馬曉雨 陳先鑫 胡振瀛 朱雪梅，2* 熊 華 趙 強

（1 南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室 南昌330047 2 大連工業(yè)大學食品學院 遼寧大連116034 3 山東科技大學泰山科技學院 山東泰安271038 4 江西衛(wèi)生職業(yè)學院 南昌330052）

我國是世界上稻米產(chǎn)量最豐富的國家，每年的產(chǎn)量可高達1 850 億kg[1]。稻米中含有80%的淀粉及約8%的蛋白質(zhì)[2]，除了作為居民膳食中最重要的組成部分滿足人們?nèi)粘５娘嬍承枨笸?，還被用作動物飼料或用于生產(chǎn)淀粉糖漿、米線、味精等低附加值的產(chǎn)品[3]。隨著生活水平的不斷提高，人們對營養(yǎng)有了更好的認知和更高的需求，大米蛋白的優(yōu)勢也逐漸被人們認可。由于高生物效價[4]、低致敏性[5]和高消化率[6]以及符合世界衛(wèi)生組織認定的氨基酸配比[7]等優(yōu)勢，使得大米蛋白成為公認的優(yōu)質(zhì)、營養(yǎng)的植物蛋白資源，其深度加工和利用及相關營養(yǎng)保健產(chǎn)品的開發(fā)也被食品領域廣泛關注。然而，大米蛋白分子間通過氫鍵和二硫鍵的相互作用使得疏水性基團相互交聯(lián)形成難溶性的聚集體[8]，疏水性氨基酸含量遠高于其它蛋白[9]，導致大米蛋白水溶性較差，進而影響其功能性質(zhì)，如起泡性、乳化性等，在食品領域的應用極為受限，相關產(chǎn)品至今仍未形成規(guī)模。應用合理的改性技術改善大米蛋白的功能性質(zhì)，拓寬其應用范圍，提高其應用價值，近年來備受關注?，F(xiàn)階段，常見的蛋白改性方法有物理改性、化學改性、酶法改性、基因工程法和復合法[10]，而蛋白質(zhì)的酶法修飾作為其中一種蛋白改性技術，由于其溫和的反應條件使得反應易于控制，加上副產(chǎn)物較少、特異性和安全性高，可以有效改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，因此被國內(nèi)外學者廣泛報道[11-13]。然而，過度水解會造成蛋白三級結構破壞，理化性質(zhì)穩(wěn)定性下降。目前，國內(nèi)外對大米蛋白在內(nèi)的蛋白質(zhì)的研究主要集中于蛋白質(zhì)的提取工藝以及不同蛋白酶的水解效果方面，而低、中、高水解度對于蛋白結構、功能以及抗氧化功能的影響鮮有報道。胰蛋白酶作為一種特異性蛋白酶，可以對精氨酸和賴氨酸的羧基末端進行高效水解[14]。本文通過對大米蛋白進行限制性酶解處理，對酶解產(chǎn)物建立水解度與結構、功能和體外抗氧化活性的相關性，分析其影響機制，為拓寬大米蛋白在食品領域的應用，開發(fā)高值附加產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米蛋白（80%，干基，300 目），陜西錦泰生物工程有限公司；5-5’-二硫代-2-硝基苯甲酸（DTNB），Sigma 公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT），Aladdin 公司；乙二胺四乙酸，索萊寶化學試劑公司；1，1-二苯基-2-苦肼基，Aladdin 公司；1-苯胺基-8-萘磺酸鹽 （ANS），Sigma 公司；1N Folin-酚，索萊寶化學試劑公司；甘氨酸、胰蛋白酶、尿素、苯酚、氫氧化鈉、碳酸鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑，均為分析純級。

1.2 儀器與設備

新世紀T6 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；JSM 6701F 場發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀，日本電子；F-4500 熒光分光光度計，日本日立公司；L-8900 氨基酸分析儀，日本HITACH；PHS-3C 精密pH 計，上海雷磁新徑儀器有限公司；Nicolet-5700 智能型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet 公司；FD-1 真空冷凍干燥機，北京神泰偉業(yè)儀器設備有限公司；LXJ-IIB 臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；磁力攪拌水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司；DSC 8000 差式掃描量熱儀，美國PE 公司。

