都海渤 劉佳奇 張 欣 李 婷 李金霞 姚 粟

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 北京100015）

標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC （B） 40001 保藏于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心，來源于第二軍醫(yī)大學(xué)，從2013年開始，作為培養(yǎng)基質(zhì)控菌株被GB 4789.28-2013 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》指定為標(biāo)準(zhǔn)菌株，用于葡萄糖發(fā)酵管、改良克氏雙糖的質(zhì)控[1]。目前在公開的文獻(xiàn)中，未能檢索到該菌株的分離和鑒定研究信息。

1986年，De Ley 等[2]研究了支氣管炎鮑特氏菌 （Bordetella bronchiseptica）模式菌株NCTC 452T、糞產(chǎn)堿（桿）菌（Alcaligenes faecalis）模式菌株NCIB 8156T、木糖氧化產(chǎn)堿菌脫氮亞種（Alcaligenes xylosoxidans subsp.denitrificans） 模式菌株ATCC 15173T以及一些其它鮑特氏菌和產(chǎn)堿菌的基因型和表型，認(rèn)為鮑特氏菌屬和產(chǎn)堿菌屬的親緣關(guān)系相近，建立產(chǎn)堿菌科（Alcaligenaceae）。初建時(shí)只有兩個(gè)菌屬，即產(chǎn)堿菌屬和鮑特氏菌屬。糞產(chǎn)堿菌和支氣管炎鮑特氏菌同屬產(chǎn)堿菌科，二者形態(tài)和表型特征相近。

本文采用形態(tài)學(xué)分析、16S rRNA 基因序列分析、MALDI-TOF 質(zhì)譜分析、VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析和API 試劑條等技術(shù)，對CMCC（B） 40001 進(jìn)行多相復(fù)核鑒定，以確定標(biāo)準(zhǔn)菌株的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源 標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC （B） 40001 來源于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心，在中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的保藏編號為CICC 10981。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 哥倫比亞血瓊脂平板，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；TSA，OXID；VITEK 鑒定卡、API 20NE，法國生物梅里埃公司；Taq DNA 聚合酶、dNTP、D2000 Marker，天根生化科技有限公司；GoldView，北京塞百盛基因技術(shù)有限公司；溶菌酶，Sigma 公司；蛋白酶K，Merk 公司；其它化學(xué)藥品均為進(jìn)口色譜純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 將供試菌株接種于TSA 平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h。取新鮮菌體進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，染色方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[3]。同時(shí)進(jìn)行掃描電鏡切片并鏡檢、拍照。

1.2.2 16 S rRNA 基因序列分析 利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（Tiangen 公司）提取菌株CMCC（B） 40001 基因組DNA，具體步驟參見試劑盒說明書。以基因組DNA 為模板，利用通用引物F27/1492R 擴(kuò)增16S rRNA 基因[4]。測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。測序結(jié)果用Chromas 軟件參照正、反序列圖譜人工校對，測序結(jié)果在EzTaxon 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對[5]，確定與已知近緣種序列的相似性。采用CLUSTAL W 對CMCC（B） 40001 及其若干近緣種16S rRNA 基因序列進(jìn)行多序列比對[6]，并利用N-J 法通過MEGA 5軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析[7]。

1.2.3 MALDI-TOF 質(zhì)譜分析 挑取新鮮培養(yǎng)的CMCC（B） 40001 單個(gè)菌落，均勻涂抹于96 孔不銹鋼靶板上，晾干。吸取1μL HCCA 基質(zhì)液于每個(gè)樣本上，晾干，將靶板立即放入MALDI-TOF 質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。分析軟件：Bruker MBT compass Version 4.1.60、flex control 3.4；方法：MBT-FC；掃描范圍：2 000～21 000 m/z；菌種庫：Bruker MBTDB5989。在鑒定報(bào)告中得分2.00～3.00 為高可信度鑒定，1.70～1.99 為低可信度鑒定；0.00～1.69 標(biāo)明無鑒定結(jié)果。

1.2.4 生理生化特征試驗(yàn) 分別采用VITEK 2 COMPACT 全自動微生物分析系統(tǒng)和API 試劑條對CMCC（B） 40001 進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。使用GN鑒定卡，按照VITEK 2 COMPACT 系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行菌種培養(yǎng)、菌液配制和上機(jī)操作。

采用API 20NE 試劑條對CMCC （B） 40001的碳源利用及其產(chǎn)酸情況、酶活性等生理生化特征進(jìn)行檢測，具體操作方法按試劑條使用說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株CMCC（B） 40001 在TSA 培養(yǎng)基上，菌落呈黃色，不透明，圓形，表面光滑（見圖1a）。用光學(xué)顯微鏡觀察顯示菌體細(xì)胞呈短桿狀，單個(gè)或成對排列，革蘭氏染色陰性（見圖1b）。用菌體電子顯微鏡觀察，菌體長度0.5～1.5 μm，寬度0.3～0.4 μm，掃描電鏡成像效果見圖1c。

圖1 菌株CMCC（B） 40001 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果Fig.1 Morphological observation of strain CMCC（B） 40001

