胡倩文，徐延浩，王 容，張文英，華 為，呂 超

(1.長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)湖北省重點實驗室/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 荊州 434000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所，浙江 杭州310021；3.江蘇省作物遺傳生理重點實驗室，揚州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江蘇 揚州 225009)

大麥是世界第四大谷物，主要用于飼料和釀造[1]。穗粒數(shù)、小穗密度、小穗數(shù)、穗長是影響大麥產(chǎn)量和品質(zhì)的重要穗部性狀。穗粒數(shù)是產(chǎn)量三要素之一，合適的小穗密度是決定大麥籽粒飽滿度和麥芽品質(zhì)的重要因素[2-3]，因此，研究控制大麥穗部性狀的基因位點是大麥育種工作的重要方向。

大麥長、短穗與稀、密穗均受一對基因控制，且長穗和稀穗表現(xiàn)為顯性[4]。研究者發(fā)現(xiàn)，大麥籽粒密度的變化是由microRNA172與其在轉(zhuǎn)錄因子HvAP2的mRNA相應(yīng)結(jié)合位點互相作用的結(jié)果[5]。大麥的密穗性狀被定位于7H染色體0.37 cM的區(qū)間內(nèi)[6]。已有研究報道了穗長等4個穗部性狀的相關(guān)QTLs，Wang等[2]采用連鎖分析在2H和3H染色體上檢測到2個控制穗長和籽粒密度的QTL，并在2H染色體18.9 cM和25.6 cM處檢測到2個穗粒數(shù)QTL；Baghizadeh等[7]共檢測到位于4號連鎖群上的3個穗長和位于1號連鎖群的3個小穗數(shù)的QTL位點；Wang等[8]檢測到3個穗長、4個小穗密度、2個穗粒數(shù)和6個小穗數(shù)的QTL位點。少有研究進一步鑒定大麥小穗數(shù)QTLs及其與穗粒數(shù)等穗部性狀的遺傳關(guān)聯(lián)性。

關(guān)聯(lián)分析(association analysis)是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，檢測自然群體內(nèi)目標性狀與遺傳標記或者候選基因相關(guān)關(guān)系的分析方法。關(guān)聯(lián)分析具有材料遺傳基礎(chǔ)廣泛等優(yōu)點[9]，已在水稻[10]、小麥[11]、大麥[12]等作物中挖掘了多個優(yōu)異等位基因。司二靜等[13]、賴勇等[14]、孟亞雄等[15]運用關(guān)聯(lián)分析方法，檢測到多個與大麥穗長、穗粒數(shù)、小穗密度相關(guān)的遺傳位點。但這些關(guān)于大麥穗部性狀的關(guān)聯(lián)分析在材料數(shù)量、標記數(shù)量、環(huán)境試點都較為有限[13-15]。

多種環(huán)境試驗通常用于評估基因型的性能，一些QTL對環(huán)境敏感，在不同的環(huán)境可能有不同的影響，在多個環(huán)境下鑒定產(chǎn)量性狀的穩(wěn)定QTL，對于將其應(yīng)用于標記輔助選擇至關(guān)重要。本研究以137份來源比較廣泛的大麥材料為關(guān)聯(lián)群體，利用224對SSR標記對群體進行基因型分析，并在2個環(huán)境試點下對穗粒數(shù)、小穗密度、小穗數(shù)、穗長進行關(guān)聯(lián)分析，以期為大麥穗部性狀的遺傳研究和分子標記輔助育種提供更多的信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料及其農(nóng)藝性狀的測定

供試137份大麥材料包含56份中國栽培材料、52份國外栽培材料、29份西藏半野生大麥(表1)。2017年11月上旬分別將137份材料種植于長江大學(xué)太湖(TH)試驗基地和荊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院(JN)試驗基地。采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，每試驗點設(shè)置2個重復(fù)，單個材料每個重復(fù)種植3行，行長2.0 m、行距0.25 m、株距8.0 cm，田間管理同常規(guī)。每個重復(fù)取中間行長勢一致的5個單株考察穗粒數(shù)(grain number per spike，GNS)、穗密度(spikelet density，SD)、小穗數(shù)(spikelet number per spike，SNS)、穗長(spike length，SL)。小穗密度=小穗排數(shù)/穗長。利用SPSS 19.0軟件進行各個環(huán)境下穗部性狀的統(tǒng)計和Pearson相關(guān)性分析。

