任麗， 劉婷， 吳錫驊

(禪城區(qū)中心醫(yī)院 神經內科， 廣東 佛山 528031)

動脈粥樣硬化是老年人的常見病，在全球范圍內每年約有2 000萬人死于該疾病，其主要的病理表現(xiàn)為粥樣硬化的動脈局部有高脂質積聚、纖維組織增生、多泡沫細胞和高炎癥的特征[1]。動脈粥樣硬化的形成機制十分復雜，相關研究顯示，血漿中生成大量氧化修飾的低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)是導致動脈粥樣硬化生成的主要因素，血管內皮細胞通過ox-LDL的處理可構建動脈粥樣硬化細胞模型[2-3]。內皮細胞的損傷和凋亡在動脈粥樣硬化的發(fā)病和發(fā)展中起關鍵作用，內皮細胞的損傷和凋亡會破壞內皮的完整性，使其不能發(fā)揮免疫功能以抵抗炎癥，致使斑塊不穩(wěn)定，并最終導致急性冠狀動脈閉塞和猝死[4-7]。microRNA(miRNA)是18～22個核苷酸的非編碼RNA，相關研究指出miRNA可通過靶向調控細胞凋亡途徑中的關鍵因素而成為動脈粥樣硬化發(fā)病及發(fā)展的重要調控因子[8-10]。最近一項研究指出，miR-210在閉塞性動脈硬化患者的血清樣品中過表達，而后又進一步證明了miR-210在人動脈粥樣硬化斑塊中表達上調，這些可能與動脈粥樣硬化的發(fā)生有關[11]，但其作用機制仍不清楚。本研究根據(jù)相關文獻對人主動脈內皮細胞(human aortic endothelial cells ,HAECs)進行ox-LDL處理、構建動脈粥樣硬化細胞模型，探討miR-210介導的Bcl-2下調促進動脈粥樣硬化內皮細胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人主動脈內皮細胞HAECs購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國GIBCO公司，Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司，miR-210 minic (模擬物)、miR-210 inhibitor (抑制劑)及空對照均購自廣州銳博生物技術有限公司，ox-LDL購自北京協(xié)生生物科技有限公司，qTR-PCR實驗試劑盒均采購自美國TaqMan公司，CCK-8檢測試劑盒購自美國Sigma公司，凋亡檢測試劑盒購自美國Becton-Dickinson Biosciences公司，BCA試劑盒購自碧云天生物技術研究所，一抗、二抗購自美國CST公司，Bcl-2 3′-UTR報告質粒(pRL-Bcl-2)購自美國Creative Biogene公司，Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Thermo公司,螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1分組 將HAECs在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并放置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，24 h換1次液，隔天傳代1次；取對數(shù)生長期細胞根據(jù)相關文獻[12]用或不用100 ng/L ox-LDL對細胞處理24 h，分為對照組(Control組)、動脈粥樣硬化內皮細胞模型組(ox-LDL組)、miR-210模擬物及抑制劑組，每組10個培養(yǎng)皿。

1.2.2CCK-8細胞活力實驗 根據(jù)試劑盒制造商的說明，將Control組和ox-LDL組細胞以5×107/L的密度接種在96孔板中。24 h后，加入CCK-8溶液(20 mL /孔)，在37 ℃下孵育2 h。用酶標儀測定450 nm波長處的吸光度(OD值)，并通過下列公式計算細胞活力：細胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]×100%÷[A(不加藥)-A(空白)]。

1.2.3細胞凋亡實驗 將相應組別細胞分別(5 000個細胞/孔)接種在96孔板中，24 h后收集所有細胞于離心管內，以1 000 r/min離心2次，每次離心5 min，PBS洗滌。按試劑盒說明進行AV/PI抗體孵育，20 min后使用流式細胞儀檢測，并分析細胞凋亡率。

1.2.4qRT-PCR實驗 根據(jù)試劑盒的說明，從不同細胞中提取miRNA；以miRNA為模板，應用反轉錄試劑盒進行RT-PCR合成cDNA；以合成的cDNA作為模板，按照TaqMan?MicroRNA Assays試劑盒的說明進行qPCR定量相應細胞miR-210的含量；并以GAPDH作為內源對照，引物序列如下：GAPDH上游序列為CCCATGTTCGTCATGGGTGT、下游序列為CCCATTCCCCAGCTCTCATA。miR-210上游序列為CUGUGCGUGUGACAGCGGCU、下游序列為AUUCGGCGACAGUGUGCGUG。

1.2.5Western blot實驗 收集相應細胞在蛋白裂解液中裂解30 min，在4 ℃下以12 000 r/min離心15 min；而后根據(jù)試劑盒說明定量各組細胞蛋白濃度，使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝(SDS-PAGE)電泳分離等量的蛋白質，在4 ℃的條件下進行300 mA恒流轉膜(PVDF膜)；將膜在室溫下，5%脫脂牛奶中封閉1 h，在4 ℃下用Bcl-2以及β-actin一抗過夜孵育，加入二抗在室溫下保持1 h，顯像分析。

1.2.6miRNA靶標的分析及熒光素酶報告基因檢測 使用TargetScan算法對miRNA靶標進行了分析[12]。將人主動脈內皮細胞HAECs接種在96孔板中(每孔5×104個細胞)，使用Lipofectamine 2000轉染試劑將miR-210模擬物(miR-210 mimic)、miR-210抑制劑(miR-210 inhibitor)根據(jù)試劑盒的說明分別轉染，而后再使用Lipofectamine 2000轉染試劑將0.5 μg Bcl-2 3′-UTR報告質粒(pRL-Bcl-2)轉染進經miR-210修飾的細胞中；共轉染48 h，根據(jù)說明書，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 細胞活力

