯(lián)免疫試劑盒(批號20111130)，購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1FDD藥物配置 FDD溶解于DMEM高糖培養(yǎng)液中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜加壓過濾除菌后分裝，使用時用無血清DMEM培養(yǎng)基配成所需濃度(pH 7.2～7.4)。

1.2.2PC12細胞培養(yǎng) 將PC12使用含10 %胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液含青霉素100 U/L、鏈霉素100 U/L；37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待80%～90%細胞融合時用PBS清洗2次、0.25%胰酶消化0.5～1.0 min制備成單細胞懸液,以5×107/L密度傳代后接種于培養(yǎng)瓶或孔板用于實驗。

1.2.3FDD對細胞存活率的影響 將FDD配制成25.00、12.50、6.25、3.12、1.56 mg/L及0.78 mg/L的溶液，將密度為5×107/L的PC12細胞按每孔200 μL接種于96孔板中培養(yǎng)24 h后，每孔加入上述濃度的FDD溶液100 μL、繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使用MTT法測定 FDD對細胞存活率的影響。

1.2.4H2O2致細胞損傷模型建立 PC12細胞以5×107/L密度接種于96孔板中培養(yǎng)24 h后，換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h、將細胞分為空白對照組和不同濃度H2O2損傷組。空白對照組，加入200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基；H2O2損傷組，加入濃度分別為1 000、800、500、400 、300 、200 、100 及60 μmol/L H2O2溶液200 μL，每個濃度重復6個孔，在37 ℃下孵育2、4、6、12及24 h。MTT法檢測細胞存活率,在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，以確定H2O2最佳濃度和時間。

1.2.5實驗分組與藥物干預 實驗分為空白對照組、模型組、FDD低劑量組(0.78 mg/L)、中劑量組(3.12 mg/L)、高劑量組(12.5 mg/L)及陽性對照維生素E組(VitE，4.3 mg/L)[1-13]。將密度為5×107/L的PC12細胞每孔200 μL接種于96孔板中培養(yǎng)24 h、換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，空白對照組加入無血清培養(yǎng)液100 μL，F(xiàn)DD低、中、高劑量組及VitE組分別加入相應濃度試劑100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；除空白對照組外，模型組、FDD低、中、高劑量組和VitE組均加入300 μmol/L H2O2溶液200 μL于培養(yǎng)箱中孵育2 h后，檢測下列指標。

1.3 檢測指標

1.3.1FDD對H2O2致細胞損傷的影響 采用MTT法，經(jīng)H2O2氧化應激損傷2 h后，取1.2.5項下的各組細胞，棄上清液，PBS清洗一次，每孔加PBS 150 μL和MTT 20 μL，37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)后，棄上清液，每孔加二甲基亞砜150 μL后震蕩10 min，于全自動酶標儀570 nm處測定吸光度(D)值。

1.3.2PC12細胞培養(yǎng)液中LDH含量檢測 取1.2.5項下各組PC12細胞，按LDH試劑盒說明測定LDH活性，在440 nm測定D值，按下式計算LDH的活力：LDH活力(U/L)=(測定管D值-對照管D值) /(標準管D值-空白管D值)×標準管濃度(2 mmol/L)×1 000×測試前樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.3PC12細胞MDA、NO、iNOS含量及SOD活性檢測 取1.2.5項下各組細胞，細胞破碎機超聲破碎細胞，按MDA、NO及iNOS檢測試劑盒說明書，測定并計算MDA、NO及iNOS的含量；取1.2.5項下各組細胞上清培養(yǎng)液，按試劑盒說明書操作，測定細胞培養(yǎng)液中SOD活性。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 H2O2對PC12細胞存活率和細胞形態(tài)的影響

結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度的增加和作用時間的延長，PC12細胞的存活率下降。通過1.2.4 實驗選定H2O2損傷PC12建立模型的條件為300 μmol/L H2O2損傷2 h，MTT法檢測其存活率為55%，為氧化應激損傷模型最佳條件(圖1)。倒置顯微鏡下觀察，空白對照組細胞生長狀態(tài)好、透明度大、折光性強，細胞呈多角形和梭形，細胞貼壁較好，胞漿伸展，可見粗大的突起。隨著作用時間的延長，細胞突起回縮、變圓，折光性減弱，胞間空隙增大(見圖2)。但作用12 h和24 h的細胞的存活率反而升高，存活率約為70%～80%。

