楊明陽(yáng) 田建軍 趙麗華 張開(kāi)屏 景智波 李權(quán)威 靳 燁*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品工程系 呼和浩特010070）

乳酸菌是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性、無(wú)芽孢細(xì)菌的總稱(chēng)[1]。乳酸菌作為發(fā)酵劑在肉制品發(fā)酵中可以縮短產(chǎn)品加工周期，改善產(chǎn)品品質(zhì)和風(fēng)味，提高產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性，并在抑制腐敗微生物方面也有一定的作用[2-4]。發(fā)酵肉制品中乳酸菌的數(shù)量是衡量肉制品質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)[5]。

目前對(duì)發(fā)酵香腸中乳酸菌數(shù)的測(cè)定一般采用傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法，這種方法操作誤差大，用時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低，無(wú)法準(zhǔn)確、迅速地反映發(fā)酵過(guò)程中菌群的動(dòng)態(tài)變化[6]。所使用的選擇性培養(yǎng)基無(wú)法對(duì)雖有代謝活力但難以培養(yǎng)的菌體細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究人員也開(kāi)始利用分子生物學(xué)手段檢測(cè)乳酸菌，應(yīng)用較為廣泛的為實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time polymerase chain reaction，RT-PCR），該方法不僅具有傳統(tǒng)PCR 的檢測(cè)速度快、靈敏度高的特點(diǎn)，還具有無(wú)污染、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、檢測(cè)時(shí)間短等特點(diǎn)，在對(duì)食品中優(yōu)勢(shì)菌和有害菌的檢測(cè)上得到一定的應(yīng)用[7-9]。Quijada 等[10]使用PMA-qPCR 方法檢測(cè)西班牙發(fā)酵香腸中人腺病毒-2 和門(mén)式病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法能快速檢測(cè)出在現(xiàn)有技術(shù)下不能培養(yǎng)出的病毒。Alves 等[11]首次使用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)雞肉中的沙門(mén)氏菌。Furet 等[12]研究發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光定量與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)相比，對(duì)發(fā)酵乳制品的檢測(cè)更為精確。汪冬冬等[13]使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)泡菜中的植物乳桿菌、葡萄球菌屬、芽孢菌屬和大腸埃希菌進(jìn)行快速鑒定。

為了快速定量分析乳酸菌，本試驗(yàn)通過(guò)將植物乳桿菌F16 作為發(fā)酵劑加入發(fā)酵香腸的發(fā)酵過(guò)程中，分別用RT-PCR 技術(shù)和平板計(jì)數(shù)檢測(cè)發(fā)酵劑組和自然發(fā)酵組發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)的動(dòng)態(tài)變化，構(gòu)建兩者間的線性回歸方程，以期尋找一條快速途徑對(duì)乳酸菌進(jìn)行定量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 羊后腿肉和羊尾肥膘，內(nèi)蒙古蒙羊食品有限公司；天然羊腸衣（15mm），潤(rùn)泰（河北）腸衣有限公司。

2xSG Fast qPCR Master Mix，大連寶生物工程有限公司；PCR 引物，上海桑尼生物科技有限公司；PCR Master Mix，上海生工；QIAamp DNA Stool Mini Kit，德國(guó)；無(wú)菌水、DNA 提取試劑盒，北京天根生化；核酸燃料，索萊寶；MRS 培養(yǎng)基所用試劑以及具體的配制方法參考文獻(xiàn)[14]。

植物乳桿菌 （Lactobacillus plantarum）F16 分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中；植物乳桿菌CICC：6238，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品科學(xué)技術(shù)團(tuán)隊(duì)提供。

1.1.2 引物 引物序列設(shè)計(jì)由上海生工生物工程有限公司合成，具體序列及來(lái)源如表1所示。

表1 目標(biāo)菌及其RT-PCR 擴(kuò)增引物Table 1 Dominant bacteria and RT-PCR amplification primes

