張江濤 馮曉文 秦修遠(yuǎn) 方 磊 谷瑞增 劉文穎*

（1 浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室 浙江寧波315832 2 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心 北京100015）

三文魚，學(xué)名鮭魚，被譽為“水中珍品”、“魚中至尊”[1]。海洋蛋白低聚肽是三文魚經(jīng)酶解和分離技術(shù)而獲得的小分子肽類物質(zhì)。近年來研究證明，食物來源的肽類物質(zhì)具有抗氧化、降血壓、促進(jìn)免疫、降血脂等多種生理活性，在營養(yǎng)保健食品等領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，在正常的生命活動過程中，機(jī)體的多種代謝產(chǎn)物都產(chǎn)生自由基，容易在人體內(nèi)發(fā)生氧化，引發(fā)某些疾病，如心血管疾病、癌癥等。另外，高血壓已成為危害人類的一種常見疾病。在人體血壓調(diào)節(jié)方面，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（簡稱ACE）起著關(guān)鍵的作用。ACE 能夠?qū)⒀芫o張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，導(dǎo)致血壓的升高[5]。此外，ACE 還使舒緩激肽降解，導(dǎo)致血管無法舒張，從而造成高血壓[6]?？赏ㄟ^抑制ACE 的活性，有效減少高血壓的發(fā)生。然而，單純的抗氧化性和降血壓藥物通常副作用較大，有必要尋找安全、有效的食源性替代品。

目前，國內(nèi)外關(guān)于海洋蛋白低聚肽的抗氧化活性和ACE 抑制作用的研究鮮見報道。本研究旨在分析海洋蛋白低聚肽的理化性質(zhì)、氨基酸組成和分子質(zhì)量分布，系統(tǒng)地評價其體外抗氧化和降血壓作用，為海洋蛋白低聚肽在抗氧化和降血壓保健食品的應(yīng)用開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三文魚肉，浙江海氏生物科技有限公司；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶，諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；ACE、三羥甲基氨基甲烷、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）、分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma-Aldrich 公司；抗壞血酸、乙酸、鐵氰化鉀、硼酸、水楊酸鈉、三氯化鐵、硫酸亞鐵，天津市大茂化學(xué)試劑廠；鄰苯三酚、三氯乙酸、甲醇，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；卡托普利（25 mg/片），常州制藥廠有限公司。

835-50 氨基酸分析儀，日本HITACHI 公司；SKD-1000 凱式定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司；LC-20A 高效液相色譜儀，日本HITACHI 公司；UV-8000A 紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；CR22N 高速冷凍離心機(jī)，日本日立工機(jī)株式會社。

1.2 方法

1.2.1 海洋蛋白低聚肽的酶解制備工藝 通過本中心優(yōu)化的低聚肽制備方法制備海洋蛋白低聚肽。工藝流程：三文魚肉→粉碎→溶解→預(yù)熱、調(diào)pH 值→堿性蛋白酶酶解→滅酶→中性蛋白酶酶解→滅酶→多級分離→噴霧干燥→海洋蛋白低聚肽粉。

1.2.2 海洋蛋白低聚肽的理化成分測定 用國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法測定海洋蛋白低聚肽的理化成分。采用凱氏定氮法測定總蛋白質(zhì)含量，酸水解法測定脂肪含量，灼燒法測定灰分含量，常壓干燥法測定水分含量[7-10]。

1.2.3 海洋蛋白低聚肽的分子質(zhì)量分布檢測 利用高效液相色譜儀測定海洋蛋白低聚肽的分子質(zhì)量分布。將分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、桿菌酶和細(xì)胞色素C 配制成0.1%的溶液，海洋蛋白低聚肽配制成1mg/mL 的溶液。流動相為V水∶V乙腈=55∶45（含有0.1%的三氟乙酸），色譜柱為TSK-GEL G2000 SWXL 5 μm，300 mm×7.8 mm；檢測波長為220 nm[11]。