2.2 16S rRNA 基因序列分析

將測序得到的菌株CMCC（B） 40001 的16S rRNA 基因序列信息提交至GenBank，獲得登錄號MH036510。以Kerstersia gyiorum LMG 5906T（AY131213）為外群，構(gòu)建CMCC（B） 40001 與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2）。

由系統(tǒng)發(fā)育分析確定CMCC（B） 40001 應(yīng)為鮑特氏菌屬（Bordetella sp.），與支氣管炎鮑特氏菌（B.bronchiseptica）、副百日咳鮑特氏菌（B.parapertussis）、百日咳鮑特氏菌（B.pertussis）、霍氏鮑特氏菌（B.holmesii）、欣氏鮑特氏菌（B.hinzii）、鳥鮑特氏菌（B.avium）模式菌株親緣關(guān)系較近，16S rRNA 基因序列相似性分別為100.00%，99.93%，99.64%，99.49%，99.35%，98.69%，均高于原核微生物種的界限98.65%[8]。

2.3 MALDI-TOF 質(zhì)譜分析

應(yīng)用MALDI-TOF MS 質(zhì)譜儀對CMCC（B）40001 進(jìn)行快速菌種鑒定，得出鑒定結(jié)果為支氣管炎鮑特氏菌，與數(shù)據(jù)庫中模式菌株DSM 13414T匹配得分為2.33，表明鑒定結(jié)果非常可信，其與菌種庫中支氣管炎鮑特氏菌模式菌株DSM 13414T譜圖對比圖見圖3。

圖2 菌株CMCC（B）40001 16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of strain CMCC（B）40001 16S rRNA gene

圖3 菌株CMCC（B） 40001 與DSM 13414T 圖譜對比圖Fig.3 Contrast diagram of strain CMCC（B） 40001 and DSM 13414T

2.4 生理生化特征鑒定

VITEK 2 COMPACT 全自動微生物分析系統(tǒng)的鑒定結(jié)果見表1，鑒定結(jié)論是支氣管炎鮑特氏菌（Bordetella bronchiseptica），鑒定概率百分比是99%。

菌株CMCC（B） 40001 的酶活性、碳源利用及其產(chǎn)酸情況等生理生化特征結(jié)果詳見表2。菌株CMCC（B） 40001 硝酸鹽還原、脲酶、細(xì)胞色素氧化酶陽性，不液化明膠；可同化己二酸、檸檬酸和苯乙酸，不能利用葡萄糖產(chǎn)酸，不能利用阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰葡糖胺等碳源物質(zhì)。鑒定結(jié)論是支氣管炎鮑特氏菌 （Bordetella bronchiseptica），鑒定百分率是99.8%。

表2 CMCC（B） 40001 生理生化特征API 檢測結(jié)果Table 2 API test of strain CMCC（B） 40001

2.5 標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC（B） 40001 分類鑒定結(jié)論

依據(jù)形態(tài)學(xué)分析、16S rRNA 基因序列分析、MALDI-TOF 質(zhì)譜分析、VITEK 2 COMPACT 全自動微生物分析和API 試劑條技術(shù)，標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC（B） 40001 被鑒定為支氣管炎鮑特氏菌（Bordetella bronchiseptica），與GB 4789.28-2013 收錄的名稱糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）不一致。

3 討論

菌株CMCC（B） 40001 作為標(biāo)準(zhǔn)中的參考菌株，對其準(zhǔn)確鑒定至種水平后按特征分類和描述，對于完善標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性和標(biāo)準(zhǔn)之間的協(xié)調(diào)性具有重要意義。

伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第2 卷[9]，糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis） 與支氣管炎鮑特氏菌（Bordetella bronchiseptica）主要是脲酶試驗(yàn)結(jié)果不同，糞產(chǎn)堿菌脲酶試驗(yàn)陰性，支氣管炎鮑特氏菌脲酶試驗(yàn)陽性[10]，其它生理生化特征相近。GB 4789.28使用菌株CMCC（B） 40001 作為改良克氏雙糖和葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)控菌株，利用其不能利用葡萄糖、山梨醇產(chǎn)酸和不產(chǎn)生硫化氫的特性進(jìn)行培養(yǎng)基質(zhì)量控制。

支氣管炎鮑特氏菌是一種動物病原菌，可引起豬、牛、兔、犬等哺乳動物的多種呼吸系統(tǒng)疾病，并可協(xié)同其它病原微生物形成嚴(yán)重的肺部混合感染[11-14]。《人間傳染的病原微生物名錄》（中華人民共和國衛(wèi)生部2006年1月11日制定）[15]中將其危害程度分類定為第3 類，試驗(yàn)時(shí)所需生物安全實(shí)驗(yàn)室級別是BSL-2。糞產(chǎn)堿菌并未收錄于該名錄中，表明其為非病原微生物。美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC）[16]依據(jù)《美國公共衛(wèi)生服務(wù)指南》（U.S.Public Health Service Guidelines） 將支氣管炎鮑特氏菌的生物安全級別定為2 級，糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis）定為1 級。綜上建議再次修訂GB 4789.28 時(shí)更換一株生物安全性更高的糞產(chǎn)堿菌CICC 20142 作為標(biāo)準(zhǔn)菌株。