1.1.3 儀器與設(shè)備 ZHJH-C1112C 超凈臺(tái)，上海智城分析儀器制造有限公司；普通PCR 儀，美國(guó)Applied Biosystems；CR3i 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛公司；CFX96TM Real-Time PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀，美國(guó)Bio-rad；恒溫恒濕箱，上海智誠(chéng)分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵香腸制作與取樣 配方：瘦肉70%，肥肉20%，食鹽2.5%，葡萄糖0.5%，抗壞血酸0.05%，亞硝酸鈉/硝酸鈉0.01%，黑胡椒粉0.5%，白酒2.0%，發(fā)酵劑107CFU/g。

表2 發(fā)酵香腸加工條件Table 2 The processing conditions of fermented sausage

按照以上配方和發(fā)酵條件，以自然發(fā)酵為對(duì)照，以植物乳桿菌F16 為發(fā)酵劑制作發(fā)酵香腸。

取樣：分別在0，2，4，6，12 d 和24 d 取樣（發(fā)酵香腸）分析，這些對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)分別為發(fā)酵香腸腌制后、發(fā)酵、成熟、干燥和儲(chǔ)藏期。每次取樣5 g，置真空袋中-80℃密封保存。

1.2.2 樣品乳酸菌的計(jì)數(shù) 參照GB4789.35-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》測(cè)定樣品的乳酸菌數(shù)。

1.2.3 樣品總DNA 的提取 參照試劑盒 （ QIAamp DNA Stool Mini Kit）的方法并作適當(dāng)修改來(lái)提取香腸發(fā)酵過(guò)程中樣品的DNA，于-20 ℃密封保存。具體操作步驟如下：

1）稱(chēng)取180～220 mg 樣品于2 mL 離心管中，在冰上操作。

2）加入1.4 mL 緩沖液ASL 渦旋1 min，95 ℃處理5 min，渦旋15 s，12 000 r/min 離心2 min。

3）吸取1.2 mL 上清液于2 mL 離心管中，加入1 個(gè)抑制片到樣品中，立刻渦旋1 min，室溫孵育1 min 使抑制片充分吸附抑制物。

4）12 000 r/min 離心6 min，將所有上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中，棄沉淀，12 000 r/min 離心6 min。

5）吸取第4 步中的200 μL 上清液，置于含有15 μL 蛋白酶K 的1.5 mL 離心管中，加入200 μL 緩沖液AL，渦旋15 s。

6）70 ℃孵育10 min，加入200 μL 無(wú)水乙醇（96%～100%），渦旋混勻。

7）將上一步中混勻的溶解液小心轉(zhuǎn)移到柱子中，12 000 r/min 離心2 min。

8）打開(kāi)柱子，加入500 μL 緩沖液AW1，12 000 r/min 離心2 min。

9）加入500 μL 緩沖液AW2，12 000 r/min 離心6 min，棄含離心液的收集管，12 000 r/min 離心2 min。

10）把柱子轉(zhuǎn)移到1 個(gè)1.5 mL 離心管中，加入200 μL AE，12 000 r/min 離心2 min，離心管中的溶液即DNA。

最終得到的DNA 使用1%的瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株的活化及DNA 的提取 用MRS培養(yǎng)基對(duì)植物乳桿菌活化培養(yǎng)3 代后（菌液濃度為108CFU/mL），按照天根試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA 提取，用溶菌酶破壁處理標(biāo)準(zhǔn)菌株，用125 μL 緩沖液TE 將DNA 溶出。用ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其質(zhì)量濃度及光密度值（OD260nm/280nm），提取的DNA 于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制作 將1.2.3 節(jié)中測(cè)得的DNA原液的質(zhì)量濃度稀釋至100 ng/μL，以此為擴(kuò)增模板，用表1中的特異性引物對(duì)其所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行特異性PCR 擴(kuò)增，所得目標(biāo)片段約340 bp，擴(kuò)增體系為：PCR MIX 25 μL，正、反向引物各2 μL，2 μL DNA 模板，無(wú)菌水補(bǔ)充至50 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性7 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用無(wú)菌手術(shù)刀切取目的DNA 條帶，采用DNA 純化試劑盒對(duì)目的DNA 片段回收、純化，用ND-1000 型微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其質(zhì)量濃度及光密度值（OD260nm/280nm），于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 RT-PCR 擴(kuò)增 植物乳桿菌RT-PCR 反應(yīng)體系見(jiàn)表3。