1.2.4 海洋蛋白低聚肽的氨基酸組成測定 采用氨基酸分析儀測定氨基酸組成[12]，用堿水解法（5 mol/L NaOH） 測定色氨酸含量，用酸水解法（6 mol/L HCl）測定其它氨基酸含量。

1.2.5 羥基自由基（·OH）清除能力測定 分別加入1 mL 2.3 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 2.3 mmol/L水楊酸鈉溶液，0.5mL 不同濃度的樣品溶液，以及1 mL 2.2 mmol/L H2O2溶液，于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h，然后在510 nm 處測定吸光值A(chǔ)i，以去離子水代替樣品溶液測定吸光值A(chǔ)j，以去離子水代替H2O2溶液測定吸光值A(chǔ)0[13]。計算公式為：

1.2.6 DPPH 自由基清除能力測定 預(yù)先配制不同濃度的海洋蛋白低聚肽溶液和0.1 mmol/L DPPH 溶液。在1.5 mL 樣品溶液中加入同體積的DPPH 溶液，混勻后于暗室中反應(yīng)30 min，在517 nm 處測定吸光度Ai；在1.5 mL DPPH 溶液中加入同體積的乙醇溶液，相同波長下測定吸光度A0；在1.5 mL 樣品溶液中加入同體積的乙醇溶液，相同波長下測定吸光度Aj[14]。計算公式為：

1.2.8 還原能力測定 在2 mL 不同濃度的樣品溶液中加入2 mL 磷酸鹽緩沖溶液 （pH 6.6，0.2 mol/L）和2 mL 鐵氰化鉀（1 g/100 mL），于50 ℃水浴鍋中放置20 min，然后加入2 mL 三氯乙酸（10 g/100 mL）。取2 mL 反應(yīng)溶液，分別加入2 mL 去離子水和0.4 mL FeCl3溶液（0.1g/100 mL），室溫反應(yīng)10 min，然后在波長700 nm 處測定吸光值[16]。

1.2.9 ACE 抑制率測定 在20 μL 不同濃度的樣品溶液中加入30 μL 50 mU/mL ACE 溶液 【用0.05 mol/L 硼酸緩沖液（含0.3 mol/L NaCl，pH 8.3）溶解】，充分混合后于37 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min。然后，加入50 μL 7.6 mmol/L HHL 溶液繼續(xù)反應(yīng)30 min，再分別加入100 μL 1 mol/L HCl 溶液和400 μL 硼酸緩沖液，混勻后上機(jī)檢測。色譜條件為：流動相A：V水∶V甲醇=7∶3（含有0.1%三氟乙酸和0.05%乙酸）；流動相B：V水∶V甲醇=2∶8（含有0.1%三氟乙酸和0.05%乙酸）。梯度洗脫條件：0～2.50 min，0%～0%流動相B；2.51～4.50 min，100%～100%流動相B；4.51～15.00 min，0%～0%流動相B。分別測定加入樣品溶液前、后馬尿酸（Hip）的色譜圖峰面積，計算樣品的ACE 抑制率[17]。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 試驗結(jié)果為3 次平行試驗的，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。用Origin 8.5 軟件（美國OriginLab 公司）處理分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 海洋蛋白低聚肽的理化成分

通過國標(biāo)方法測得海洋蛋白低聚肽的理化成分見表1。海洋蛋白低聚肽中含有（90.68±0.57）%的總蛋白質(zhì)，其中酸溶蛋白質(zhì)含量為（82.21±5.94）%，占總蛋白質(zhì)的90.75%。另外還含有（0.03±0.01）%脂肪、（3.00±0.12）%灰分、（5.02±0.27）%水分。研究表明，分子質(zhì)量較小的肽類物質(zhì)易溶于酸性溶液，而分子質(zhì)量較大的蛋白遇酸沉淀[18]。海洋蛋白低聚肽中酸溶蛋白質(zhì)在總蛋白中所占比例很高，表明海洋蛋白低聚肽主要是由小肽類物質(zhì)和極少量的游離氨基酸組成。