注：(1)本實驗選擇的H2O2最佳損傷條件圖1 不同H2O2濃度和不同作用時間對PC12細胞存活率的影響Fig.1 Effects of different concentration of H2O2 and different treatment time on PC12 cell viability

注：A為空白對照組，B為2 h，C為4 h，D為6 h，E為12 h，F(xiàn)為24 h。圖2 300 μmol/L H2O2在不同作用時間下對PC12細胞形態(tài)的影響(200×)Fig.2 Effect of 300 μmol/L H2O2 on PC12 cell morphology at indicated time points(200×)

2.2 不同濃度FDD對PC12細胞存活率的影響

經(jīng)1.2.3項下5種濃度的FDD溶液處理24 h后，MTT法檢測PC12細胞的存活率分別為(67.9±5.1)%、(66.2±9.8)%、(69.6±7.9)%、(69.7±7.3)%、(72.4±16.8)%及(81.9±17.2)%；與空白對照組比較，0.78 mg/L、3.12 mg/L、12.5 mg/L FDD處理細胞的生存率均增高(P<0.05)；但各濃度FDD組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明在此范圍內(nèi)FDD對PC12細胞無顯著毒性。因此，選擇FDD 12.5、3.12 及0.78 mg/L 3個濃度作為高、中及低劑量組進行后續(xù)分析。

2.3 FDD對H2O2損傷后PC12細胞存活率和細胞形態(tài)的影響

經(jīng)H2O2氧化應激損傷2 h后，與空白對照組比較，模型組細胞存活率下降(P<0.05)；與模型組比較，F(xiàn)DD高、中、低劑量組細胞存活率均升高(P<0.05，圖3)。FDD高、中劑量組接近Vit E組。從細胞形態(tài)上看， FDD各濃度組和Vit E組均可改善H2O2誘導的PC12細胞損傷和皺縮。見圖4。

注：(1)與空白對照組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.01。圖3 不同劑量FDD對H2O2損傷后PC12細胞存活率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of FDD on H2O2-mediated PC12 cell viability

注：A為空白對照組，B為模型損傷組，C為Vit E處理組，D為FDD低劑量組，E為FDD中劑量組，F(xiàn)為FDD高劑量組。圖4 不同劑量FDD對H2O2損傷后PC12細胞形態(tài)的影響(400×)Fig.4 Effects of different concentrations of FDD on H2O2-mediated PC12 cell morphology(400×)

2.4 FDD對H2O2損傷后PC12細胞膜通透性的影響

經(jīng)H2O2氧化應激損傷2 h后，PC12細胞細胞膜通透性發(fā)生改變。與空白對照組比較，模型組細胞上清液中LDH含量明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，F(xiàn)DD低、中、高劑量組LDH含量均降低(P<0.01，P<0.05)。見圖5。

注：與空白對照組比較，(1)P<0.05；與模型組比較，(2)P<0.01，(3)P<0.05。圖5 FDD對H2O2致PC12細胞損傷后培養(yǎng)液中LDH濃度的影響Fig.5 Effects of FDD on LDH levels in medium

2.5 FDD對H2O2損傷后PC12細胞 MDA含量和SOD活性的影響

經(jīng)H2O2氧化應激損傷2 h后，與空白對照組比較，模型組MDA含量明顯升高、SOD活性顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，F(xiàn)DD各劑量組MDA含量均明顯降低(P<0.01)，F(xiàn)DD中、高劑量組SOD活性明顯增加(P<0.01)。見圖6。

注：(1)與空白對照組比較，P<0.05；與模型組比較，(2)P<0.01。圖6 FDD對H2O2致PC12 細胞損傷后MDA活性和SOD活性的影響Fig.6 Effect of FDD on the MDA and SOD activity in H2O2 -treated PC12

2.6 FDD對H2O2損傷后PC12細胞 NO含量和iNOS活性的影響

經(jīng)H2O2氧化應激損傷2 h后，與空白對照組比較，模型組NO含量及iNOS活性增高(P<0.05)；與模型組比較， FDD各劑量組NO含量降低(P<0.01)，F(xiàn)DD高、中、低劑量組iNOS活性降低(P<0.01，P<0.05)。見圖7。