表3 RT-PCR 反應(yīng)體系Table 3 RT-PCR reaction system

1.2.7 發(fā)酵香腸中特異性菌株的定量PCR 分析將1.2.4 節(jié)中的植物乳桿菌DNA 質(zhì)量濃度用無(wú)菌超純水進(jìn)行10 倍稀釋?zhuān)?0-1～10-6的DNA 稀釋液為模板，用表1中的特異性引物對(duì)其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株稀釋液模板進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以其濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Ct）值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以上述提取的發(fā)酵香腸樣品宏基因組DNA為樣品模板，以無(wú)菌無(wú)酶水為陰性對(duì)照模板，分別用表1中的特異性引物，對(duì)發(fā)酵香腸樣品中植物乳桿菌進(jìn)行定量分析。

1.2.8 熔解曲線制作 當(dāng)1.2.5 節(jié)擴(kuò)增程序中35個(gè)循環(huán)結(jié)束后，在72 ℃每5 s 升高0.5 ℃，直至95℃的每個(gè)階段收集熒光信號(hào)。以溫度為橫坐標(biāo)，熒光值變化速度為縱坐標(biāo)繪制熔解曲線。

1.2.9 線性方程的建立以及試驗(yàn)驗(yàn)證 根據(jù)RTPCR 和平板計(jì)數(shù)結(jié)果，建立兩種方法間的線性關(guān)系。任取1 批樣品進(jìn)行DNA 的提取和平板計(jì)數(shù)，比較通過(guò)線性關(guān)系和平板計(jì)數(shù)所得活菌數(shù)的吻合度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用spass18 和Excel（Version 2013）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 方法的建立

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR 產(chǎn)物電泳結(jié)果 以提取的植物乳桿菌DNA 為模板，使用特異性引物lap F和lap R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化的PCR 產(chǎn)物條帶清晰、明亮，無(wú)拖帶現(xiàn)象，并且條帶在340bp 左右，符合試驗(yàn)要求。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 不同濃度梯度的植物乳桿菌DNA 模板的PCR 擴(kuò)增熒光曲線如圖2所示。植物乳桿菌在85.5 ℃出現(xiàn)單一的熔解峰，說(shuō)明在擴(kuò)增過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和二聚體，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，特異性強(qiáng)。植物乳桿菌OD260nm/280nm值在1.8～2.0 范圍，植物乳桿菌原DNA質(zhì)量濃度為138.7 μg/mL，以相對(duì)濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct 值為縱坐標(biāo)，得到菌株的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.553x＋2.467（R2=0.993）。擴(kuò)增效率為E=91.2%，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的擴(kuò)增效率在90%～110%范圍，R2≧0.99，符合RT-PCR 的基本要求[16]。

圖1 植物乳桿菌PCR 純化產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis diagram of PCR purified product of Lactobacillus plantarum

圖2 植物乳桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的熔解曲線Fig.2 Quantitative PCR melting curves for Lactobacillus plantarum

圖3 樣品宏基因組DNA 凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis of sample metagenomic DNA

2.2 RT-PCR 檢測(cè)發(fā)酵香腸發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)的動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 發(fā)酵香腸樣品宏基因組DNA 的提取結(jié)果 采用試劑盒法提取12 份發(fā)酵香腸樣品的宏基因組DNA，用微量分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量濃度和OD260nm/280nm。發(fā)酵香腸樣品宏基因組DNA 的質(zhì)量濃度在50～300 μg/mL 之間，OD260nm/280nm值在1.8～2.0之間。部分樣品用1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，條帶清晰、明亮，無(wú)拖帶現(xiàn)象，條帶大小15 000 bp，說(shuō)明提取樣品的總DNA 較好。