表1 供試大麥材料的名稱和來源Table 1 Name and origin of barley accessions used in this study

續(xù)表1 Continued Table 1

1.2 群體基因型與遺傳多樣性分析

取三葉期新鮮幼嫩葉片，用CTAB法提取基因組DNA。用NanoDrop2000c超微量分光光度計(Thermo，美國)測定DNA濃度。本試驗中224對SSR標記引物序列及其染色體位置信息由澳大利亞默多克大學(xué)李承道教授提供。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系的試劑均購自上海博彩生物科技有限公司，擴增體系(10 μL)包含1×buffer，Mg2+0.2 mmol·L-1，dNTPs 0.2 mmol·L-1，Taq酶0.75 U·L-1，上下游引物各5 μmol·L-1，模板DNA 50 ng。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，54～61 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色[16]。以二進位制來統(tǒng)計PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，在同一電泳遷移位置上，有DNA擴增條帶記為“1”，無條帶記為“0”。

通過Popgene 32軟件統(tǒng)計分析觀測等位基因數(shù)(observed number of alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，Ne)、觀察雜合度(observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)、Shannon’s信息指數(shù)(Shannon’s Information index，I)及Nei’s基因多樣性指數(shù)(Nei’s gene diversity index，H)。利用PIC_CALC 0.6計算SSR位點多態(tài)性信息含量(polymorphism information content，PIC)。以NTSYS-pc計算遺傳相似性系數(shù)(genetic similarity coefficient，GS)，按照非加權(quán)平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)和SHAN程序?qū)ψ匀蝗后w材料進行聚類分析。

1.3 群體結(jié)構(gòu)分析

以Structure 2.3.4軟件進行貝葉斯聚類，分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)并確定最佳的群體分組(K)。K值的取值范圍為1～10，將MCMC(Markov Chain Monte Carlo)開始時的不作數(shù)迭代(length of burn-in period)設(shè)為10 000次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC設(shè)為100 000次，迭代次數(shù)(number of iterations)設(shè)置為8，參照Evanno等[17]的方法計算ΔK，確定合適的K值，并計算Q參數(shù)。

1.4 關(guān)聯(lián)分析

運用Tassel 2.1軟件一般線性模型(general linear model，GLM)和混合線性模型(mixed linear model，MLM)進行關(guān)聯(lián)分析。GLM分析將Q作為協(xié)變量進行回歸分析；MLM分析采用Q+K方法，分析方法選擇EM。利用 4個穗部性狀表型數(shù)據(jù)對分子標記逐一進行回歸分析，當(dāng)P<0.001時認為該標記與目標性狀關(guān)聯(lián)，并計算標記對表型變異的解釋率。利用MapChart 2.32通過遺傳距離繪制關(guān)聯(lián)位點在染色體上的分布。根據(jù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，通過R軟件CMplot包(https://github.com/YinLiLin/R-CMplot)繪制曼哈頓圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩試點大麥穗部性狀統(tǒng)計分析

在分析的大麥穗部性狀中(表2)，穗粒數(shù)和小穗數(shù)的變異幅度比較大，穗粒數(shù)在JN和TH兩試點的分布分別為15.000～89.333和20.000～93.333，變異系數(shù)分別為50.997%和50.484%，小穗數(shù)在JN和TH兩環(huán)境試點的分布分別為20.000～92.000和21.333～98.000，變異系數(shù)分別為49.211%和50.188%，這可能是因為把二棱和六棱大麥混合統(tǒng)計的原因[7]。小穗密度和穗長變異幅度比較小，小穗密度在JN和TH的分布分別為2.220～6.173和2.273～5.180，變異系數(shù)分別為21.509%和20.045%。穗長在JN和TH兩環(huán)境試點的分布分別為3.867～12.300和5.167～13.500，變異系數(shù)分別為21.723%和18.392%。

表2 兩試點大麥材料4個穗部性狀的變異Table 2 Variations of 4 spike traits of barley at two test sites

穗粒數(shù)與小穗數(shù)在2個環(huán)境中均呈極顯著正相關(guān)，Pearson相關(guān)性系數(shù)在JN和TH兩個試點分別為0.970和0.997，具有較高的遺傳關(guān)聯(lián)性。穗長與小穗密度在2個環(huán)境試點均達極顯著負相關(guān)。穗粒數(shù)與穗長、小穗密度，小穗數(shù)與小穗密度、穗長在2試點均無顯著相關(guān)性(表3)。

