石菲菲 王 麗 崔曉瑞 張衛(wèi)東 劉小飛 李凌燕 潘 妍 宋洪波 李淑榮*

（1 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 北京102442 2 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州350002 3 中國(guó)原子能科學(xué)研究院 北京102413）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）為革蘭氏陽性短桿菌，在自然界和各類食品中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)，是一種人畜共患的食源性致病菌，感染該菌后可引起腦膜炎、急性胃腸炎、腹瀉,甚至死亡等[1-3]。該菌具有較強(qiáng)的致病性，對(duì)各種應(yīng)激條件（低溫、高鹽、低pH 等）有很強(qiáng)的耐受性，進(jìn)一步增大了該菌的危害性[4]。英諾克李斯特菌（Listeria innocua）是另一種李斯特菌屬，廣泛存在于土壤和即食食品中[5]，對(duì)人類的致病性較小[6]。相關(guān)研究表明，英諾克李斯特菌與單增李斯特菌在血清、生理、形態(tài)方面有著高度的相似性，因此成為研究單增李斯特菌的良好替代模式菌[7]。

輻照殺菌技術(shù)是一種冷殺菌技術(shù)，近年來被廣泛應(yīng)用于食品殺菌領(lǐng)域，與傳統(tǒng)的高溫殺菌方法相比，該方法可較好地保留食品中的熱敏成分，且殺菌徹底，目前應(yīng)用于食品中的輻照源主要有3 種，即γ 射線、X 射線和電子束射線[8]。相對(duì)于其它輻射源，電子束設(shè)備輻照效率高，可操作性強(qiáng)，對(duì)食品品質(zhì)破壞較小，安全性較高[9]。許多研究表明，電子束輻照對(duì)食源性致病菌具有良好的殺菌效果[10-13]。

傅里葉紅外變換光譜技術(shù)作為一種綜合檢測(cè)細(xì)菌組分的有效方法，近年來得到廣泛的應(yīng)用，通過對(duì)細(xì)菌不同波數(shù)的紅外吸收峰的分析，可以檢測(cè)細(xì)菌在脅迫條件下胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪酸、碳水化合物、核酸和脂多糖等物質(zhì)的變化情況[14-15]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time Fluorescence Quantitative，RT-qPCR） 技術(shù)是進(jìn)行基因表達(dá)量測(cè)定較為簡(jiǎn)單、有效的方法[16]，具有光譜高敏感性以及定量精確等特點(diǎn)，可以對(duì)RT-qPCR 中熒光信號(hào)變化進(jìn)行直接探測(cè)，從而得到定量結(jié)果，目前在生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[17]。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于輻照殺菌致死效果的研究已比較深入，而對(duì)于輻照殺菌的致死機(jī)理研究仍有待深入。本試驗(yàn)中采用傅里葉變換光譜技術(shù)檢測(cè)李斯特菌在輻照后胞內(nèi)物質(zhì)的變化情況，利用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)電子束輻照對(duì)李斯特菌DNA損傷修復(fù)、糖代謝以及毒力因子相關(guān)基因表達(dá)量的影響，以期從分子水平闡釋電子束輻照對(duì)李斯特菌的致死機(jī)理，為電子束輻照應(yīng)用于食品殺菌提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

英諾克李斯特菌（Listeria innocua）1.2990，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSBYE）、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSAYE），北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；溴化鉀，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溶菌酶（100 mg/mL）、瓊脂糖Agarose、50×TAE 緩沖液、Gold-View Ⅱ型核酸染色劑、100 bp DNA Ladder，北京索萊寶科技有限公司；RNApre Pure 培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA 提取試劑盒、Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒、Talent 熒光定量檢測(cè)試劑盒（SYBR Green）、RNase-Free DNase Ⅰ，北京天根生化科技有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