2.2.2 發(fā)酵香腸發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)的動(dòng)態(tài)變化 本試驗(yàn)方法符合RT-PCR 定量的基本條件，可用于定量分析。以標(biāo)準(zhǔn)曲線為依據(jù)，采用RTPCR 方法對(duì)發(fā)酵香腸中乳酸菌數(shù)計(jì)數(shù)，其對(duì)數(shù)值變化趨勢(shì)見(jiàn)圖4所示。F16 組和對(duì)照組在第0 天的拷貝數(shù)分別為6.46×107copies/g 和5.13×106copies/g，發(fā)酵香腸在發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)呈先上升后下降趨勢(shì)，在發(fā)酵前期呈上升趨勢(shì)，F(xiàn)16 組在第4 天達(dá)到峰值2.57×109copies/g，對(duì)照組在第6 天達(dá)到峰值3.89×107copies/g。

2.3 RT-PCR 與平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)發(fā)酵香腸發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)的對(duì)比

如圖5所示，采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)香腸發(fā)酵中乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，其數(shù)值變化趨勢(shì)與RT-PCR 一致。F16 組和對(duì)照組的乳酸菌數(shù)在第6 天達(dá)到最大值，分別為7.41×107CFU/g 和6.46×106CFU/g，與Matamgas M 等[17]研究結(jié)果一致。發(fā)酵香腸中的乳酸菌數(shù)在48～72 h 迅速上升，在成熟后期，F(xiàn)16組乳酸菌數(shù)約為108CFU/g，表明乳酸菌是這一過(guò)程結(jié)束時(shí)的優(yōu)勢(shì)菌群，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，在24 d時(shí)達(dá)到較低值[18]。發(fā)酵劑組的乳酸菌數(shù)顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明加入的植物乳桿菌為發(fā)酵香腸發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群。

由圖4和圖5可知，在每個(gè)取樣點(diǎn)，平板計(jì)數(shù)結(jié)果都少于RT-PCR 計(jì)數(shù)1 lg（CFU/g）左右。在發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，熒光定量所得結(jié)果高于平板計(jì)數(shù)1 lg（CFU/g）左右，這可能是由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以定量細(xì)菌DNA 為基礎(chǔ)，人們普遍認(rèn)為DNA 水平與細(xì)胞活力無(wú)關(guān)，因?yàn)樗劳黾?xì)胞也可能保留DNA 信號(hào)，所以實(shí)時(shí)熒光定量無(wú)法區(qū)分死菌和活菌，僅是直接對(duì)DNA 的拷貝數(shù)進(jìn)行分析[19]。Fujimoto 等[20]在一項(xiàng)對(duì)人類(lèi)志愿者的研究中發(fā)現(xiàn)，RT-PCR 過(guò)高地估計(jì)了糞便中短乳桿菌的數(shù)量，并將這一差異歸因于死細(xì)胞的存在或選擇性培養(yǎng)基的使用，低估的數(shù)據(jù)與本研究相似，約為1 個(gè)對(duì)數(shù)CFU/g。CHO G S 等[21]在使用RT-PCR對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行定量分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，RT-PCR 定量結(jié)果高于平板計(jì)數(shù)約1 lgCFU。

圖4 RT-PCR 檢測(cè)發(fā)酵香腸發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of lactic acid bacteria in the fermentation process of fermented sausage by RT-PCR

圖5 平板計(jì)數(shù)檢測(cè)發(fā)酵香腸發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)的動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of lactic acid bacteria in the fermentation process of fermented sausage by plate counting

2.4 線性回歸方程的建立

結(jié)合兩種方法檢測(cè)兩組發(fā)酵香腸中乳酸菌的動(dòng)態(tài)變化，應(yīng)用matlab 軟件得到線性回歸方程y=0.8116x+0.4254（圖6）。式中，x 代表拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，y 代表平板計(jì)數(shù)所得活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值。