1.3 方法

1.3.1 大米蛋白水解物的制備 不同水解度大米蛋白水解物的制備參照Phoon 等[14]的方法并稍作改動。具體步驟：準確稱取100 g 大米蛋白粉，按照蛋白與蒸餾水1∶15 的質(zhì)量比分散，于室溫下攪拌3 h 確保蛋白充分水化。調(diào)節(jié)蛋白水溶液pH=8，于50 ℃水浴鍋中保持15 min 后，加入一定量的胰蛋白酶（酶與底物的質(zhì)量比為1∶100）水解。在酶解過程中，不斷加入1 mol/L NaOH 溶液以維持pH 值，酶解結束后迅速移入95 ℃水浴鍋中加熱15 min 使酶失活。冷卻至室溫后，復調(diào)pH=7，離心去不溶性蛋白，上清液經(jīng)冷凍干燥后備用。

1.3.2 水解度的測定 根據(jù)趙新淮等[15]的方法調(diào)整后，采用甲醛滴定法測定大米蛋白的水解度。取離心后的大米蛋白酶解液5 mL 于燒杯中，加入60 mL 的去CO2超純水，開動磁力攪拌器，不斷滴加0.1 mol/L NaOH 溶液，并用精密pH 計調(diào)節(jié)至pH=8.2，加入已中和的甲醛溶液（pH=8.2）10 mL。隨后，改用0.01 mol/L NaOH 溶液將體系pH 值滴定至9.2，記錄消耗的體積。

式中，c——標定的NaOH 的濃度 （0.01 mol/L）；V1——樣品消耗NaOH 的體積（mL）；V2——空白液消耗NaOH 的體積（mL）；cVD——蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度（mg/L）；V——用于滴定水解液的體積，5 mL；htot——每克蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，通常是一個經(jīng)驗值，大米蛋白的htot=7.40 meq/g[16]。

1.3.3 表面微觀形態(tài)觀察 樣品的表面微觀形貌采用JSM 6701F 場發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀（Scanning Electron Microscope，以下簡稱SEM）觀察。將樣品均勻平鋪至載有導電膠的銅塊置物臺上，經(jīng)表面真空噴金處理后，于20 kV 工作電壓下對樣品進行觀察[17]。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析 取冷凍干燥的樣品5 mg 與200 mg 溴化鉀進行充分研磨后壓制成片，用于FT-IR 的測定。儀器參數(shù)設置為：掃描范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)32 次，分辨率4 cm-1。譜圖采用Omnic 8.0 和Peakfit 4.12分析。去卷積后做二階導數(shù)求導，同時采用Gaussian 法進行曲線擬合，對FSD 圖譜進行峰歸屬后，分析樣品的二級結構。

1.3.5 差式掃描量熱（DSC）分析 將約10 mg 樣品置鋁盤中并密封，使用差式掃描量熱儀評估其熱性質(zhì)。儀器掃描溫度為20～150 ℃，升溫速度為5 ℃/min，以空鋁盤作為參考。對每個樣品的起始溫度（T0）、峰值溫度（Tp）、終止溫度（Te）和焓變（△H）進行記錄、分析。

1.3.6 內(nèi)源熒光 根據(jù)Xu 等[18]的方法，將蛋白樣品溶解在10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.0）中，配制成0.1 mg/mL 的蛋白溶液，采用日立F-4500 熒光光譜儀分析。儀器參數(shù)設置為：激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長300～500 nm，狹縫寬度5.0 nm。以相應的緩沖溶液作為空白對照。

