武麗， 張艷麗， 田艷紅， 羅培培， 劉亞林， 周儼

(1.保定市人民醫(yī)院 結(jié)核科， 河北 保定 071000； 2.重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院 婦科， 重慶 江津 402260)

結(jié)核分枝桿菌是一種兼性巨噬細胞寄生菌[1-3]，必須寄生在其它細胞內(nèi)。結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(M.Tuberculosis)引起的一種慢性傳染病，在眾多感染性疾病當(dāng)中，結(jié)核病的致死率要高于其他疾病[4]。活動性肺結(jié)核是指痰涂片陽性者，證明有結(jié)核分枝桿菌排出、病灶屬于活動期、胸片上常有斑片狀陰影或結(jié)核空洞，或者播散病灶，說明結(jié)核分枝桿菌繁殖活躍、毒力強?；顒有苑谓Y(jié)核患者體內(nèi)大量炎癥因子的表達上調(diào)、促進炎癥的級聯(lián)放大[5]，形成肺內(nèi)炎癥“瀑布”反應(yīng)，在該過程中白介素-6(Interleukin-6，IL-6)是激活單核細胞和組織巨噬細胞引起免疫反應(yīng)的重要淋巴因子，其可將前體B細胞轉(zhuǎn)化為成熟B細胞[6]。miR-96屬于微小 RNA，在結(jié)核病患者血清中表達升高，其對活動性肺結(jié)核患者體內(nèi)大量炎癥因子具有調(diào)控作用[7]。本研究探究miR-96 調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的活動性肺結(jié)核患者體內(nèi)炎性因子表達變化的機制，為活動性肺結(jié)核患者的臨床診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

純種雌性成年SD大鼠來自斯貝福生物有限公司，28～32周齡，體質(zhì)量320～350 g。小鼠抗人腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNFα)、白介素-2(Interleukin-2，IL-2)、IL-6和叉頭框蛋白P3(Forkhead box protein P3，F(xiàn)OXP3)蛋白含量單克隆一抗來自美國CST公司，相應(yīng)二抗來自碧云天公司。PBS等試劑均來源于天津標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司，miR-96基因的引物設(shè)計來自天津賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組 將30只SD大鼠隨機均分為正常組、模型組和給藥組，模型組在大鼠尾靜脈注射由結(jié)核病人痰中分離得到的結(jié)核分枝桿菌懸液0.1 mL(濃度1 g/L)，正常組注射生理鹽水0.1 mL，給藥組注射含有異煙肼的同等濃度的結(jié)核分枝桿菌菌液0.1 mL。注射由結(jié)核病人痰中分離得到的結(jié)核分枝桿菌按照結(jié)核病診斷細菌學(xué)檢驗規(guī)程檢驗鑒定，取分裂旺盛的模型菌，稀釋到200倍。

1.2.2樣本采集 于注射后72 h處死大鼠，打開大鼠胸腔并結(jié)扎大鼠肺動靜脈；洗肺后，收集支氣管肺泡灌洗液。肺左葉的一部分保留在超低溫冰箱中提取總蛋白質(zhì)和RNA，切除右肺中葉稱重(肺濕重)、56 ℃的恒溫箱中干燥72 h后再次稱重(干重)、計算濕重與干重之比(W/D)。

1.2.3結(jié)核菌菌落計數(shù) 稱取肺臟組織1 g，用生理鹽水制備菌懸液，后用硫酸消化，接種在斜面培養(yǎng)基37 ℃下培養(yǎng)5周后評價結(jié)核分枝桿菌生長情況，采用ZX-400型全自動菌落計數(shù)儀對整塊標(biāo)本的菌落的結(jié)核菌菌落進行計數(shù)。