2.2 海洋蛋白低聚肽的氨基酸組成

由表2可知，海洋蛋白低聚肽中富含谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸，總含量為42.24%，這些氨基酸有很好的調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能的重要作用。氨基酸組成也比較全面，含有人體所需的8 種必需氨基酸以及2 種半必需氨基酸，所占比例分別為29.22%和7.94%，占氨基酸總和的比例高達(dá)37.16%，表明海洋蛋白低聚肽具有較高的營養(yǎng)價值。

作為肽的基本組成單位，氨基酸的種類、數(shù)量及排列順序?qū)﹄牡纳砉δ芷鸬疥P(guān)鍵作用[19]。已有文獻(xiàn)報道，許多氨基酸如精氨酸、組氨酸、賴氨酸、酪氨酸、亮氨酸等及其衍生物具有一定程度的抗氧化活性[20]。含組氨酸的二肽以及含組氨酸和酪氨酸的三肽等都有較強(qiáng)的清除自由基能力[21]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，富含谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸和較多的疏水性氨基酸殘基的肽通常具有很強(qiáng)的ACE 抑制作用。海洋蛋白低聚肽富含抗氧化性氨基酸和ACE 抑制肽常有的氨基酸，因此，海洋蛋白低聚肽在抗氧化和降血壓方面有極大的潛力。

2.3 海洋蛋白低聚肽的分子質(zhì)量分布

海洋蛋白低聚肽的分子質(zhì)量凝膠色譜圖及分子質(zhì)量分布如圖1和表3所示。可以看出海洋蛋白低聚肽為小分子混合物，86.56%的低聚肽的分子質(zhì)量小于1 000 u，其中分子質(zhì)量140～500 u 的組分比例最高，占51.91%。分子質(zhì)量的大小與吸收利用的效率密切相關(guān)，140～500 u 范圍內(nèi)的肽段多為二肽和三肽，肽轉(zhuǎn)運載體可使二肽和三肽直接被人體吸收利用，其利用效率甚至超過游離氨基酸[22-24]。肽的分子質(zhì)量分布及大小與其抗氧化功能之間存在密切關(guān)系，活性較強(qiáng)的抗氧化肽的分子質(zhì)量往往較小[25]?；诖?，推斷海洋蛋白低聚肽是一種極具潛力的天然抗氧化物質(zhì)。

表1 海洋蛋白低聚肽的理化成分Table 1 Physical and chemical components of marine protein oligopeptides

表2 海洋蛋白低聚肽的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of marine protein oligopeptides

圖1 海洋蛋白低聚肽分子質(zhì)量分布Fig.1 The molecular weight distribution of marine protein oligopeptide

表3 海洋蛋白低聚肽的分子質(zhì)量分布Table 3 The molecular weight distribution of marine protein oligopeptide

2.4 海洋蛋白低聚肽的抗氧化能力

2.4.1 海洋蛋白低聚肽清除·OH 的能力 ·OH對機(jī)體的毒性非常大，是評價物質(zhì)的抗氧化能力常用的評判指標(biāo)[10]。從圖2a 可以看出，在質(zhì)量濃度1～13 mg/mL 范圍時，海洋蛋白低聚肽質(zhì)量濃度越高，其清除·OH 能力越高，在海洋蛋白低聚肽質(zhì)量濃度9 mg/mL 時對·OH 的清除率高達(dá)99%，之后清除率基本保持不變。由計算可知，海洋蛋白低聚肽清除·OH 的IC50約為2.75 mg/mL，VC 的IC50約為0.64 mg/mL，其·OH 清除能力是海洋蛋白低聚肽的4.29 倍（圖2b）。雖然海洋蛋白低聚肽沒有VC 的·OH 清除能力強(qiáng)，但是其效果明顯優(yōu)于趙玲等[26]研究的海參水煮液多肽（IC50=6.658 mg/mL）和劉文穎等[27]研究的海洋魚骨低聚肽（IC50=4.2 mg/mL）的·OH 清除能力。