通過CCK-8實驗檢測細胞活力，結果顯示，經ox-LDL處理過的HAECs細胞活力低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 ox-LDL處理后各組HAECs細胞活力Tab.1 The viability of HAECs cells after treatment with ox-LDL in each

2.2 細胞凋亡

通過AV/PI雙染法結合流式細胞術實驗檢測細胞的凋亡，結果顯示，經ox-LDL處理過的HAECs細胞的凋亡水平(51.19%±4.15%)高于對照組(15.31%±3.22%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-210抑制劑組細胞的凋亡水平(69.85±5.21)%高于miR-210模擬物組(12.79±2.15)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與Control組比較，P<0.05。圖1 各組HAECs細胞的凋亡水平Fig.1 The apoptosis levels of HAECs cells in each group

2.3 Bcl-2表達

Western blot結果顯示，經ox-LDL處理過的HAECs細胞的Bcl-2表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-210抑制劑組Bcl-2表達高于miR-210模擬物組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與Control組比較，P<0.05。圖2 各組HAECs細胞中Bcl-2表達Fig.2 Bcl-2 expression of HAECs cells in each group

2.4 miR-210表達

qRT-PCR結果顯示，與對照組(NULL)相比，轉染進miR-210模擬物(miR-210 mimic)后，miR-210表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；轉染進miR-210抑制劑(miR-210 inhibitor)后，miR-210表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組HAECs細胞的miR-210表達Tab.2 The expression of miR-210 of HAECs

2.5 不同方式轉染后HAECs細胞Bcl-2 3′-UTR的相對熒光素酶活性

通過熒光素酶報告基因檢測將Bcl-2 3′-UTR報告質粒(pRL-Bcl-2)轉染進修飾過miR-210的HAECs細胞后的熒光素酶活性，結果顯示，miR-210模擬物能抑制Bcl-2 3′-UTR報告基因的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miR-210抑制劑能提高Bcl-2 3′-UTR報告基因的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同方式轉染后HAECs細胞Bcl-2 3′-UTR的相對熒光素酶活性Tab.3 The relative luciferase activity of Bcl-2 3′-UTR of HAECs cells with different

3 討論

動脈粥樣硬化是一種復雜的中大型動脈免疫炎性疾病[13]。內皮細胞、巨噬細胞及平滑肌細胞之間的串擾協(xié)調了動脈粥樣硬化的發(fā)展[14-15]；相關研究指出，血管內皮的損傷是動脈粥樣硬化發(fā)病的第一步，而促動脈粥樣硬化因子包括高葡萄糖，血管緊張素II，氧反應性物質及通過促進內皮細胞的凋亡進一步加速了病情的發(fā)展[16-17]，其中ox-LDL的作用途徑尚不明確。最近的很多報道都指出，異常表達的miRNA參與了內皮細胞死亡或存活的調控[18]。也有研究指出，miR-210與各種心血管疾病有關[19-20]。例如相關研究提示在高脂飲食的小鼠主動脈中miR-210過表達提高了心血管疾病和胃腸道癌的發(fā)病風險[21]。也有報道說，miR-210是在急性外周缺血中調節(jié)氧化代謝和氧化應激適應性機制中的關鍵元素[22]，miR-210的過表達與調節(jié)腦缺血引起的血管生成有關[23]。研究證明miR-210是診斷動脈粥樣硬化的潛在生物標志物[24]。而本研究的結果進一步顯示了miR-210在動脈粥樣硬化中的調節(jié)機制與促進內皮細胞凋亡有關。

miR-210是一種由低氧誘導表達的miRNA，已證實miRNA-210在低氧導致的血管新生過程中表達量明顯上升，因此被稱為低氧特異性miRNA(hy-poxamir)，其表達比較穩(wěn)定。參與血管生成的內皮miR-NAs，也被稱為angiomiRs_2j，其中miR-210在細胞低氧時高表達，在組織缺血時，miR-210對調控內皮細胞血管化具有決定性的作用。有研究表明，miRNA調控內皮細胞凋亡的機制通常歸因于靶向關鍵基因或與細胞凋亡相關的關鍵途徑[25]。Bcl-2是細胞凋亡途徑中關鍵的靶基因，有抑制細胞凋亡的作用，而其表達的降低反而會提高細胞的凋亡水平[26-27]。在本研究中，HAECs細胞經ox-LDL處理構建動脈粥樣硬化細胞模型后，其細胞活力下降，凋亡水平升高，并且細胞中miR-210的表達升高，但抗凋亡關鍵蛋白Bcl-2下降，這表明動脈粥樣硬化相關的內皮細胞凋亡可能是由增強的miR-210結合并抑制Bcl-2 mRNA的翻譯而導致的Bcl-2下調所致。而后又通過生物信息學分析確認了Bcl-2是miR-210的潛在靶點，并通過實驗對其進行了進一步驗證，發(fā)現(xiàn)miR-210在動脈粥樣硬化過程中通過介導抗凋亡蛋白Bcl-2調控內皮細胞凋亡。

綜上所述，miR-210介導的Bcl-2下調促進了動脈粥樣硬化內皮細胞的凋亡。對此，靶向miR-210可作為治療動脈粥樣硬化的創(chuàng)新療法，課題組也將在后續(xù)的研究中不斷進行探索。