1.2.4RT-PCR法測定基因表達量 取出部分肺部組織，用配置好的PBS沖洗3次，加入細胞裂解液在混勻機下冰浴破碎，于7 500 r/min下、于離心機中4 ℃離心15 min，收集上清液于-80 ℃下凍存，使用時沸水浴煮沸5 min，4 ℃保存。使用軟件設(shè)計細胞miR-96及β-actin上下游引物序列，選取長度小于150 bp的片段。RNA的提?。簩⒏鹘M樣本加入到離心管以后，加入Trizol試劑后加入氯仿繼續(xù)離心取上清，加入異丙酚，吸取上清取沉淀，最后用DEPC水溶解，于PCR擴增儀中擴增。上樣：將50×的TAE 稀釋為1×TAE 溶液作為溶劑，稱取瓊脂糖0.52 g，加入到1×TAE溶液當(dāng)中。微波爐加熱煮沸后加入4 μL的核酸染料，搖晃混勻。在去除DNA以后，對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為60 ℃、40 min；70 ℃、5 min、4 ℃、30 min。miR-96以及β-actin引物由天津賽默飛公司提供，miR-96：AGTCGTAGCTGTGCTGAGAA GATGCTGCTCGATATAGCAAAT，長度120 bp；β-actin：AATTGACGGCTGTAATCGATC GATGCGACGATGSSTCGCGTAA，長度115 bp。將瓊脂糖凝膠水平放入電泳槽，依次加入6 μL的DNAMaker以及目的基因PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.5Western blot法測定TNFα、IL-2、IL-6和FOXP3蛋白含量 取出部分肺部組織，用配置好的PBS沖洗3次，加入細胞裂解液在混勻機下冰浴破碎，于7 500 r/min下、于離心機中4 ℃離心15 min，收集上清液于-80 ℃下凍存，使用時沸水浴煮沸5 min，4 ℃保存。用考馬斯亮藍法檢測各管吸光值，并將各組蛋白濃度調(diào)至同樣后進行蛋白上樣。將電泳轉(zhuǎn)移后的NC膜放入孵育盒中，將凝膠接觸的表面向上放置，加入適量含有5%脫脂乳粉的PBST緩沖溶液覆蓋NC膜，于水平搖床封閉1.5 h后取出封閉后的NC膜，用PBS洗滌3次，PBST洗滌1次；用TBST緩沖液將一抗兔抗鼠IL-2、IL-6、TNFα、FOXP3以及β-actin的抗體稀釋1 000倍，將一抗工作液與NC膜充分接觸，4 ℃下孵育過夜。取出孵育一抗的NC膜，用PBS洗滌3次，PBST洗滌1次后用PBST緩沖液將二抗稀釋1 000倍，將二抗工作液逐滴加入到NC膜上，室溫孵育1 h。取出孵育二抗的NC膜，回收相應(yīng)二抗。將ECL化學(xué)發(fā)光液中A液與B液按照1 ∶1混合，并使其與暗盒中的NC膜充分接觸，使用顯影液及定影液對膠片進行顯色，拍照記錄，根據(jù)目的條帶灰度值比較差異表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量及肺葉組織干濕重

在造模以后，模型組大鼠的體質(zhì)量低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；異煙肼藥物治療組大鼠的體質(zhì)量恢復(fù)。肺組織稱重結(jié)果顯示，模型組大鼠的肺濕重、W/D低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而異煙肼治療組大鼠的肺濕重、W/D與抑制組相比恢復(fù)明顯，各指標(biāo)更接近于正常組。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及肺葉組織干濕重比較Tab.1 Comparison of rat body weights and lung dry/wet weights in each

2.2 CFU活菌計數(shù)和miR-96基因表達

正常組肺組織中無結(jié)核分枝桿菌及其它菌類。與模型組相比，給藥組肺組織CFU活菌計數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，顯示異煙肼可降低由結(jié)核病引起的活菌數(shù)。與正常組相比，模型組大鼠的miR-96基因表達量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。異煙肼給藥組的miR-96基因表達量較模型組恢復(fù)明顯，略低于正常組(P<0.05)。見表2；顯示活動性肺結(jié)核會抑制miR-96基因的表達，異煙肼可降低此抑制，從而緩解病癥。

表2 各組大鼠肺組織中CFU活菌計數(shù)和miR-96基因表達Tab.2 CFU viable counts and miR-96 gene expression in rat lung tissues in

2.3 TNFα及IL-2蛋白表達

與正常組相比，模型組大鼠肺組織中的TNFα及IL-2蛋白表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；異煙肼給藥組大鼠肺組織中的TNFα及IL-2蛋白表達量與模型組相比降低，更接近于正常組(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 各組大鼠肺組織中的TNFα及IL-2蛋白表達情況Fig.1 Expression levels of TNF α and IL-2 protein in rat lung tissues in each group

表3 各組大鼠肺組織中TNFα及IL-2蛋白表達Tab.3 Comparison of TNF α and IL-2 protein expression of rat lung tissue

