邱煒， 童璐， 黃瑾， 曾柱

(貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院, 貴州 貴陽 550025)

樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)是一種具有強大抗原攝取和處理能力的抗原提呈細胞，包括未成熟DCs(immol/Lature DCs, imDCs)以及成熟DCs(mature DCs, mDCs)兩個分化階段[1]。imDCs位于皮膚、黏膜等外周組織，主要功能為攝取和處理抗原[1]；獲得抗原后，imDCs遷移向二級淋巴組織，遷移過程中逐漸分化為mDCs[1-2]。在腫瘤免疫中，DCs遷移到淋巴結(jié)內(nèi)向初始T細胞呈遞腫瘤抗原進而誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答[3-4]，然而實際在癌癥患者體內(nèi)DCs不能有效誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答[4]。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境對DCs的遷移能力和免疫功能的影響是導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的重要原因之一[5-8]。酸性是腫瘤微環(huán)境的一個顯著的生物學(xué)特性，具有抑制機體抗腫瘤免疫、促進腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移功能[9-11]。腫瘤微環(huán)境的pH 5.8～7.4，主要來源于碳酸和乳酸[12]。除此之外，腫瘤細胞還表達空泡質(zhì)子泵和Na+/H+交換體等離子轉(zhuǎn)運體，將胞內(nèi)高代謝產(chǎn)生的大量H+泵出胞外，從而導(dǎo)致胞外微環(huán)境低pH[13-15]。目前，相關(guān)實驗分別從酸度和乳酸2個指標來研究腫瘤酸性微環(huán)境對DCs免疫功能的影響，主要是檢測對其表面分子表達的影響[11]。在腫瘤微環(huán)境中，imDCs與腫瘤抗原結(jié)合，然后遷移到淋巴結(jié)內(nèi)向初始T細胞呈遞腫瘤抗原從而引起免疫應(yīng)答，遷移過程中imDCs成熟為mDCs[3-4]。本項目通過調(diào)節(jié)酸度和乳酸來研究腫瘤酸性微環(huán)境對imDCs遷移能力和絲狀肌動蛋白(filament actin,F-actin)表達的影響，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物來源 6～8周齡雄性 C57BL/6小鼠20只，體質(zhì)量20～25 g，購自本校動物實驗中心，飼養(yǎng)于溫度(22±2)℃、無菌環(huán)境下，處理前禁食1 d。

1.1.2主要試劑和儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清(美國Gibco公司)，L-(+)-乳酸(美國Sigma公司)，重組鼠粒-巨噬細胞集落刺激因子(recombinat Mouse GM-CSF，rmGM-CSF)和重組鼠白細胞介素4(recombinat Mouse IL-4，rmIL-4；美國Biolegend公司)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)、Cell Counting Kit 8(CCK8)、羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽及Triton-X100(北京索萊寶科技有限公司)。CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)，臺式低速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1小鼠處理 小鼠麻醉處死，75%濃度酒精浸泡小鼠10 min，將小鼠放置于解剖操作臺上、固定四肢。剪下小鼠的后腿、小心剔去附著的肌肉和結(jié)締組織，取出脛骨與股骨，將其浸泡在75%濃度酒精中5 min，放入消毒過的超凈工作臺上備用。

1.2.2imDCs的誘導(dǎo)及處理 取小鼠股骨與脛骨，無菌剪刀剪斷兩端，RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集沖洗液，1 100 r/min離心5 min，棄上清、加紅細胞裂解液，1 100 r/min 離心5 min，棄上清、洗滌，含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸細胞而獲得骨髓細胞懸液。利用rmGM-CSF和rmIL-4定向誘導(dǎo)骨髓細胞7 d 獲得小鼠 imDCs后，進行酸度和乳酸處理實驗。24 h后收集處理細胞，進行后續(xù)實驗。

1.2.3細胞活力檢測 利用CCK8試劑盒檢測imDCs活力。酸度處理實驗中，imDCs分為4組，分別加pH7.3(對照)、pH6.8、pH6.5和pH5.8條件的RPMI-1640培養(yǎng)基；乳酸處理實驗中，imDCs分為4組，分別加含0(對照)、10、20和40 mmol/L乳酸的RPMI-1640培養(yǎng)基。96孔板中培養(yǎng)各組imDCs(100 μL/孔)24 h，加CCK8溶液(10 μL/孔)，37 ℃、5%CO2條件孵育2 h，用酶標儀在450 nm波長下測量各個孔吸光度。

1.2.4imDCs遷移能力檢測 采用Transwell系統(tǒng)測定imDCs的遷移能力。分別收集不同酸度(pH7.3和pH6.5)和乳酸(0和20 mmol/L)處理后的細胞，置于Transwell上室，下室放在預(yù)先加入RPMI-1640培養(yǎng)基的孔板中，37 ℃、5% CO2條件下24 h，收集 Transwell下室的細胞，細胞計數(shù)板計數(shù)，獲得的數(shù)值與所加入的細胞總數(shù)之比為細胞遷移率。

1.2.5共聚焦激光掃描顯微鏡分析 分別收集酸度(pH7.3和pH6.5)和乳酸 (0和20 mmol/L)處理后的細胞，用4%多聚甲醛常溫固定細胞20 min后吸棄，洗滌、加Triton-100、吸棄，加羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽避光染色12 h、漂洗，加DAPI避光靜置5 min、漂洗，加防熒光淬滅劑油后封片、4 ℃避光保存；使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察、拍照、并用ImageJ軟件測量細胞熒光強度(F-actin表達量)。每個處理組隨機選擇3個細胞測定熒光值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細胞活力