表3 四個大麥穗部性狀在兩試點的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of 4 spike traits of barley at two test sites

2.2 SSR標記多態(tài)性分析

224對SSR標記在137份大麥材料中共檢測到479條多態(tài)性條帶，平均等位變異為2.138，平均有效等位基因數(shù)為1.765±0.364，范圍為1.058～2.990；Shannon’s信息指數(shù)平均值為0.612±0.184，范圍為0.129～1.104；多態(tài)性信息含量平均值為0.327±0.101，范圍為0.054～0.592；期望雜合度平均值為0.409±0.131，范圍為0.055～0.668；Nei’s基因多樣性指數(shù)平均值為0.408±0.130，范圍為0.055～0.666(表4)。

表4 SSR標記在137份大麥材料中的多態(tài)性分析Table 4 Polymorphism analysis of SSR markers in 137 barley materials

2.3 群體遺傳相似性與聚類分析

供試137份大麥材料的平均遺傳相似系數(shù)(GS)為0.613，變幅為0.486～0.891。其中鄂大麥8號與創(chuàng)43的GS值均達到最大值0.891；1592與1588的GS值達到0.887。Ibon-w08-9與80284的GS值最小0.486；其次08PJ-37青與1580 GS值達到0.493。

利用NTSYS-pc進行聚類分析，根據(jù)UPGMA法構(gòu)建了遺傳關(guān)系聚類圖(圖1)，結(jié)果表明，在GS值為0.580水平時，137份大麥材料被分為了2大類群，第1類群包含大部分澳大利亞品種和國內(nèi)湖北品種等共80份材料；第2類群包含供試材料中所有的云南品種以及國內(nèi)北方品種等57份大麥種質(zhì)材料。聚類結(jié)果中，西藏半野生大麥材料沒有單獨聚為一類，第1類群包含17份西藏野生大麥材料，第2類群包含12份西藏野生大麥材料。

2.4 群體結(jié)構(gòu)分析

通過對137份大麥材料的群體結(jié)構(gòu)分析，貝葉斯方法結(jié)果顯示，隨著K值的增大，lnP(D)值整體呈增大趨勢，無明顯拐點，無法直接確定合理的K值(圖2-A)，因此，參照王國榮等[16]的方法計算ΔK確定合適的K值(圖2-B)，在K=2時得到ΔK的最大值314.332，將137份大麥材料分成2個亞群，并繪制供試材料群體結(jié)構(gòu)(圖2-C)，2個亞群分別包括80、57份材料，此結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。137份材料的Q值均大于0.7。表明這些大麥材料遺傳背景簡單，亞類間缺少基因交流。

2.5 穗部性狀的關(guān)聯(lián)分析

GLM分析共檢測到33個與穗粒數(shù)相關(guān)聯(lián)的標記位點，其中有20個位點在2個環(huán)境中均被檢測到(表5、圖4)，這20個標記的表型變異解釋率為11.14%(Ind3013)～48.89%(Ind4012)。MLM分析結(jié)果共檢測到4個(Ind1003、Ind2030、Ind2055、Ind4012)與穗粒數(shù)相關(guān)聯(lián)的位點，且這4個位點在2個環(huán)境試點均被檢測到，其中位點Ind4012的表型變異解釋率最高(16.95%，JN試點)。

GLM分析結(jié)果共檢測到13個與小穗密度相關(guān)聯(lián)位點，其中有4個位點在2個環(huán)境中均被檢測到(表5和圖4)，這4個位點在2個環(huán)境的表型變異解釋率為9.03%(Ind2060)～21.48%(Ind4091)。MLM分析結(jié)果共檢測到3個與小穗密度相關(guān)聯(lián)的位點。

GLM分析結(jié)果共檢測到34個與小穗數(shù)相關(guān)聯(lián)位點，其中有24個在2個環(huán)境試點均能被檢測到(表5和圖4)，這24個標記位點的表型變異解釋率為11.37%(Ind2055)～50.08%(Ind4012)。

圖4 兩種模型下兩個試點的穗粒數(shù)、小穗密度、小穗數(shù)、穗長關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖Fig.4 Manhattan of association analysis by two models for grain number per spike，spikelet density，spikelet number per spike，spike length from two test points

表5 關(guān)聯(lián)標記及其對表型變異的解釋率Table 5 Associated markers and the explained phenotypic variation %