2.5 數(shù)學(xué)模型的驗(yàn)證

選取4 個(gè)時(shí)期除本試驗(yàn)外的另一組發(fā)酵香腸樣品進(jìn)行分析，同時(shí)進(jìn)行DNA 的提取、RT-PCR和平板計(jì)數(shù)試驗(yàn)。通過(guò)RT-PCR 可得到拷貝數(shù)x，利用拷貝數(shù)x，通過(guò)線性回歸方程y=0.8116x +0.4254 計(jì)算得到活菌數(shù)值y，結(jié)果發(fā)現(xiàn)y 值與平板計(jì)數(shù)所得活菌數(shù)的相似度均在94%以上，二者相差不到1 個(gè)數(shù)量級(jí)，可認(rèn)為y 值與平板計(jì)數(shù)所代表的數(shù)量級(jí)一致，說(shuō)明本試驗(yàn)所構(gòu)建的線性方程可替代平板計(jì)數(shù)方法。

圖6 乳酸菌線性回歸方程分析Fig.6 Analysis of linear regression equation of lactic acid bacteria

表4 不同發(fā)酵時(shí)期發(fā)酵香腸的模型驗(yàn)證結(jié)果Table 4 Results of Model validation of fermented sausages during different fermentation periods

3 討論

采用實(shí)時(shí)熒光定量法和平板計(jì)數(shù)對(duì)比分析發(fā)酵香腸發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)的動(dòng)態(tài)變化，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.553x+2.467 （R2=0.993 E=91.2%）。Fredlund 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率在-3.1 和-3.6 之間，擴(kuò)增效率在80%～110%之間時(shí)，相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，滿(mǎn)足上述條件的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可用于菌株的定量分析。熔解曲線也只出現(xiàn)單一的熔解峰，無(wú)非特異性二聚體產(chǎn)生。采用這一方法對(duì)乳酸菌進(jìn)行定量，與平板計(jì)數(shù)相比，變化趨勢(shì)一致，均呈先上升后下降的趨勢(shì)。F16 組的峰值分別為2.57×109copies/g 和7.41×107CFU/g，對(duì)照組的峰值分別為3.89×107copies/g 和6.46×106CFU/g，說(shuō)明加入的乳酸菌能快速成為發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌。熒光定量法所得數(shù)值顯著高于平板計(jì)數(shù)1lg（CFU/g）左右，是由于平板計(jì)數(shù)只對(duì)活菌計(jì)數(shù)，而在發(fā)酵香腸發(fā)酵過(guò)程中存在未被分解的死亡微生物的DNA，或者會(huì)形成可存活但受損的非可培養(yǎng)細(xì)胞，在擴(kuò)增階段，死細(xì)胞或損傷細(xì)胞的DNA 可作為RT-PCR 模板，可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，因此，試驗(yàn)結(jié)果數(shù)值存在一定的差異[13]。有研究發(fā)現(xiàn)脫氧膽酸鈉（SD）和單疊丙酸丙啶（PMA）與RTPCR 技術(shù)相結(jié)合，可有效消除死亡細(xì)胞和損傷細(xì)胞的影響，對(duì)食品中的活菌細(xì)胞快速定量[23]。這可作為下步研究的切入點(diǎn)。

經(jīng)驗(yàn)證，線性回歸方程所得活菌數(shù)與平板計(jì)數(shù)結(jié)果的相似度在94%以上，說(shuō)明可用y=0.8116x+0.4254 預(yù)測(cè)發(fā)酵肉制品的活菌數(shù)。

綜上所述，應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)對(duì)乳酸菌定量是可行的。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法用時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低，不能準(zhǔn)確檢測(cè)傳統(tǒng)發(fā)酵食品環(huán)境中微生物的多樣性分析[24-25]。實(shí)時(shí)熒光定量操作省時(shí)、簡(jiǎn)單并有較強(qiáng)的特異性和靈敏度，所得結(jié)果與平板計(jì)數(shù)差異較小，優(yōu)勢(shì)明顯，可作為研究肉類(lèi)發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌動(dòng)態(tài)變化的工具。