邱煒， 黃瑾， 楊穎穎， 曾柱

(貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院, 貴州 貴陽 550025)

腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，該環(huán)境具有酸性、低氧和大量免疫抑制性細(xì)胞因子等特征[1-2]。酸性是腫瘤微環(huán)境的一個(gè)非常顯著的生物學(xué)特性，其pH介于5.8～7.4[3]。目前腫瘤微環(huán)境的酸性特性已成為抗腫瘤領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一，已經(jīng)證明改變細(xì)胞外酸性微環(huán)境能有效影響腫瘤細(xì)胞的增殖，例如升高胞外微環(huán)境pH能加速腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死[4-6]。結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致死亡率較高的一種癌癥[7-8]。目前，受益于檢測技術(shù)的提高，CRC患者獲得治療的機(jī)會(huì)增加，CRC患者的復(fù)發(fā)率以及生存率提高，給腫瘤患者的進(jìn)一步治療既提供了機(jī)會(huì)、又提出了挑戰(zhàn)。細(xì)胞生物力學(xué)特性可以反映細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，在機(jī)體免疫中具有重要意義[9-10]。因此，本研究以人體接近的pH7.3作為對(duì)照通過觀察不同pH環(huán)境對(duì)結(jié)腸癌CT26細(xì)胞生物力學(xué)特性的影響，為腫瘤微環(huán)境改變對(duì)腫瘤影響機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞(課題組保存)、10%胎牛血清(美國Gibco公司)、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、鹽酸(無錫亞盛化工有限公司)、氫氧化鈉(美國Sigma公司)、Cell Counting Kit 8(CCK8)、羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)、Triton-X100(北京索萊寶公司)。

1.1.2主要儀器 臺(tái)式低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)、細(xì)胞電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、F-4600熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)、激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)、精密酸度計(jì)(上海大普儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1不同pH培養(yǎng)基配置 pH6.5與pH7.8 RPMI-1640培養(yǎng)基分別由鹽酸與氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH7.3 RPMI-1640培養(yǎng)基配制而成。

1.2.2CT26的培養(yǎng) 液氮罐中取出凍存的腸癌CT26細(xì)胞，水浴鍋速溶，1 000 r/min離心5 min，去上清，用10%含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)。

1.2.3CT26活力檢測 當(dāng)細(xì)胞鋪板面積達(dá)約90%時(shí)，將CT26分為pH6.5、pH7.3和pH7.8組，分別加入pH6.5、pH7.3與pH7.8條件培養(yǎng)基，96孔板中培養(yǎng)(100 μL/孔)24 h，然后向培養(yǎng)板加入CCK-8溶液(10 μL/孔)，37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀450 nm波長下測量每孔吸光度，計(jì)算活細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比為細(xì)胞活力。

1.2.4CT26電泳遷移率(cell electrophoresisi mobility,EPM) 分別收集pH6.5、pH7.3與pH7.8組的CT26細(xì)胞，PBS漂洗、10%蔗糖溶液重懸，將細(xì)胞懸液加至細(xì)胞電泳小室靜止層中觀察，計(jì)算EPM[11]，以此反映細(xì)胞表面負(fù)電荷量。

1.2.5CT26細(xì)胞膜流實(shí)驗(yàn) 分別收集pH6.5、pH7.3與pH7.8條件培養(yǎng)基處理后的CT26細(xì)胞，PBS漂洗，無菌避光條件加入DPH 800 μL重懸細(xì)胞，封口、培養(yǎng)30 min，離心棄上清，PBS洗滌、PBS重懸細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)測量細(xì)胞偏振度參數(shù)，按曾柱等[9]方法計(jì)算熒光偏振度(P)。P與細(xì)胞膜流動(dòng)性呈負(fù)相關(guān)。

1.2.6絲狀肌動(dòng)蛋白(filament actin,F-actin)表達(dá) 由F-actin構(gòu)成的微絲主要通過解聚與聚合來調(diào)控細(xì)胞形態(tài)和遷移能力。分別收集pH6.5、pH7.3與pH7.8組的CT26細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，吸棄多聚甲醛，PBS漂洗，Triton-100處理，PBS漂洗，羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽處理，避光12 h，PBS漂洗，加入DAPI、PBS漂洗，加入防熒光淬滅劑油、封片，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩９簿劢辜す鈷呙栾@微鏡觀察、拍照，Imagej軟件測量細(xì)胞熒光值(F-actin表達(dá)量)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理組以隨機(jī)方式選擇3個(gè)細(xì)胞測量熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CT26的細(xì)胞活力

pH6.5和pH7.8組的CT26的細(xì)胞活力與pH7.3組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 不同pH對(duì)CT26活力的影響Fig.1 Effects of different pH on CT26 cell viability