MLM分析結(jié)果共檢測到4個與小穗數(shù)相關(guān)聯(lián)的位點，且這4個位點在2個環(huán)境試點均被檢測到，其中位點Ind4012的表型變異解釋率最高(14.46%，JN試點)。

A，lnP(D)值隨K值變化折線圖；B，ΔK值隨K值變化折線圖；C，群體遺傳結(jié)構(gòu)圖(紅色代表亞群1，綠色代表亞群2)。A，Line chart of lnP(D) with change of K-value;B，Line chart of ΔK with change of K-value;C，Chart of population genetic structure (the red part represented subgroup 1，and the green part represented subgroup 2).圖2 基于SSR標記的137份大麥材料群體遺傳結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Population genetic structure of 137 barley material based on SSR markers

續(xù)表5 Continued Table 5

GLM分析結(jié)果共檢測到6個標記與穗長相關(guān)聯(lián)的標記位點，MLM分析結(jié)果僅檢測到1個標記與穗長相關(guān)聯(lián)。

MLM分析中檢測到的與穗部性狀關(guān)聯(lián)的位點均在GLM分析中被檢測到。本研究共檢測到與穗粒數(shù)、小穗密度、小穗數(shù)、穗長相關(guān)聯(lián)的位點分別為33、13、34、6個。同時與穗粒數(shù)和小穗數(shù)、小穗密度和穗長相關(guān)聯(lián)的位點分別為28、2個。標記位點Ind1080、Ind4012和Ind4076同時與穗粒數(shù)、小穗密度、小穗數(shù)相關(guān)聯(lián)(表5、圖3)。

3 討論

穗粒數(shù)、小穗密度、小穗數(shù)、穗長為多基因控制的復(fù)雜性狀[3，8，18]。本研究分析的大麥穗部性狀中，穗粒數(shù)的變異幅度最大，在2試點的變幅分別為15.000～89.333和20.000～93.333，這可能是因為把二棱和六棱大麥混合統(tǒng)計的原因。李靜燁等[3]研究發(fā)現(xiàn)，大麥小穗數(shù)與穗粒數(shù)高度相關(guān)，并檢測出緊密遺傳連鎖的QTLs。本研究也發(fā)現(xiàn)小穗數(shù)與穗粒數(shù)呈極顯著正相關(guān)，并檢測到28個同時控制穗粒數(shù)和小穗數(shù)的關(guān)聯(lián)位點，進一步證實了小穗數(shù)與穗粒數(shù)的遺傳關(guān)聯(lián)性。

紅色，與穗粒數(shù)關(guān)聯(lián)位點；綠色，與小穗密度關(guān)聯(lián)位點；藍色，與小穗數(shù)關(guān)聯(lián)位點；紫色，與穗長關(guān)聯(lián)位點。Red，Loci associated with grain number per spike;Green，Loci associated with spikelet density;Blue，Loci associated with spikelet number per spike;Purple，Loci associated with spike length.圖3 SSR標記在染色體上的分布圖及與性狀關(guān)聯(lián)的位點分布圖Fig.3 Distribution of SSR markers on chromosomes and loci associated with traits

種質(zhì)資源材料是進行育種的基礎(chǔ)，利用分子標記技術(shù)能有效地分析不同材料間的遺傳差異，為后期親本雜交的組合配置提供一定的參考。此前，王國榮等[16]、賴勇等[19]和孟亞雄等[20]都發(fā)現(xiàn)國內(nèi)青稞以及大麥育種材料間的親緣關(guān)系較近。賴勇等[19]研究表明，88份青藏高原青稞材料的平均GS值為0.761，變幅為0.497～0.970；孟亞雄等[20]研究表明，89份來源不同大麥材料的GS值為0.520～0.873。本研究137份大麥群體來源于國內(nèi)13個省和11個其他國家，平均GS值為0.613，變幅為0.486～0.891。與前人的研究相比[19-20]，本研究大麥群體GS值相對更小，材料之間的親緣關(guān)系相對更遠，遺傳基礎(chǔ)相對更豐富，說明后續(xù)大麥育種材料的選擇應(yīng)加強注意外來種質(zhì)材料的引進。