YXQ-LS-50SII 立式壓力滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2F 潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-150 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；THZ-C恒溫振蕩器，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；DK-S28 電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA2204B電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SCIENTZ-II D 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；R134A 型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；TG16G 微型離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；TENSOR 27 傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)Bruker 公司；BIOMATE 3S 核酸濃度檢測(cè)儀，賽默飛世爾科技公司；Smart Gel 140 一體化凝膠成像儀，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備 對(duì)真空冷凍干燥的英諾克李斯特菌種進(jìn)行復(fù)蘇與活化，平板劃線培養(yǎng)1 d后獲得單菌落，挑取一個(gè)單菌落于10 mL 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSBYE）中，搖床培養(yǎng)24 h【（36±1）℃，200 r/min】，以3%接種量接入100 mL TSBYE 液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)12 h【（36±1） ℃，200 r/min】，以3%接種量接入1 000 mL TSBYE 液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)9 h【（36±1） ℃，200 r/min】，8 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清液，用0.85%無菌生理鹽水重復(fù)離心洗滌菌體沉淀3 次，調(diào)整菌懸液濃度為108CFU/mL，用10 mL 聚乙烯離心管分裝。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，置于4 ℃冰箱中待輻照。

1.3.2 電子束輻照處理 電子束輻照在電子加速器（中國(guó)原子能科學(xué)研究院）上進(jìn)行。參數(shù)為：功率4 kW、能量10 MeV、掃描寬度50 cm、掃描速度1.5 m/min。設(shè)定劑量為0.00，0.75，1.50，2.25，3.00，3.75，5.00 kGy，輻照過程中用中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院標(biāo)定的重鉻酸鉀銀劑量計(jì)進(jìn)行劑量跟蹤，實(shí)測(cè)劑量為0.00，0.78，1.56，2.27，3.06，3.78，5.09 kGy。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析及曲線擬合 采用陳晨等[18]的樣品處理方法，并做適當(dāng)修改。輻照處理前、后的樣品用無菌水洗滌2 次，離心（10 000 g，5 min），得到菌體沉淀，真空冷凍干燥。干燥后的菌體沉淀與溴化鉀按質(zhì)量比1∶100 充分混合，制成溴化鉀壓片，用FT-IR 譜儀對(duì)其分析，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)64 次，測(cè)量范圍4 000～500 cm-1。采用Peakfit 軟件對(duì)酰胺Ⅰ帶1 700～1 600 cm-1進(jìn)行曲線擬合。

1.3.4 總RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 分別提取不同劑量輻照后李斯特菌的總RNA?？俁NA 提取操作步驟參照北京天根RNApre Pure 培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA 提取試劑盒說明書，得到的RNA 用2%瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度檢測(cè)儀檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。

將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為：500 ng RNA，2 μL 10×RT Mix，2 μL 超 純dNTPs 混合液 （10 mmol/L），2 μL Oligo-（dT）15引物，1 μL 定量逆轉(zhuǎn)錄酶，加不含RNA 酶的ddH2O至20 μL，然后將混合均勻的混合液于37 ℃孵育60 min，85 ℃加熱5 s，反轉(zhuǎn)錄完成的cDNA 于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增 在NCBI 網(wǎng)站上獲得目的基因堿基序列，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，見表1。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)體系參照試劑盒說明書，采用三步法反應(yīng)程序，反應(yīng)條件為：95 ℃3 min預(yù)變性；95 ℃5 s 變性，60 ℃10 s 退火，72 ℃15 s 延伸，40 個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)采集在退火步驟進(jìn)行。以未輻照組為對(duì)照組，采用2-△△Ct方法進(jìn)行基因相定量分析，16S rRNA 作為內(nèi)參基因。

表1 RT-PCR 反應(yīng)引物序列Table 1 Primer of RT-PCR reaction

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD 多重檢驗(yàn)法檢驗(yàn)各組間差異的顯著性（P<0.05，差異顯著；P<0.01 差異極顯著），數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，采用Origin 8.5 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束輻照對(duì)李斯特菌胞內(nèi)組分的影響