2.4 IL-6和FOXP3蛋白表達

與正常組相比，模型組大鼠肺組織中的IL-6和FOXP3蛋白表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而給藥組大鼠肺組織中的IL-6和FOXP3蛋白表達恢復(fù)明顯(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠肺組織中IL-6和FOXP3蛋白表達情況Fig.2 Expression levels of IL-6 and FOXP3 protein in rat lung tissue in each group

表4 各組大鼠IL-6和FOXP3蛋白相對表達量Tab.4 Comparison of the expression levels of IL-6 and FOXP3 protein in each

3 討論

結(jié)核病通常與人類免疫密切相關(guān)，研究免疫系統(tǒng)的改變一直是結(jié)核病的研究重點。在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展過程中，存在細胞和體液免疫缺陷。參與細胞免疫反應(yīng)的細胞主要有巨噬細胞、T淋巴細胞和自然殺傷細胞[8]。菌落的數(shù)量直接反應(yīng)結(jié)核病的嚴(yán)重程度[9]，這表明，模型組的體外培養(yǎng)菌落數(shù)高于正常組，正常組基本無結(jié)核分枝桿菌生長。給藥組與模型組相比，少見結(jié)核分支桿菌生長。說明經(jīng)過治療以后患病大鼠的病癥減輕，結(jié)核治療效果明顯。微RNA與肺結(jié)核的關(guān)系已有研究，微RNA可作為促進或者抑制癌癥的基因，調(diào)控細胞凋亡[10]。在乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥患者中發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達[11]。在NIH3T3細胞中，紫外線輻射增加部分miRNA的表達，表現(xiàn)出較強的的抗腫瘤作用[12]。此外，過表達抑癌基因NGX6可降低相應(yīng)miRNA的表達，證實部分miRNA是癌癥基因[13]。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測，miR-96可能是調(diào)控IL-6的上游miRNA。本研究發(fā)現(xiàn)活動性肺結(jié)核大鼠肺組織中的miR-96下調(diào)，而異煙肼給藥組的miRNA96基因表達量較模型組恢復(fù)明顯，略低于正常組，這說明miRNA96與活動性肺結(jié)核的關(guān)聯(lián)性。

研究證實，參與結(jié)核病免疫應(yīng)答的細胞因子包括Th1型細胞因子如IL-2、IFN-α[14]，Th2型細胞因子如IL-5、IL-4，促炎細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6[15]。當(dāng)肺部受到結(jié)核分枝桿菌攻擊時，結(jié)核分枝桿菌的抗原或代謝產(chǎn)物會激活肺部巨噬細胞產(chǎn)生炎性因子(TNF-α和IL-2等)[16]。炎癥因子進一步促進肺巨噬細胞和支氣管上皮細胞產(chǎn)生IL-6。細胞因子和內(nèi)毒素激活單核吞噬細胞可誘導(dǎo)血液中TNF-α、IL-6的升高[17]。IL-6在免疫應(yīng)答、炎癥、細胞分化、凝血以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。IL-6升高可通過與IL-6受體[18]結(jié)合而誘發(fā)炎性疾病。在炎癥反應(yīng)中，IL-6可使其他炎癥細胞趨化，如中性淋巴細胞和單核吞噬細胞[19]。在本研究中，本研究檢測到活動性肺結(jié)核組肺部組織中的IL-6和蛋白表達與正常組大鼠相比明顯升高。這表明，結(jié)核分枝桿菌感染引起的肺部受損細胞激活了單核細胞和淋巴細胞，并分泌大量IL-6因子，產(chǎn)生大量抗原免疫應(yīng)答。

FOX是細胞的轉(zhuǎn)錄因子的一種[20]，激活的FOXP3與細胞周期的阻遏相關(guān)，本實驗結(jié)果表明，模型組的FOX表達量明顯高于正常組，說明結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致的巨噬細胞的凋亡是通過FOX途徑，在給予藥物治療后，F(xiàn)OX表達量明顯降低，基本接近正常水平。此外，本實驗也發(fā)現(xiàn)活動性肺結(jié)核大鼠體內(nèi)肺組織中的IL-2、TNFα蛋白表達量相應(yīng)升高。

綜合上述，miR-96和IL-6水平在一定程度上反映了肺結(jié)核的炎癥反應(yīng)和組織病變，在活動性肺結(jié)核中，miR-96、IL-6與免疫系統(tǒng)存在內(nèi)在調(diào)控關(guān)系，異煙肼的治療可降低miR-96和IL-6水平，緩解其致病作用。