鄭軼 劉顏敏 陳志濤 裴昕嶼 龔旭陽 張姮

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胃癌死亡率仍高居全球癌癥死亡率的第三位[2]。我國(guó)約90%胃癌患者確診時(shí)已處于中晚期，其治療效果差、費(fèi)用高。因此，尋找胃癌病因并降低其發(fā)病率、死亡率是亟待解決的重要問題。早在1994年WHO國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)即將HP定義為Ⅰ類致癌因子，近年來多項(xiàng)共識(shí)意見提及HP感染與胃癌發(fā)生和預(yù)防的關(guān)系[3-4]。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在全球范圍內(nèi)，約90%非賁門胃癌與HP感染相關(guān)[5]。HP感染通過其產(chǎn)生的毒力因素誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎性反應(yīng)，可引起T細(xì)胞浸潤(rùn)和激活單核巨噬細(xì)胞，還可使胃黏膜中多種炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α產(chǎn)生過多，而這些細(xì)胞因子在腫瘤的發(fā)生過程中可能具有重要作用[6]。TNF-α是由單核-吞噬細(xì)胞分泌的一種單核因子，最初被認(rèn)為具有抗腫瘤作用，但目前的研究發(fā)現(xiàn)TNF-α對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有促進(jìn)作用。有研究結(jié)果顯示，TNF-α不僅可以啟動(dòng)凋亡信號(hào)，還可以激活抗凋亡因子核因子(NF)-κB，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，在慢性胃炎進(jìn)展至胃癌的過程中起重要作用[7]。本研究通過檢測(cè)TNF-α在HP陽性的慢性淺表性胃炎、癌前病變及胃癌組織中的表達(dá)，探討TNF-α在胃癌發(fā)生過程中的作用及臨床意義，為胃癌的早期診斷和治療提供依據(jù)。

材料與方法

1.材料：收集2017年1月～2019年6月就診于我院的HP陽性[HP(+)]患者胃黏膜活檢標(biāo)本400例，其中HP(+)慢性淺表性胃炎組200例、HP(+)癌前病變組120例、HP(+)胃癌組80例，病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《慢性胃炎及上皮性腫瘤胃黏膜活檢病理診斷共識(shí)》[8]。收集同期HP陰性[HP(-)]患者胃黏膜活檢標(biāo)本110例，其中HP(-)慢性淺表性胃炎組60例、HP(-)癌前病變組25例、HP(-)胃癌組25例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批通過。

2.方法

(1)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)定TNF-α mRNA：使用Trizol(Invitrogen 公司)裂解新鮮胃黏膜組織標(biāo)本，0.2 ml氯仿抽提，以12 000 r/min離心2 min，70%乙醇洗滌，焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，而后使用分光光度計(jì)(Bio-Rad 公司)測(cè)定TNF-α的總RNA含量和純度。cDNA合成及PCR擴(kuò)增具體步驟均參照TaKaRa試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]說明書進(jìn)行，以GAPDH作為內(nèi)參，引物序列和反應(yīng)條件見表1。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用相對(duì)定量2-△△Ct法進(jìn)行結(jié)果分析，比較目的基因在不同樣本中的差異，每個(gè)樣本均重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。

表1 引物序列

(2)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)TNF-α蛋白：提取胃黏膜組織蛋白后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，根據(jù)目的蛋白分子量大小切割凝膠，以200 mA的電流冰上轉(zhuǎn)膜90 min，電轉(zhuǎn)結(jié)束后，采用5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h。將轉(zhuǎn)膜封閉后的條帶放入配置好的一抗稀釋液(1∶1 000，武漢博士德生物工程有限公司)中，置于4 ℃冰箱孵育過夜，TBST(三緩沖生理鹽水-吐溫20)緩沖液共洗滌3次，每次10 min。配置合適的二抗稀釋液(1∶5 000，武漢博士德生物工程有限公司)，室溫孵育1 h，然后用TBST緩沖液共洗滌3次，每次5 min，在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Solarbio公司)上加入化學(xué)發(fā)光液。采用ImageQuant LAS 4000mini凝膠成像儀對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯影。

結(jié) 果

1.TNF-α mRNA和TNF-α蛋白在HP(+)胃黏膜組織中的表達(dá)比較：TNF-α mRNA和TNF-α蛋白在HP(+)慢性淺表性胃炎組、HP(+)癌前病變組和HP(+)胃癌組中均有表達(dá)，且表達(dá)水平在3組中均依次升高，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.TNF-α mRNA和TNF-α蛋白在同類型HP(+)組和HP(-)組胃黏膜組織中的表達(dá)比較：與HP(-)組比較，各組織類型HP(+)組的TNF-α mRNA和TNF-α蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 TNF-α mRNA和TNF-α蛋白在HP(+)、HP(-)胃黏膜組織中的表達(dá)比較

討 論

全球范圍內(nèi)約有50%的人口存在HP感染，HP感染與慢性胃炎、胃潰瘍、胃癌等胃部疾病的發(fā)生密切相關(guān)[9-10]。早在1994年，世界衛(wèi)生組織將HP納入Ⅰ類致癌物，可介導(dǎo)正常胃黏膜向萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生(又稱上皮內(nèi)瘤變)、胃癌轉(zhuǎn)變，其感染可誘發(fā)胃癌發(fā)生[11]。HP可誘導(dǎo)胃黏膜產(chǎn)生TNF-α，抑制胃酸分泌，有利于HP定植，最終導(dǎo)致多種胃黏膜病變[12]。Lee等[13]對(duì)48 064例HP感染患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)根除HP能夠有效降低胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(IRR=0.53，95%CI0.44～0.64)。

TNF-α本身具有細(xì)胞毒作用，可激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，增加自然殺傷細(xì)胞的殺傷能力，可介導(dǎo)多種生物學(xué)作用如誘導(dǎo)凋亡、促進(jìn)原癌基因表達(dá)等，直接或間接引起細(xì)胞損傷，在HP感染患者中具有重要作用。袁淑芳等[14]研究表明，HP感染程度越嚴(yán)重，胃黏膜組織中TNF-α水平越高，HP根除后血清和胃黏膜組織中的TNF-α水平明顯下降，與根除前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TNF-α與HP感染相關(guān)，且參與了胃黏膜損傷的病理過程。國(guó)外研究報(bào)道，胃癌患者血清中TNF-α水平明顯高于胃部良性疾病患者及正常人群，手術(shù)切除胃癌后患者血清TNF-α水平明顯下降，但術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移者血清TNF-α水平又再度升高，提示TNF-α與胃癌的發(fā)生有關(guān)且對(duì)其有促進(jìn)作用[15]。

本研究通過研究HP感染的慢性胃炎進(jìn)展至胃癌過程中TNF-α的表達(dá)，探討TNF-α表達(dá)與HP感染和疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系，結(jié)果顯示，TNF-α在慢性淺表性胃炎進(jìn)展至胃癌過程中表達(dá)水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，HP(+)胃黏膜組織中TNF-α的表達(dá)水平明顯高于HP(-)同類型胃黏膜組織，與既往研究結(jié)果一致[14]。

綜上所述，TNF-α異常表達(dá)可能是HP促進(jìn)胃癌發(fā)生的機(jī)制之一，胃黏膜病變程度越重，TNF-α表達(dá)水平越高，為臨床通過根除HP感染來預(yù)防胃癌的發(fā)生提供了一定的理論基礎(chǔ)。