李丹陽 鄭 巖 張文羿 孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室呼和浩特010018）

發(fā)酵乳是乳酸菌應(yīng)用最早，也是最為人們熟知的發(fā)酵產(chǎn)品。隨著人們對(duì)健康的日益重視，發(fā)酵乳作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、鈣、磷、鉀及多種維生素來源的飲品，其銷量呈突飛猛進(jìn)之勢(shì)。然而，其貯藏期短（市售發(fā)酵乳的貯藏期為21 d），后發(fā)酵期產(chǎn)酸過多，感官品質(zhì)變差等成為限制其大量銷售的主要原因之一[1]。造成這一現(xiàn)象的根本原因是乳酸菌在4 ℃貯藏過程中仍保持一定的活力，隨著乳酸菌的生長與繁殖，發(fā)酵乳發(fā)生一系列生化反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)酵乳的感官質(zhì)量、風(fēng)味品質(zhì)受到一定程度的影響[2]。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)之后新興的一門組學(xué)技術(shù)，比傳統(tǒng)單一指標(biāo)的檢驗(yàn)分析方法更具系統(tǒng)性[3]。與其它組學(xué)相比，代謝組學(xué)的優(yōu)勢(shì)在于基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的微小變化會(huì)在代謝物上放大，此外，代謝組學(xué)所采用的技術(shù)手段也更為通用[4]。Dettmer 等[5]將不同組學(xué)的研究?jī)?nèi)容總結(jié)為“基因組學(xué)告訴我們能夠發(fā)生什么，轉(zhuǎn)錄組學(xué)告訴我們將要發(fā)生什么，代謝組學(xué)告訴我們發(fā)生了什么或什么正在發(fā)生”。代謝組學(xué)作為一個(gè)最新的“組學(xué)”學(xué)科之一，是系統(tǒng)生物學(xué)中最有意義的研究領(lǐng)域，也是目前組學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，特別是在食品與營養(yǎng)科學(xué)中的應(yīng)用逐漸深入。依據(jù)代謝特性來評(píng)價(jià)發(fā)酵乳的品質(zhì)可以作為研究的一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)，從代謝產(chǎn)物層面研究貯藏過程中發(fā)生了哪些生化反應(yīng)，可為工業(yè)化生產(chǎn)及產(chǎn)品品質(zhì)的控制提供有效依據(jù)。

嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）S10 是一株從青海自然發(fā)酵酸牛乳中分離出的菌株，具有產(chǎn)酸、產(chǎn)黏、產(chǎn)香等優(yōu)良發(fā)酵特性。本試驗(yàn)選用嗜熱鏈球菌S10 作為發(fā)酵菌株，采集貯藏不同時(shí)間的發(fā)酵乳，利用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合主成分分析 （PCA，Principal Components Analysis）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA，Orthogonal Partial Least Square-Discriminate Analysis） 研究發(fā)酵乳在貯藏期間的代謝特性，從代謝角度評(píng)估該菌株發(fā)酵乳貯藏期間的品質(zhì)，為嗜熱鏈球菌S10 產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)菌株嗜熱鏈球菌S10 由乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。乙腈（色譜級(jí)）、甲酸（色譜級(jí)）、氨水（色譜級(jí)），Sigema 公司。

亮氨酸腦啡肽 （Leucine-enkephalin）、ACQUITY UPLC-Xevo G2 QTOF MS 超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、MassLynx 4.1 工作站、Progenesis QI 軟件，Waters 公司；Milli-Q 純水儀，Millipore 公司。

1.2 嗜熱鏈球菌S10 發(fā)酵乳的制備

市售鮮奶，加入8%蔗糖，高壓均質(zhì)，95 ℃滅菌10 min，嗜熱鏈球菌S10 以5×106CFU/mL 接種量接種于已滅菌的鮮奶中，42 ℃恒溫培養(yǎng)至發(fā)酵終點(diǎn)（pH 4.5），置4 ℃冰箱貯藏。

1.3 嗜熱鏈球菌S10 發(fā)酵乳貯藏期間pH 值和滴定酸度的測(cè)定

采集貯藏不同時(shí)間的發(fā)酵乳樣品，pH 值測(cè)定采用精密pH 計(jì)測(cè)定。滴定酸度測(cè)定根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB5409-85，用0.1 mol/L NaOH 溶液滴定法測(cè)定[6]。

