潘際剛， 吳昌學， 齊曉嵐， 范海瓊， 李成， 朱衛(wèi)

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 生理學教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

2019年7月23日，砷及砷化合物被列入有毒有害水污染物名錄。貴州省屬于地方性燃煤污染型砷中毒較嚴重病區(qū)[1]，砷在神經系統(tǒng)的累積將引起活性氧的增加從而造成神經毒性損害。大腦由于不飽和脂肪酸的存在、解毒酶活性的降低等因素易遭受氧化應激損傷[2-3]，本課題組前期實驗已發(fā)現(xiàn)砷引起神經細胞的損害機制與H2S合成酶-巰基丙酮酸轉移酶(MST)表達降低有關[4]。本次實驗通過Hoechst33342/PI雙染法和流式細胞術檢測，發(fā)現(xiàn)NaHS對砷誘導的SH-SY5Y細胞凋亡有明顯拮抗效應，從而驗證外源性H2S的保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料

SH-SY5Y細胞購于美國ATCC公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Hyclone公司，NaHS、NaAsO2購于美國Sigma公司，細胞凋亡與壞死檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所，AnnexinV FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組 取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞分為對照組、NaHS組、NaAsO2(20或40 μmol/L)組及NaHS+NaAsO2(NaHS預處理30 min)組，于10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中、37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 h后，進行后續(xù)檢測。

1.2.2染色 取1.2項實驗獲得的SH-SY5Y細胞，PBS洗滌1次后取PI染色液5 μL、染色緩沖液1 mL和Hoechst33342液5 μL加入每孔。4 ℃孵育30 min進行染色，然后用PBS洗滌1次，在熒光顯微鏡下隨機選取8個視野計算凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)(每組不少于1 000個)，計算凋亡率。

1.2.3細胞凋亡實驗 取1.2項試驗獲得的SH-SY5Y細胞將1-5×106/mL細胞收集到10 mL的離心管中離心(1 000 r/min)5 min，棄去上清、用孵育緩沖液洗滌1次、等速離心5 min后，用標記溶液100 μL重懸細胞。在室溫下避光孵育10 min、再次離心5 min、緩沖液洗1次后，再加入SA-FLOUS熒光溶液4 ℃孵育20 min。流式細胞術檢測細胞凋亡，激發(fā)波長488 nm，F(xiàn)ITC熒光波長515 nm，PI熒光波長大于560 nm。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白，上樣、12%SDS-PAGE電泳、轉移至 PVDF膜上經脫脂奶粉封閉2 h后，加—抗(Cleaved caspase-12、Caspase-12和β-actin，1 ∶1 000)及二抗(1 ∶3 000、ECL顯色曝光檢測cleaved Caspase-12及Caspase-12蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Hoechst33342/PI雙染對SH-SY5Y細胞凋亡形態(tài)的影響

熒光顯微鏡檢測顯示，隨染砷濃度增加，24或48 h后SH-SY5Y 細胞核熒光染色顯著增加(P<0.05)；NaHS預處理可以逆轉20或40 μmol/L NaAsO2暴露48 h對SH-SY5Y細胞核熒光增強效應(P<0.05，圖1)；NaHS預處理對24 h同等濃度砷暴露誘導的SH-SY5Y 細胞凋亡無明顯影響(P>0.05，圖1)。

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與40 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖1 Hoechst33342/PI雙染檢測NaAsO2和NaHS對SH-SY5Y細胞的影響(200×)Fig.1 Effect of NaAsO2 and NaHS in SH-SY5Y cell apoptosis by Hoechst33342/PI double staining(200×)

2.2 NaAsO2和NaHS對細胞凋亡的影響

流式細胞術結果顯示，20和40 μmol/L NaAsO2作用24 h或48 h可濃度依賴性增加SH-SY5Y細胞的凋亡率，分別從(18.93±0.28)%升高到(37.8±1.46)%，從(33.13±0.57)%升高到(53.93±2.46)%(P<0.05，圖2)。NaHS預處理可以逆轉20和40 μmol/L NaAsO2暴露48 h對細胞凋亡率的影響，使NaAsO2誘導的凋亡率分別下降至(29.80±0.10)%和(40.53±2.94)%(P<0.05，圖2)；但對NaAsO2暴露24 h后增加的細胞凋亡無顯著影響。