2.1.1 傅里葉變換光譜 不同處理?xiàng)l件下的英諾克李斯特菌胞內(nèi)物質(zhì)的原始紅外譜圖見圖1。雖然各組的李斯特菌細(xì)胞從峰型和強(qiáng)度上表現(xiàn)不同，但是其基本趨勢(shì)相同。紅外吸收峰的峰位歸屬問題在分析細(xì)菌組分變化時(shí)發(fā)揮重要作用，峰位歸屬如下：3 000～2 800 cm-1脂肪酸、細(xì)胞膜相變化；酰胺I 帶1 700～1 600 cm-1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化；1 300～900 cm-1核酸骨架振動(dòng)變化[18]。由于原始圖譜變化微小，無法分辨峰型和峰位的具體變化情況，因此采用二階導(dǎo)、去卷積曲線擬合等數(shù)學(xué)方法對(duì)圖譜進(jìn)一步分析。

圖1 電子束輻照處理前、后英諾克李斯特菌紅外光譜分析Fig.1 FTIR spectra analysis of L.innocua before and after electron beam irradiation treatment

2.1.2 紅外光譜二階導(dǎo)圖譜 二階導(dǎo)數(shù)處理是紅外圖譜中常用的方法。3 000～2 800 cm-1和1 300～900 cm-1區(qū)域的二階導(dǎo)數(shù)譜圖見圖2。由圖2a 可知，2 960 cm-1處的紅外吸收峰發(fā)生明顯的偏移，向高波數(shù)方向移動(dòng)，當(dāng)劑量大于0.75 kGy 時(shí)，2 935 cm-1和2922 cm-1處的吸收峰消失，2 852 cm-1處隨著劑量的增加紅外吸收強(qiáng)度變?nèi)酰? 000～2 800 cm-1代表甲基和亞甲基的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)[19-20]。反對(duì)稱伸縮振動(dòng)譜帶波數(shù)變大，說明脂類分子中碳?xì)滏溑允綐?gòu)型增多，在一定程度上反映膜脂質(zhì)雙層無序變大。由圖2b 可知，1 170，985，960，937，917 cm-1處，隨著劑量的增加，紅外吸收強(qiáng)度變?nèi)?，?dāng)劑量大于0.75 kGy 時(shí)，1 100 cm-1和1 115 cm-1處的吸收峰消失，說明核酸分子磷酸二脂基團(tuán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)譜帶發(fā)生改變。紅外吸收變化說明輻照使細(xì)胞膜脂肪酸和核酸物質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化，從而導(dǎo)致物質(zhì)的變性[21]。這可能是由于輻射能量對(duì)化學(xué)鍵的直接作用或者自由基、活性氧引起的過氧化作用[22]。齊健[23]利用紅外光譜研究了不同放射源對(duì)宮頸癌細(xì)胞的影響，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖2 電子束輻照對(duì)英諾克李斯特菌的紅外二階導(dǎo)圖譜Fig.2 Second-derivative FTIR spectra of electron beam irradiation on L.innocua

2.1.3 細(xì)菌蛋白定量分析 在紅外光譜中，酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）譜峰研究得較為成熟[24]，代表C=O 的伸縮振動(dòng)，對(duì)于研究蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)最有價(jià)值，通過對(duì)其求二階導(dǎo)、去卷積曲線擬合，可以定量得到蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[25]。酰胺Ⅰ區(qū)是一個(gè)很寬的吸收峰，這個(gè)譜帶可以看成是幾個(gè)峰形的組合，每個(gè)子峰都代表一種結(jié)構(gòu)，有α 螺旋、β 折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲[26]，其中1 600～1 639 cm-1為β 折疊，1 640～1 650 cm-1為無規(guī)則卷曲，1 651～1 600 為α 螺旋，1 661～1 700 cm-1為β轉(zhuǎn)角[27]。