1.4 UPLC-Q-TOF MS 分析

1.4.1 樣品前處理 采集的樣品經(jīng)12 000×g 離心15 min，棄脂肪層，吸取1 mL 上清液于新EP管，加入7 mL 乙腈溶液混勻，4 ℃靜置2 h，12 000×g 離心10 min（去除大分子蛋白質(zhì)），吸取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮10 h，加40%乙腈溶液復(fù)溶，用0.22 μm 微孔濾膜過濾。

1.4.2 高效液相色譜條件 選用Waters BEH C18 色譜柱 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫35℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。液相采用反向UPLC 系統(tǒng)及梯度洗脫模式（流動(dòng)相為乙腈、水），正離子模式流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫條件見表1。負(fù)離子模式流動(dòng)相組：0.1%甲酸銨溶液和乙腈溶液，梯度洗脫條件見表2。

1.4.3 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采用ESI 源正離子（ESI+）與負(fù)離子（ESI-）模式掃描，質(zhì)荷比掃描范圍50～1 000 m/z。為確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，在正離子模式下采用濃度為200 ng/μL 的亮氨酸腦啡肽（556.2771 u）為校正液，在負(fù)離子模式下，采用濃度為200 ng/μL 的亮氨酸腦啡肽（554.2615 u）為校正液。毛細(xì)管電壓3.0 kV，樣品錐孔電壓40 kV，源溫100 ℃，去溶劑氣溫度450 ℃，錐孔氣流速50 h/L，脫溶劑氣流速600 h/L。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

UPLC-QTOF MS 獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)MassLynx 4.1 工作站、Progenesis QI 軟件完成峰提取、峰對(duì)齊、去卷積化等處理，將以上數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入EZinfo 軟件進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析、正交偏最小二乘法-判別分析等。采用OPLS-DA模型的變量投影重要性 （VIP，Variable importance in the projection） 大于1 和單維統(tǒng)計(jì)分析（正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用雙尾學(xué)生氏t 檢驗(yàn)和非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Wilcoxon Mann-Whitney 檢驗(yàn)）的P值小于0.05 相結(jié)合的方法篩選差異性代謝物。

1.6 代謝物結(jié)構(gòu)鑒定與代謝通路分析

篩選出差異代謝物后，根據(jù)物質(zhì)的保留時(shí)間和質(zhì)荷比，通過Chemspider、KEGG、METLIN 等多個(gè)代謝組數(shù)據(jù)庫檢索，得到的差異代謝物經(jīng)二級(jí)質(zhì)譜碎片信息匹配完成鑒定，結(jié)合KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 嗜熱鏈球菌S10 發(fā)酵乳貯藏期間的pH 值和滴定酸度

由表3可知，嗜熱鏈球菌S10 發(fā)酵乳在4 ℃21 d 貯藏期間，隨著貯藏時(shí)間的增加，pH 值逐漸降低，滴定酸度反而上升。其中0～7 d 的變化最大，之后逐漸減小。在貯藏過程中pH 值呈降低趨勢(shì)，這是由于嗜熱鏈球菌S10 在低溫貯藏條件下繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸，pH 值持續(xù)下降導(dǎo)致發(fā)酵乳后酸化現(xiàn)象，對(duì)發(fā)酵乳的品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響[7]。秦艷婷等[8]研究了21 株嗜熱鏈球菌的貯藏特性，結(jié)果表明：在 貯 藏48 h 內(nèi)，菌 株IMAU20764 和IMAU20246 發(fā)酵乳的pH 值變化較大（分別下降了0.18 和0.11）。李宏軍等[9]研究了不同貯藏條件下發(fā)酵乳的pH 值和滴定酸度的變化，結(jié)果顯示：在4 ℃條件下貯藏時(shí)，滴定酸度和pH 值的變化在第1 周較大，隨后變小，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.2 嗜熱鏈球菌S10 發(fā)酵乳貯藏期間的代謝組學(xué)分析

采用UPLC-QTOF MS 聯(lián)用技術(shù)對(duì)貯藏0，1，7，14，21 d 的發(fā)酵乳樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析。正負(fù)離子模式下貯藏0 d 與21 d 樣本基峰強(qiáng)度如圖1所示?？梢钥闯?，貯藏0 d 與21 d 的樣品基峰有明顯差異。正離子模式下的差別出現(xiàn)在4 min 后，與貯藏21 d 的樣品相比，貯藏0 d 樣品中4～8 min的物質(zhì)隨貯藏時(shí)間的增加而減少，與之相反，8 min 后的物質(zhì)隨貯藏時(shí)間的增加而增多；負(fù)離子模式下的差別始終存在。綜上所述，貯藏21 d 的樣品與貯藏0 d 的樣品在代謝物方面差異顯著。