1.3.7 表面疏水性的測定 使用熒光探針1-苯胺基-8-萘磺酸鹽（ANS）對樣品進行表面疏水性的測定。將蛋白樣品溶于pH 7.2 的10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液中，分別得到0.0025%，0.0050%，0.01%，0.015%和0.02%的樣品稀釋液。將20 μL濃度為8 mmol/L 的ANS （10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.2）溶液加到4 mL 樣品稀釋液中，旋渦5 s 后避光靜置10 min，用熒光分光光度計測定熒光強度。儀器參數(shù)設置為：激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長470 nm，狹縫寬度5.0 nm。根據(jù)系列稀釋樣品的熒光強度-蛋白質(zhì)濃度圖的初始斜率，計算溶液的表面疏水性指數(shù)（H0）。

1.3.8 巰基（SH）含量的測定 采用Elman 法測定蛋白樣品的暴露巰基和總巰基含量。參照Zhao等[19]的方法稍作修改，具體步驟是：將1 mL 質(zhì)量分數(shù)為1%的樣品稀釋液加到5 mL Tris-Gly 緩沖液 （0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L 甘氨酸，0.004 mol/L EDTA，pH8.0）中，測定樣品中暴露巰基的含量。將1 mL 樣品稀釋液加到5 mL 含有8 mol/L尿素的Tris-Gly 緩沖液中，測定樣品中總巰基的含量。然后，向緩沖液中加入40 μL Ellman’s 試劑（DTNB 溶于Tris-Gly 緩沖液，4 mg/mL）。將處理好的樣品在室溫下反應15 min，于412 nm 處測定其吸光度值。巰基含量計算公式：

式中，73.53=106/（1.36×104），其中1.36×104為Ellman’s 試劑的摩爾消光系數(shù)；A412——樣品在412 nm 處的吸光度值；C——樣品溶液的質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.3.9 溶解度的測定 樣品的溶解性采用Lowry法[20]測定。將1%樣品分散于去離子水中，室溫下攪拌40 min，隨后用1 mol/L NaOH 或HCl 調(diào)節(jié)溶液pH 值，繼續(xù)攪拌30 min 后4 500 r/min 離心15 min，取上清液測定蛋白含量。以BSA 為標準蛋白，計算樣品的溶解度。

1.3.10 乳化性和乳化穩(wěn)定性 參考比濁法[21]測定樣品的乳化性和乳化穩(wěn)定性。將樣品分散于pH7.0 的10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液中，得到1%樣品溶液。取20 mL 樣品溶液加入5 mL 大豆油，以分散機轉(zhuǎn)速10 000 r/min 分散60 s。迅速在距離容器底部約0.5 cm 處取50 μL 乳狀液，加至5 mL 0.1% SDS 中，充分混合后于波長500 nm 處測定吸光度值，以SDS 溶液做空白對照。10 min 后重復操作1 次。以乳化性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）來表示樣品的乳化性。

式中，C——乳化前樣品溶液的質(zhì)量濃度（g/mL）；φ——乳狀液中油的體積分數(shù)；A0和A10——分別為0 min 和10 min 時樣品的吸光度值。

1.3.11 DPPH 自由基清除能力的測定 將不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（1，2，4，8 mg/mL，2 mL）與2 mL DPPH（0.1 mmol/L，95%乙醇）混合，室溫避光反應30 min，立即在波長517 nm 處測定樣品的吸光度值A1。以去離子水替代樣品作為對照組，95%乙醇替代DPPH 溶液作為空白組，并以等體積的去離子水和95%乙醇的混合液作為空白調(diào)零[22]。樣品的DPPH 自由基清除能力按照以下公式計算：

式中，A1——樣品組吸光度值；A2——空白組吸光度值；A0——對照組吸光度值。

1.3.12 還原力的測定 將樣品溶于去離子水中，分別得到1，2，4，8 mg/mL 的溶液。取2 mL 樣品溶液依次添加2 mL pH 6.6 的0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀【K3Fe（CN）6】溶液，充分混勻后于50 ℃水浴保溫20 min，加入2 mL 10%三氯乙酸 （TCA） 溶液，渦旋5 s 后4 000 r/min 離心10 min。取離心后的上清液2 mL，加入相同體積的去離子水和0.4 mL 1% FeCl3溶液，于50 ℃水浴保溫10 min，待溶液的顏色由黃變藍后，于700 nm處測定吸光度。以去離子水代替樣品作為空白對照[23]。