圖2 不同濃度的海洋蛋白低聚肽和VC 的·OH 清除作用Fig.2 Hydroxyl radical scavenging activities of marine protein oligopeptides and VC at different concentrations

2.4.2 海洋蛋白低聚肽清除DPPH 自由基的能力在評估天然抗氧化劑清除自由基能力的方法中DPPH 法是的一種快速可行的方法[28]。由圖3a 所示，在質(zhì)量濃度0～25 mg/mL 范圍，海洋蛋白低聚肽濃度和其清除DPPH 自由基活性呈正相關(guān)，其質(zhì)量濃度越高，DPPH 自由基清除率越高。海洋蛋白低聚肽的DPPH 自由基清除率最高達(dá)97.5%，半抑制濃度IC50值約為4.7 mg/mL。賈建平等[29]研究三文魚魚皮膠原肽的IC50為1.302 mg/mL，是海洋蛋白低聚肽的0.27 倍?？箟难酼C 具有很強(qiáng)的自由基清除能力，IC50約為4.2 μg/mL，是一種高效的抗氧化物質(zhì) （圖3b）。由此可見，VC 在清除DPPH 自由基方面比海洋蛋白低聚肽更有效。海洋蛋白低聚肽是食物蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物，相較單一成分的VC，安全性較VC 和其它抗氧化藥物高，在高濃度時可起到良好的DPPH 自由基清除效果。

2.4.3 海洋蛋白低聚肽清除O2-·的能力 機(jī)體病變、衰老與O2-·有一定的關(guān)聯(lián)，O2-·能使蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生斷裂，從而造成細(xì)胞的破壞，是評價物質(zhì)抗氧化活性不可忽視的指標(biāo)[9]。從圖4a 看出，海洋蛋白低聚肽清除O2-·的能力與其濃度呈正相關(guān)，經(jīng)計算IC50值約為18.2 mg/mL，與其清除·OH 能力相比要弱很多。作為陽性對照，VC 清除O2-·的IC50值極低，約0.03 mg/mL，其O2-·清除能力明顯強(qiáng)于海洋蛋白低聚肽（圖4b）。蛋白肽清除O2-·能力比清除·OH 能力弱一些，這可能是因為·OH 較O2-·的氧化能力強(qiáng)得多，海洋蛋白低聚肽與·OH 發(fā)生作用時顯示更強(qiáng)的抗氧化活性。Rajapakse N 等[30]在貽貝醬抗氧化肽清除自由基試驗中也得出類似的結(jié)論。

圖3 不同濃度的海洋蛋白低聚肽和VC 的DPPH 自由基清除作用Fig.3 DPPH free radical scavenging activities of marine protein oligopeptides and VC at different concentrations

圖4 不同濃度的海洋蛋白低聚肽和VC 的O2-·清除作用Fig.4 O2-·scavenging activities of marine protein oligopeptides and VC at different concentrations

2.4.4 海洋蛋白低聚肽的還原能力 抗氧化物質(zhì)具備將Fe3+還原為Fe2+的能力，使得溶液的吸光度發(fā)生改變，從而評價其抗氧化能力[31]。從圖5中可以看出，海洋蛋白低聚肽和VC 的吸光度均隨濃度的增加而增大，吸光度越大，還原能力越高，抗氧化活性就越高。經(jīng)計算可得，質(zhì)量濃度為20 mg/mL 海洋蛋白低聚肽的還原能力與質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL 的VC 相當(dāng)，說明海洋蛋白低聚肽是良好的電子供體，具有一定的抗氧化功能。雖然海洋蛋白低聚肽的還原能力明顯低于VC 在各濃度的還原能力（P<0.05），但是海洋蛋白低聚肽作為天然、安全的抗氧化劑，具有較好的應(yīng)用前景。