為了找到差異代謝物質(zhì)，通過Ezinfo 監(jiān)督模式的OPLS-DA 對(duì)貯藏不同時(shí)間的樣品進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。0 d 樣品組內(nèi)間距較小，在PLS得分圖中分布比較集中，即0 d 樣品代謝物沒有發(fā)生改變，重復(fù)性較高。貯藏0 d 樣品與其它貯藏時(shí)間樣品之間的距離較大，即樣本間出現(xiàn)最大程度的分離，說明隨著貯藏時(shí)間的增加，樣本中的代謝物發(fā)生了改變。通過OPLS-DA 模型的得分圖 （S-PLOT，Scores Plot）選擇VIP 值大于1 且距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的變量，距離原點(diǎn)的距離越遠(yuǎn)，對(duì)各個(gè)樣品分類所起作用越大。將篩選出貢獻(xiàn)較大且具有顯著性差異的離子作為差異代謝物，結(jié)果見圖3。

圖1 發(fā)酵乳貯藏期間的基峰強(qiáng)度圖Fig.1 Based peak intensity（BPI） chromatograms of fermented milk during storage

圖2 發(fā)酵乳貯藏期間正交偏最小二乘法-判別分析模型Fig.2 OPLS-DA of fermented milk during storage

圖3 發(fā)酵乳貯藏期間得分圖Fig.3 S-PLOTS of fermented milk during storage

2.3 代謝物鑒定和分析結(jié)果

差異代謝物的鑒定方法為通過一級(jí)質(zhì)譜信息確定相對(duì)分子質(zhì)量，同位素匹配度越好，質(zhì)量偏差越小的化合物為正確化合物的可能性越大[10]。根據(jù)化合物的精確質(zhì)核比利用Chemspider、KEGG、METLIN 等多個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索，在1 ppm 的差異范圍選出候選物，通過二級(jí)質(zhì)譜得到物質(zhì)的碎片信息，匹配各項(xiàng)信息，共推斷得到22 個(gè)差異代謝物，見表4。

由表4可知，發(fā)酵乳貯藏期間代謝物的變化主要與碳水化合物及能量代謝、氨基酸代謝、脂肪酸代謝及嘌呤代謝等多條代謝途徑相關(guān)，其中一些主要的代謝物變化如下：

1）甘油磷脂、油酸等參與脂質(zhì)代謝的代謝物有所增加。甘油磷脂代謝是脂質(zhì)代謝中發(fā)生變化的主要代謝途徑，具有一定的代謝網(wǎng)絡(luò)。由于代謝產(chǎn)物的復(fù)雜性與多樣性，脂質(zhì)代謝也被作為代謝組學(xué)的一個(gè)重要分支，逐漸成為近幾年科研研究的重點(diǎn)[11]。Hermansson 等[12]繪制了所有哺乳細(xì)胞中都存在的甘油磷脂的生物合成和代謝途徑，為脂質(zhì)代謝的研究提供了理論依據(jù)。根據(jù)1984年Rao等[13]的研究，用嗜熱鏈球菌發(fā)酵全脂乳，結(jié)果會(huì)對(duì)乳脂產(chǎn)生影響，包括飽和脂肪酸和游離脂肪酸有所增加，其中最重要的是硬脂酸和油酸的含量有所增加。油酸和硬脂酸對(duì)軟化血管有一定的功效，且在人體的新陳代謝中起著是很重要的作用，因而油酸的增加更有益于健康。

表4 發(fā)酵乳貯藏期間差異代謝物Table 4 The differential metabolites of fermented milk during storage

2）煙酸有所增加，色氨酸有所減少。煙酸（又名尼克酸）和煙酰胺是維生素PP 中的一種，其主要作用是通過抑制甘油三酯脂肪酶來減少脂肪組織中的脂解[14]。根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果可知，酸乳發(fā)酵過程中嗜熱鏈球菌可以合成尼克酸和葉酸，尼克酸是在合成NAD 和NADP 的過程中產(chǎn)生的，嗜熱鏈球菌通過消耗色氨酸而合成尼克酸，因而在過程中出現(xiàn)色氨酸的減少[15]。酸乳在4 ℃貯藏過程中會(huì)出現(xiàn)一些維生素含量減少，包括生物素和泛酸。這是由于培養(yǎng)過程中微生物代謝以及冷藏過程中維生素的化學(xué)分解所造成的，后者已用直接酸化法證實(shí)為更主要的原因[16]。