二級(jí)結(jié)構(gòu)含量見表2。未經(jīng)輻照的英諾克李斯特菌蛋白的α 螺旋含量最高，隨著電子束輻照劑量的增加，α 螺旋和β 轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量相對(duì)減少，β 折疊結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲含量相對(duì)增加，這可能是由于輻照產(chǎn)生的自由基（H+、OH-、e-aq 等）與蛋白質(zhì)之間有一定的交聯(lián)作用，導(dǎo)致氫鍵作用力減弱，甚至在一定程度上引起氫鍵斷裂[28]，使部分α 螺旋結(jié)構(gòu)被拉伸而轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲，或者是破壞β 轉(zhuǎn)角的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。這與王寧等[29]發(fā)現(xiàn)輻照氧化導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)破壞的研究結(jié)果一致。

表2 電子束輻照對(duì)英諾克李斯特菌蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 The effect of electron beam irradiation on the secondary structure of L.innocua

2.2 電子束輻照對(duì)李斯特菌相關(guān)基因表達(dá)量的影響

2.2.1 RNA 樣品質(zhì)量分析 在基因表達(dá)量分析中，RNA 質(zhì)量至關(guān)重要。OD260nm/OD280nm介于1.8～2.1 之間時(shí)，認(rèn)為所提取的RNA 中蛋白質(zhì)或者其它有機(jī)物的污染是可容忍的，當(dāng)此值大于2.2 時(shí)，表明RNA 已經(jīng)水解成單核苷酸，當(dāng)此值小于1.8時(shí)，認(rèn)為所提取的RNA 樣品不可用，純RNA 的OD260nm/OD280nm比值為2.0[30]。

圖3 RNA 樣品電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The electrophoresis result of RNA sample

RNA 樣品瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢結(jié)果如圖1所示。各組樣品均為3 條清晰條帶（23S/16S/5S），23S 的亮度約為16S 的兩倍，且5S 條帶非常淡，說明RNA 樣品完整性較好[31]。采用核酸濃度檢測(cè)儀檢測(cè)各組RNA 樣品濃度，各組RNA 樣品質(zhì)量均大于100 μg，且OD260nm/OD280nm比值在2.0～2.1之間，滿足實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)要求。

2.2.2 DNA 損傷修復(fù)相關(guān)基因recA 表達(dá)量的變化 各組recA 基因的相對(duì)表達(dá)量如圖2所示。與對(duì)照組相比，各輻照組recA 基因表達(dá)均上調(diào)，除0.75 kGy 輻照組與對(duì)照組相比，表達(dá)量上調(diào)差異不顯著（P＞0.05）外，其余組與對(duì)照組相比，表達(dá)量上調(diào)極顯著（P＜0.01），說明電子束輻照對(duì)李斯特菌DNA 產(chǎn)生了一定的損傷，使recA 基因被激活，調(diào)控受損DNA 的誘變修復(fù)，導(dǎo)致遺傳變異。輻照能誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生過多的活性氧物質(zhì)，如超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基和超氧化氫等，這些活性氧物質(zhì)可與DNA 等大分子物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，致DNA 雙鏈斷裂。DNA 是電離輻射的靶分子，在細(xì)胞輻射損傷中起重要作用[32]。recA 基因是DNA 修復(fù)過程中的重要因子[33]，也是SOS 反應(yīng)的激活因子[34]，是一種保守基因，參與DNA 的修復(fù)。

2.2.3 糖代謝相關(guān)基因lin1840 和GAPDH 表達(dá)量的變化 各組lin1840 和GAPDH 基因的相對(duì)表達(dá)量如圖3所示。李斯特菌輻照初期，lin1840和GAPDH 兩基因各輻照組與對(duì)照組相比表達(dá)均上調(diào)。0.75 kGy 和1.50 kGy 輻照組與對(duì)照組相比，lin1840 和GAPDH 基因表達(dá)量上調(diào)差異不顯著（P＞0.05）。2.25 kGy 輻照組與對(duì)照組相比，lin1840基因表達(dá)量上調(diào)顯著（P＜0.05），GAPDH 基因表達(dá)量上調(diào)極顯著 （P＜0.01）。3.00，3.75 kGy 和5.00 kGy 輻照組與對(duì)照組相比，兩基因表達(dá)量上調(diào)極顯著（P＜0.01）。