注：(1)與空白對照組比較，P<0.05；與模型組比較，(2) P<0.01，(3)P<0.05。圖7 FDD對H2O2致PC12細胞損傷后NO含量和iNOS活性的影響Fig.7 Effects of FDD on NO levels and iNOS acitivity in H2O2-treated PC12

3 討論

目前研究認為，在腦缺血病人腦微血管中，過量H2O2的產(chǎn)生可通過多種途徑誘導細胞損傷和凋亡[5-7]。FDD主要用于治療缺血性腦病，其在細胞水平的作用研究較少。本研究觀察了不同濃度FDD對PC12細胞的作用。當FDD濃度在0.78～25 mg/L，其對細胞的生長抑制作用不明顯，細胞存活率在60 %以上[14]。因此，在此范圍內(nèi)選擇低(0.78 mg/L)、中(3.12 mg/L)、高(12.5 mg/L)三個濃度，對細胞進行處理。Vit C和Vit E是目前公認的人體抗氧化防御系統(tǒng)中兩種重要的抗氧化維生素，也是目前公認的抗氧化劑和自由基清除劑[11-13]。因此，本實驗選用Vit E作為陽性對照藥物。根據(jù)結(jié)果可得不同濃度FDD處理后的PC12細胞存活率均顯著上升，高濃度FDD處理后的PC12細胞存活率接近陽性對照組，表明FDD可抵抗H2O2誘導產(chǎn)生的氧化應激損傷。

FDD緩解H2O2致氧化應激壓力的機理可能是由于對細胞膜的保護作用。LDH是一種穩(wěn)定的胞內(nèi)蛋白酶，細胞上清中LDH的活性可間接反映細胞損傷程度。結(jié)果提示，模型組經(jīng)H2O2處理后LDH含量升高，說明細胞膜通透性增加；而經(jīng)FDD處理后，F(xiàn)DD低、中、高劑量組LDH含量均顯著低于模型組，表明細胞膜受損程度減輕[15]。MDA為脂質(zhì)過氧化物終產(chǎn)物之一，其含量反映細胞脂質(zhì)過氧化及細胞受損的程度[16]。SOD作為細胞中主要的抗氧化劑，對機體的氧化和抗氧化平衡起著至關重要的作用，因此檢測SOD可以了解細胞的抗氧化能力[17]。H2O2處理后，PC12細胞發(fā)生氧化應激，出現(xiàn)膜脂質(zhì)過氧化反應，使MDA生成增加，細胞內(nèi)的自由基水平增高，從而促進作為自由基清除劑的SOD的消耗。用不同濃度的FDD預處理PC12細胞后，H2O2誘導PC12細胞的脂質(zhì)過氧化程度明顯減弱，MDA含量明顯減少，胞外SOD活性顯著增加。結(jié)果提示FDD可表現(xiàn)出抗氧化作用，從而減輕細胞氧化應激損傷[18]。NO作為生物體內(nèi)重要的信使分子和效應分子，具有神經(jīng)毒性；而一氧化氮合酶(NOS)是NO生物合成的關鍵酶，誘導型NOS(iNOS)主要表現(xiàn)出神經(jīng)毒性作用[19-20]。本研究中，模型組的NO及iNOS含量均顯著高于空白對照組，而不同劑量FDD處理后，NO水平和iNOS活性均有所降低，其中FDD高劑量組細胞內(nèi)iNOS的活性降低非常顯著。結(jié)果提示，經(jīng)FDD處理后，可通過降低NO產(chǎn)生抑制iNOS活性從而降低氧化損傷，減輕神經(jīng)毒性，對細胞產(chǎn)生保護作用。

綜上所述，在H2O2誘導PC12細胞氧化應激損傷模型中，F(xiàn)DD溶液對H2O2致PC12細胞氧化應激損傷具有保護作用，能提高PC12細胞的存活率并改善其形態(tài)。其作用機制可能與穩(wěn)定細胞膜、增強細胞清除自由基能力、提高抗脂質(zhì)過氧化能力、減少NO產(chǎn)生和抑制iNOS活性有關。