不同酸度處理結(jié)果顯示，處理imDCs 24 h，與pH7.3組的細胞活力相比，pH6.8和pH6.5組細胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，pH5.8組細胞活力下降(P<0.01)；乳酸處理結(jié)果顯示，與0 mmol/L組細胞活力相比，10和20 mmol/L乳酸組細胞活力的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，40 mmol/L組細胞活力明顯下降(P<0.01，圖1)。因此在后續(xù)酸度處理實驗中分別將pH7.3和pH6.5處理imDCs 24 h作為對照組和處理組，而乳酸處理實驗中分別將0和20 mmol/L濃度處理作為對照組和處理組。

注：(1)與pH7.3組比較，P<0.01；(2)與0 mmol/L組比較，P<0.01。圖1 腫瘤酸性微環(huán)境對imDCs活力的影響Fig.1 Effects of tumor acidic microenvironment on imDCs viability

2.2 imDCs遷移能力

不同pH處理imDCs 24 h，與pH7.3組相比，pH6.5組imDCs遷移率降低(P<0.05)；乳酸處理imDCs 24 h，與0 mmol/L組相比，20 mmol/L乳酸組imDCs遷移率明顯降低(P<0.01，圖2)。結(jié)果表明，腫瘤酸性微環(huán)境顯著抑制imDCs的遷移能力。

注：(1)與pH7.3組比較，P<0.05；(2)與0 mmol/L組比較，P<0.01。圖2 腫瘤酸性微環(huán)境對imDCs遷移能力的影響Fig.2 Effect of tumor acidic microenvironment on migration of imDCs

2.3 腫瘤酸性微環(huán)境抑制F-actin的表達

不同酸度處理imDCs 24 h，與pH7.3組相比，pH6.5組F-actin表達明顯降低(P<0.01，圖3)；乳酸處理imDCs 24 h，與0 mmol/L組相比，20 mmol/L乳酸組F-actin表達明顯降低(P<0.01，圖4)。結(jié)果表明，腫瘤酸性微環(huán)境顯著抑制imDCs的F-actin表達。

注：(1)與pH7.3組比較，P<0.01。圖3 酸度對imDCs 中F-actin表達的影響(600×)Fig.3 Effect of acidity on expression of F-actin in imDCs(600×)

注：(1)與0 mmol/L組比較，P<0.01。圖4 乳酸對imDCs 中F-actin表達的影響(600×)Fig.4 Effect of lactic acid on expression of F-actin in imDCs(600×)

3 討論

基于DCs在機體免疫系統(tǒng)中的重要地位，以DCs為基礎(chǔ)的抗腫瘤免疫治療已成為抗腫瘤治療手段之一，目前已開發(fā)出多種療法，然而從臨床試驗結(jié)果來看，這些療法的治療效率還不盡人意，存在許多待解決問題，包括腫瘤的免疫逃逸、腫瘤抗原的選擇和負載方法以及過繼回輸時間間隔等[1,3]。目前在尋找新的優(yōu)化DCs腫瘤疫苗的研究中，如何解除腫瘤免疫抑制進而恢復(fù)機體中DCs免疫學(xué)功能一直是待解決的重要問題[4,12]。因此，通過對腫瘤微環(huán)境中DCs生物學(xué)功能的研究，為重塑其免疫功能提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，這對抗腫瘤免疫治療來說具有重要意義。

DCs的遷移能力是發(fā)揮其免疫學(xué)功能的必要條件[1-2]。在荷瘤宿主體內(nèi)，DCs不能誘導(dǎo)有效誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答，關(guān)鍵的原因是DCs的遷移能力被抑制[3,16]。酸性微環(huán)境是多種實體腫瘤微環(huán)境的顯著特征，其在腫瘤進展中起到關(guān)鍵作用[17-21]。因此，了解酸性腫瘤微環(huán)境對DCs遷移能力的影響對進一步理解腫瘤免疫來說具有重要意義。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤酸性微環(huán)境能顯著抑制imDCs遷移，這可能是荷瘤宿主中DCs未能遷移到淋巴結(jié)進而導(dǎo)致荷瘤宿主免疫功能受損的重要原因之一。

細胞骨架在維持細胞形態(tài)有序性方面起重要作用，主要包括微管、微絲和中間纖維[22-24]。由F-actin構(gòu)成的微絲能控制細胞遷移能力[24]。F-actin 是多個球狀肌動蛋白(G-actin)亞基組成的絲狀聚合物[25]。F-actin和G-actin的動態(tài)結(jié)構(gòu)對DCs的抗原捕獲、遷移能力等功能至關(guān)重要[25-27]。在本實驗中，羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽只能特異性標記F-actin，而不是與G-actin結(jié)合。結(jié)果顯示細胞外酸性微環(huán)境使imDCs中F-actin含量顯著降低，提示酸性微環(huán)境可能使F-actin發(fā)生了解聚。由于F-actin與DCs的遷移能力密切相關(guān)，因此酸性微環(huán)境很可能通過調(diào)控F-actin聚合進而影響imDCs的遷移能力。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤酸性微環(huán)境能抑制imDCs遷移能力和F-actin的表達。