lin1840 基因是編碼β-葡萄糖苷酶的基因[35]。β-葡萄糖苷酶是一種能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵的水解酶，與生物體糖代謝途徑相關(guān)，對(duì)維持生物體正常生理功能起著重要作用[36-37]，其大量表達(dá)，使菌體代謝異常，加速菌體的死亡。GAPDH 基因是編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶的基因，細(xì)胞內(nèi)正常水平的GAPDH 不引起凋亡，當(dāng)其大量表達(dá)時(shí)，導(dǎo)致胞內(nèi)蓄積，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[38-39]。本試驗(yàn)結(jié)果表明：電子束輻照影響李斯特菌糖代謝水平，在一定劑量范圍電子束輻照對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的刺激作用，使lin1840 和GAPDH 基因大量表達(dá)，這與何穎等[40]的研究結(jié)果一致。

圖4 recA 基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.4 The change of relative expression of recA gene

圖5 lin1840 和GAPDH 基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.5 The change of relative expression of lin1840 and GAPDH gene

2.2.4 毒力相關(guān)基因iap、inlC 表達(dá)量的變化 各組iap 和inlC 基因的相對(duì)表達(dá)量如表2所示。與對(duì)照組相比，iap 和inlC 基因表達(dá)均下調(diào)。Iap 基因在李斯特菌輻照后，除0.75 kGy 輻照組與對(duì)照組相比表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）外，其余組與對(duì)照組相比，表達(dá)量下調(diào)極顯著（P＜0.01）。inlC 基因在李斯特菌輻照后，各輻照組與對(duì)照組相比，表達(dá)量下調(diào)極顯著（P＜0.01）。

李斯特菌是典型的兼性胞內(nèi)寄生菌，可通過一些毒力因子在巨噬細(xì)胞和許多非吞噬細(xì)胞（如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞）內(nèi)增殖[41]。iap 基因編碼p60 蛋白，p60 蛋白是由李斯特菌產(chǎn)生的一種胞外蛋白，具有水解酶和酰胺酶活性，對(duì)于李斯特菌的吞噬細(xì)胞溶解作用以及對(duì)機(jī)體的感染過程，該蛋白是一個(gè)重要的因素[42-43]。InlC 是內(nèi)化素家族的成員之一，inlC 基因編碼的蛋白與李斯特菌進(jìn)入腸道有關(guān)[44]。本研究結(jié)果表明：電子束輻照可以降低李斯特菌毒力基因的表達(dá)，推測(cè)電子束輻照可以降低李斯特菌的毒性，這與張婷[44]對(duì)灰葡萄孢病菌（Botrytis cinerea）進(jìn)行電子束輻照后致病力降低相一致。

圖6 Iap 和inlC 基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.6 The change of relative expression of iap and inlC gene

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明電子束輻照后，李斯特菌胞內(nèi)組分、細(xì)胞膜脂肪酸和核酸物質(zhì)發(fā)生變性，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，無序性增加。電子束輻照對(duì)李斯特菌相關(guān)基因表達(dá)量影響顯著，DNA 損傷修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)量表現(xiàn)為上調(diào)。由此可見電子束輻照使李斯特菌DNA 損傷，并與紅外檢測(cè)結(jié)果一致。糖代謝相關(guān)基因lin1840 和GAPDH 分別編碼β-葡萄糖苷酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶，其大量上調(diào)，使糖代謝紊亂，促使細(xì)胞凋亡，毒力相關(guān)基因表達(dá)量表現(xiàn)為下調(diào)。綜上可知，電子束輻照可導(dǎo)致李斯特菌胞內(nèi)物質(zhì)變性，并可誘導(dǎo)基因表達(dá)異常，從而可能加速菌體的死亡。