2.4.5 海洋蛋白低聚肽的ACE 抑制活性 如圖6a 所示，海洋蛋白低聚肽的ACE 抑制活性在質(zhì)量濃度0～3.0 mg/mL 范圍呈增加趨勢，IC50值約為0.75 mg/mL。Bougatef A 等[32]報道沙丁魚蛋白水解物的抑制ACE IC50值為1.2 mg/mL；張艷艷等[33]研究了谷朊蛋白酶解產(chǎn)物的抑制ACE IC50值，結(jié)果為0.41 mg/mL，兩者抑制ACE 的IC50值均與本試驗中海洋蛋白低聚肽的IC50值相近。另外Hai-L H 等[34]對多種海洋來源的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，結(jié)果表明：48 種海洋水解產(chǎn)物的ACE 抑制率IC50值在0.17～501.7 mg/mL 范圍。本試驗所得海洋蛋白低聚肽與上述海洋蛋白水解物相比，具有較強(qiáng)的ACE 抑制活性。從圖6b 可知，卡托普利作為常用陽性對照物，具有很強(qiáng)的ACE 抑制活性，其IC50值約為0.06 mg/mL。然而，長期服用卡托普利藥物會有多種副作用，而海洋蛋白低聚肽與卡托普利相比，雖然ACE 抑制活性較低，但是其來源于食物蛋白質(zhì)，具有很高的安全性，作用溫和，無毒副作用。

圖5 不同濃度的海洋蛋白低聚肽和VC 的還原能力Fig.5 Reducing ability of marine protein oligopeptides and VC at different concentrations

有研究報道，肽的ACE 抑制活性與肽鏈長度有一定的關(guān)聯(lián)，ACE 抑制肽的分子質(zhì)量往往低于1 000 u[35]。目前已有多種食物蛋白質(zhì)來源的ACE抑制肽被分離出來，證明是ACE 活性區(qū)域的競爭性抑制劑，親合力較血管緊張素I 和舒緩激肽更強(qiáng)，與ACE 結(jié)合區(qū)的緊密結(jié)合阻礙了ACE 催化血管緊張素I 的轉(zhuǎn)化和舒緩激肽的降解，從而發(fā)揮降血壓的功能[36]。研究表明，通常ACE 抑制肽肽鏈末端為疏水性氨基酸殘基，且ACE 抑制肽結(jié)合ACE 的能力與C 端的3 個氨基酸序列有關(guān)[37]。另有研究者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)C 端為芳香族氨基酸或者脯氨酸，或者N 端為疏水性氨基酸時，肽段表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制ACE 活性[38]。ACE 抑制肽的構(gòu)效關(guān)系和抑制模式仍需進(jìn)一步研究。

本試驗所得海洋蛋白低聚肽屬于小分子混合物，上述結(jié)果表明其具有較好的抗氧化和ACE 抑制活性。下一步對海洋蛋白低聚肽進(jìn)行分離、純化，測定肽段序列，篩選純度較高的具有抗氧化和降血壓活性的特征性肽段。

圖6 不同濃度的海洋蛋白低聚肽和卡托普利的ACE 抑制能力Fig.6 ACE inhibition ability of marine protein oligopeptides and captopril at different concentrations

3 結(jié)論

本研究分析了海洋蛋白低聚肽的理化性質(zhì)、分子質(zhì)量分布和氨基酸組成，從羥基自由基、DPPH 自由基和超氧陰離子自由基清除能力以及還原能力4 個方面對海洋蛋白低聚肽的抗氧化活性進(jìn)行較全面的評價，并研究了ACE 抑制作用。試驗結(jié)果揭示了海洋蛋白低聚肽的抗氧化效果和ACE 抑制能力與其濃度呈正相關(guān)，明確了海洋蛋白低聚肽具有較好的抗氧化和ACE 抑制活性。