3）嘌呤減少，甘氨酸增加。嘌呤是細(xì)胞中最豐富的代謝物種，對(duì)于提供細(xì)胞能量及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)起著十分重要的作用。嗜熱鏈球菌可以分解嘌呤和嘧啶作為生長的碳源、氮源和能源，在分解腺嘌呤過程中，腺嘌呤被腺嘌呤脫氨酶分解為次黃嘌呤，進(jìn)一步被分解為黃嘌呤，黃嘌呤形成后經(jīng)一系列的轉(zhuǎn)化最后生成甘氨酸[16]。

4）L-賴氨酰-N-甲基-L-纈氨酰、甘氨酰-L-脯氨酸等短肽代謝物增加。甘氨酸、L-谷氨酸等氨基酸在貯藏過程中也發(fā)生變化，這是因?yàn)槭葻徭溓蚓玫鞍踪|(zhì)并將其分解為大小不等的多肽或氨基酸等小分子化合物進(jìn)入細(xì)胞[17]。有研究表明，短肽具有一定的生理活性，包括抗氧化、降血糖等作用[18]。王越男等[19]對(duì)凝固型發(fā)酵乳的代謝圖譜研究發(fā)現(xiàn)，Lys-Glu-Ser-Thr-Leu、Ala-Ala-Pro-Thr、Leu-Lys-Leu 和Leu-Lys-Leu 等短肽類代謝物顯著增加，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。Ghosh 等[20]研究嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌混合發(fā)酵牛乳發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳中的蛋白降解為大量的短肽和氨基酸，這些短肽具有一定的生物活性。谷氨酸含量有所降低，則是由于在谷氨酸脫氫酶（GDH）的作用下，轉(zhuǎn)氨酶與谷氨酸結(jié)合，催化了酮α-戊二酸的脫氨基作用。瞿爽[21]研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌對(duì)天冬氨酸、谷氨酸等消耗量較大，與本試驗(yàn)結(jié)果一致?，F(xiàn)有的LAB基因組檢測(cè)結(jié)果顯示，GDH 編碼基因存在于一些菌株中，包括嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌，而其它菌如乳酸乳球菌、干酪乳桿菌中則沒有。

5）琥珀酸、草酰乙酸等物質(zhì)有所增加。嗜熱鏈球菌屬兼性厭氧菌，在厭氧條件下因缺乏丙酮酸脫氫酶系和α-戊酮二酸脫氫酶體系而不能形成完整的TCA 循環(huán)，然而，為了保證生物合成所需的前體物質(zhì)，TCA 循環(huán)被改為兩條支路，其中還原支路可在厭氧條件下發(fā)生[22]。還原支路由草酰乙酸還原為琥珀酸，催化延胡索酸還原為琥珀酸的酶不是琥珀酸脫氫酶而是延胡索酸還原酶（FR），此酶是厭氧條件下形成琥珀酸的關(guān)鍵酶，因而琥珀酸、草酰乙酸等物質(zhì)都有所增加。Azizan等[23]利用GC-MS 方法研究不同條件下培養(yǎng)乳酸菌的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)除各種氨基酸外，參與TCA循環(huán)的琥珀酸、蘋果酸和檸檬酸等有機(jī)酸的數(shù)量顯著增加。此外，鏈球菌在葡萄糖限制性條件下，從終產(chǎn)物中可以檢測(cè)到甲酸、乙酸等產(chǎn)物，這主要是由不同的發(fā)酵途徑所產(chǎn)生。

草酰乙酸、琥珀酸、甘氨酸、L-谷氨酸等差異物質(zhì)多屬于初級(jí)代謝物，通過初級(jí)代謝，使?fàn)I養(yǎng)物轉(zhuǎn)化為具有生理活性的物質(zhì)，為微生物的生長提供能量，這些物質(zhì)是機(jī)體生存必不可少的。有研究表明，乳中初級(jí)代謝物的變化與營養(yǎng)質(zhì)量相關(guān)，不會(huì)對(duì)發(fā)酵乳的品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[24]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過UPLC-QTOF MS 技術(shù)與正交偏最小二乘法-判別分析，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索及質(zhì)譜信息匹配，篩選出甘氨酰-L-脯氨酸、琥珀酸、甘氨酸、L-谷氨酸、煙酸等22 個(gè)生物標(biāo)志物，涉及碳水化合物及能量代謝、氨基酸代謝、脂肪酸代謝等多條代謝途徑。在嗜熱鏈球菌S10 發(fā)酵乳貯藏期間差異代謝物多是初級(jí)代謝產(chǎn)物，其種類和含量不會(huì)對(duì)發(fā)酵乳的品質(zhì)產(chǎn)生不利影響。