本研究采用一年兩點試驗，利用GLM和MLM兩種模型對標記與表型進行關(guān)聯(lián)分析，尋找不同環(huán)境中被檢測出的標記位點，發(fā)現(xiàn)大麥7條染色體上都分布有與穗粒數(shù)相關(guān)聯(lián)的位點，這與前人研究結(jié)果一致[2，8，13，15，21-22]。在本研究檢測的33個穗粒數(shù)相關(guān)位點中，有9個位點Ind1031、Ind1077、Ind2006、Ind2044、Ind2087、Ind3013、Ind3035、Ind5026和Ind7009分別與司二靜等[13]、孟亞雄等[15]、賴勇等[23]、Wang等[8]、Pillen等[22]已報道的位點相近，其中Ind2044(2H：80.6 cM)和Ind2087(2H：138.1 cM)分別與Wang等[8]qGs2-2(2H：85.91 cM)和qGs2-4(2H：128.71 cM)位置相近；Ind5026(5H：56.3 cM)與Pillen等[22]檢測的QTL位點Bmag0113(5H：61 cM)位置相近。除相近的9個位點外，其余24個位點前人均未報道過，其中4個新的穗粒數(shù)相關(guān)位點在兩個試點均被檢測到，值得關(guān)注，其中Ind1003位于基因HORVU1Hr1G066030區(qū)間內(nèi)，該基因的編碼蛋白為含有PlsC結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，參與磷脂酰肌醇?；溨厮?，影響轉(zhuǎn)移酶活性，參與內(nèi)膜系統(tǒng)整體組成；Ind2030位于基因HORVU2Hr1G046850區(qū)間內(nèi)，該基因的編碼蛋白為含RIO結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，參與蛋白質(zhì)磷酸化，影響ATP結(jié)合，影響蛋白絲氨酸或蘇氨酸激酶活性。

關(guān)于小穗密度的研究較少，前人在2H、3H、4H、6H、7H染色體上都檢測到控制小穗密度的位點[2，6，8，23]，本研究在1H染色體上檢測到了多個關(guān)聯(lián)位點，但在7H染色體上沒有檢測到位點。在本研究檢測到的13個與小穗密度相關(guān)聯(lián)位點中，僅一個位點Ind6051與前人研究位點相近，位點Ind6051(6H：79.6 cM)與賴勇等[23]檢測得到的HVM31(6H：72.8 cM)位置相近。其余12個位點前人均未報道過，其中2種分析模型均能檢測到Ind4063(chr4H：595106302-595106382)，值得關(guān)注，其位點上有一個基因HORVU4Hr1G074700，該基因參與花粉外壁形成和木栓質(zhì)的生物合成過程，影響脂肪?；o酶A還原酶的活性，參與葉綠體的形成。

已報道的小穗數(shù)的位點位于1H、2H、4H[8，24]，本研究在7條染色體上均檢測到位點，一共檢測到34個位點與小穗數(shù)相關(guān)聯(lián)。有2個位點Ind2037和Ind2044與前人研究位點相近，位點Ind2037(2H：70.5 cM)和Ind2044(2H：80.6 cM)與Wang等[8]檢測到qSms2-1(2H：69.01 cM)和qSms2-4(2H：79.01 cM)位置相近，同時Ind2044(2H：652.41 Mb)與Hu等[24]檢測到的表型變異解釋率為65.07%～90.41%的qtnSMS-2H-9(2H：652.03 Mb)重疊。

與前人研究相比[8，14，21，24-26]，本研究在3H和6H沒有檢測到穗長相關(guān)位點。本研究共檢測到6個與穗長相關(guān)的位點，有2個位點Ind2060和Ind7061與前人研究位點相近，其中Ind2060(2H：111.5 cM)位于Hori等[25]檢測到的穗長QTL(vrs1-Bmag125，2H：82.4～122 cM)區(qū)間內(nèi)，且該位點與司二靜等[13]檢測到的Bmag125(2H：122 cM)位置接近。其余4個位點前人均未報道過，其中位點Ind4050(chr4H：550655515-550655625)附近有一個基因HORVU4Hr1G066090，該基因參與脂質(zhì)代謝過程，影響O-?；D(zhuǎn)移酶活性，參與膜的整體組成。

本研究利用GLM和MLM兩種模型對JN和TH兩個環(huán)境試點下大麥的穗粒數(shù)、小穗密度、小穗數(shù)和穗長進行關(guān)聯(lián)分析，獲得多個能在2個環(huán)境同時檢測到的標記位點，其中多個標記位點與前人研究結(jié)果一致，表明本研究方案和材料可以用于相關(guān)基因的檢測研究；同時，挖掘到多個未被報道地潛在基因位點，為后續(xù)大麥穗部性狀的遺傳研究和分子標記輔助選擇育種提供重要參考。