2.2 CT26的EPM

與pH7.3組相比，pH6.5組EPM變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；pH7.8組EPM明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明堿性條件pH7.8處理能降低CT26表面的負(fù)電荷量。見圖2。

注：(1)與pH7.3組比較，P<0.05。圖2 不同pH對(duì)CT26細(xì)胞EPM的影響Fig.2 Effects of different pH on EPM of CT26 cells

2.3 CT26細(xì)胞膜流動(dòng)性

與pH7.3組CT26細(xì)胞的P值相比，pH6.5組變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；pH7.8組P值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明堿性條件pH7.8處理能降低CT26細(xì)胞膜流動(dòng)性。見圖3。

注：(1)與pH7.3組比較，P<0.05。圖3 不同pH對(duì)CT26細(xì)胞P值的影響Fig.3 Effects of different pH on P values of CT26 cells

2.4 F-actin的表達(dá)

與pH7.3組CT26的F-actin表達(dá)相比，pH6.5組F-actin的變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而pH7.8組CT26中F-actin表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：A圖為熒光圖，B圖統(tǒng)計(jì)圖；(1)與pH7.3組比較，P < 0.05。圖4 不同pH對(duì)F-actin表達(dá)的影響Fig.4 Effects of different pH on F-actin expression level

3 討論

CRC是常見的消化道惡性腫瘤，死亡率較高。在我國，隨著人民飲食結(jié)構(gòu)的改變，特別是高脂肪飲食增加而纖維食物不足的狀況日益嚴(yán)重，CRC發(fā)病率持續(xù)上升[12-13]。結(jié)腸癌由于存在高轉(zhuǎn)移率特性，使得患者確診后5年生存率很低[14]。因此，找到一種有效的結(jié)腸癌治療方法對(duì)人類來說具有重大意義。酸性是腫瘤微環(huán)境的一個(gè)非常顯著的生物學(xué)特性，其在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[15-17]。目前很多學(xué)者已經(jīng)把改變酸性微環(huán)境pH作為腫瘤治療方法來研究[4,18-22]。細(xì)胞生物力學(xué)特性在機(jī)體免疫中具有重要意義[9-10]。因此，本項(xiàng)目以細(xì)胞生物力學(xué)特性為出發(fā)點(diǎn)來研究不同pH對(duì)結(jié)腸癌CT26細(xì)胞功能的影響，為了進(jìn)一步了解pH在結(jié)腸癌治療過程中的作用提供更多理論依據(jù)。

細(xì)胞生物力學(xué)特性能反映細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，包括細(xì)胞膜電特性、滲透脆性、膜流動(dòng)性和F-actin等[10]。本文研究不同pH對(duì)CT26細(xì)胞膜電特性、膜流動(dòng)性和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響。細(xì)胞膜電特性在細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用中發(fā)揮著重要的作用，可用EPM來反映。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，堿性條件pH7.8處理能夠抑制CT26的EPM，表明pH7.8能使CT26的表面負(fù)電荷減少。人體抗原呈遞細(xì)胞表面均帶負(fù)電荷。腫瘤免疫中，CT26表面負(fù)電荷減少可能導(dǎo)致其與抗原呈遞細(xì)胞間的推斥力減少，即堿性條件pH7.8處理可能增加CT26與抗原呈遞細(xì)胞的結(jié)合作用，這可能有利于抗腫瘤免疫調(diào)控。膜流動(dòng)性是一個(gè)重要的細(xì)胞生物力學(xué)指標(biāo)，反映細(xì)胞膜脂雙層分子運(yùn)動(dòng)狀況，與細(xì)胞遷移能力相關(guān)[23]。堿性條件pH7.8處理能降低CT26的膜流動(dòng)性，提示結(jié)腸癌酸性微環(huán)境中增加pH有可能抑制腫瘤細(xì)胞膜分子運(yùn)動(dòng)。真核細(xì)胞骨架主要包括微絲、微管與中間纖維。構(gòu)成微絲的F-actin在多種結(jié)合蛋白的調(diào)控下，產(chǎn)生解聚和聚合來調(diào)控細(xì)胞的形態(tài)、偽足形成與遷移[24-26]。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堿性條件pH7.8處理使CT26的F-actin表達(dá)減少，提示堿性條件pH7.8可能通過抑制F-actin表達(dá)進(jìn)而調(diào)控CT26的遷移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)堿性條件pH7.8能抑制CT26的膜負(fù)電荷量、膜流動(dòng)性和F-actin的表達(dá)量，而酸性條件pH6.5對(duì)這幾種細(xì)胞生物力學(xué)特性無影響。