注：與對照組比較，(1)P<0.05, (2)P<0.01；(3)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(4)與40 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖2 流式細胞術檢測NaAsO2和NaHS對細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of NaAsO2 and NaHS on cellular apoptosis by flow cytometric

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與NaAsO2 40 μmol/L組比較，P<0.05；A為 NaAsO2暴露24 h, B為NaAsO2暴露48 h。圖3 NaAsO2和NaHS對cleaved/Caspase-12 expresion的影響(Western blot)Fig.3 Effects of NaAsO2 and NaHS on cleaved/Caspase-12 expression levels (Western blot)

3 討論

研究報道，H2S在健康和疾病的哺乳動物細胞中發(fā)揮著各種生物調節(jié)作用[6-10]。H2S通過增強谷胱甘肽底物、合成的限速酶活性、清除活性氧等來抵抗氧化應激帶來的損害[11-14]。在本實驗中通過H2S的供體NaHS對SH-SY5Y細胞砷暴露后的神經損傷進行干預，結果表明外源性H2S能拮抗氟誘導的細胞凋亡，這與本研究前期過表達MST增加內源性H2S發(fā)揮的保護效應相一致[5]。

Hoechst33342/PI雙染法發(fā)現(xiàn)僅僅NaHS暴露48 h可降低細胞凋亡率，而流式細胞術檢測，NaHS預處理24或48 h均不影響細胞凋亡率，似乎矛盾。實際上，本研究分析可能原因是熒光雙染法鏡下拍照是局部，側重定性、形態(tài)學表現(xiàn)；而流式是針對所有細胞，側重計數(shù)、較準確，兩種檢測手段不同因此出現(xiàn)這種差別。在本實驗中，NaHS不能逆轉低濃度20 μmol/L NaAsO2造成的細胞凋亡，但卻能逆轉高濃度40 μmol/L NaAsO2引起的細胞凋亡。研究表明，砷對人胚胎肺纖維母細胞存在雙向效應，低濃度通過激活ERK1/2促進細胞生長；而高濃度則激活JNK促進細胞凋亡[15]。低濃度砷暴露的HaCat細胞通過GSK-3β/Cyclin D1,p21 and p27磷酸化促進細胞周期從G1向S/G2M期轉換、促進細胞增殖[16]。這些實驗結果提示，低濃度NaAsO2引起凋亡的機制不同于高濃度[17]，或許是不能被H2S所逆轉的一個原因。

Caspase-12是一種內質網膜結合蛋白，可以通過內質網應激多種途徑激活，是內質網應激誘導細胞凋亡的特異性的調節(jié)因子；Caspase-12一旦被激活就可以啟動下游的凋亡路徑[18-19]。本實驗中，砷暴露無論24還是48 h均可抑制Caspase-12蛋白表達；但是只有24 h砷暴露后cleaved Caspase-12表達升高，而48h砷暴露后cleaved Caspase-12蛋白表達無顯著改變，提示剪切激活的Caspase-12僅在應激早期發(fā)生改變；并且在此時間窗口內增加的cleaved Caspase-12蛋白表達可被H2S拮抗。有報道，創(chuàng)傷引起的繼發(fā)性心臟損傷時caspase-12最早激活，活性和表達在創(chuàng)傷后3 h明細升高，6 h達高峰；予caspase-12特異性抑制劑Z-ATAD-FMK則心肌凋亡明顯降低[20]。然而，本實驗發(fā)現(xiàn)，砷暴露48 h后cleaved Caspase-12未見改變，但細胞凋亡率可被H2S拮抗。有可能是過了Caspase-12激活的時間窗口所致。然而，砷暴露24 h后cleaved Caspase-12顯著增加，可被H2S拮抗，但細胞凋亡率卻未被拮抗，是何原因？目前尚不明了，有待進一步實驗加以研究。