1.3.13 ABTS 自由基清除能力的測定 參考Bkhairia 等[24]的方法并稍作修改。取2 mL 7.4 mmol/L ABTS 溶液，與2 mL 2.6 mmol/L 過硫酸鉀混合，在室溫條件下避光反應12 h 后用95%乙醇稀釋40～50 倍，使其在734 nm 處的吸光度值為0.7±0.02，得ABTS＋工作液。取該工作液0.8 mL，加入0.2 mL 樣品，6 min 內(nèi)測定其在734 nm 處的吸光度值AS。以95%乙醇替代樣品作為對照組。樣品的ABTS 自由基清除能力計算公式：

式中，A0——空白樣品的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5 和SPSS 17.0 方差分析法（ANOVA）對試驗數(shù)據(jù)作圖和顯著性差異分析，每組試驗重復3 次，結果表示為平均值±標準偏差。

2 結果與分析

2.1 傅里葉紅外光譜分析

如圖1所示，大米蛋白經(jīng)酶解后，紅外光譜中無特征性吸收峰，振動強度略有差異，這表明酶解導致分子間的化學鍵和作用力發(fā)生變化，從而改變了蛋白的空間結構。原大米蛋白（DH0）在紅外1 400～1 054 cm-1附近有明顯的振動吸收峰，這可能與原料中極少量的糖分子的-OH 振動有關。酶解過程中可溶性游離糖經(jīng)洗脫，酶解后的水解物在此區(qū)間內(nèi)的吸收峰強度減弱甚至消失。

紅外光譜中1 600～1 700 cm-1是蛋白質(zhì)的酰胺I 區(qū)，通?？赏ㄟ^去卷積峰形擬合得到蛋白的二級結構信息，結果見表1。相比于天然大米蛋白（DH0），酶解物中的α-螺旋和β-折疊的含量均有所降低，而β-轉(zhuǎn)角的含量顯著增加。隨著酶解程度的增大這一變化更加明顯，說明在酶解過程中蛋白質(zhì)結構展開，有序的β-折疊結構被破壞，轉(zhuǎn)變?yōu)楦屿`活舒展的β-轉(zhuǎn)角結構。同時伴隨著分子內(nèi)更強的氫鍵作用，這種結構有助于蛋白分子緊密吸附于油水界面上，具備更好的乳化性能[25]。Yong 等[26]利用谷氨酰胺酶處理麥谷蛋白后麥谷蛋白的二級結構更加靈活，同時也伴隨著β-折疊含量降低，β-轉(zhuǎn)角含量增加的現(xiàn)象。

圖1 不同水解度大米蛋白的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of rice protein hydrolysates with different degrees of hydrolysis

表1 不同水解度大米蛋白的二級結構Table 1 Secondary structure content of rice protein hydrolysates with different degrees of hydrolysis

2.2 表面微觀結構（SEM）

圖2為大米蛋白及其酶解產(chǎn)物在掃描電鏡下的微觀結構。天然大米蛋白結構緊密，表面較為平整光滑，呈現(xiàn)塊狀。而酶解處理后結構變得疏松無序，分子被水解成更小的片段，且在水解度高的情況下出現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象，表面有細小空洞，呈顆粒狀。這表明大米蛋白經(jīng)酶解處理后結構發(fā)生明顯變化，具有更小的分子結構，且疏松多孔的質(zhì)地結構更有利于在水中的溶解和分散。

圖2 不同水解度的大米蛋白表面微觀結構Fig.2 Surface microstructure of rice protein hydrolysates with different degrees of hydrolysis

2.3 熱特性分析

不同水解度的大米蛋白的熱力學特性如表2所示。樣品在升溫的過程中，由于涉及蛋白質(zhì)間新的分子鍵的生成和分子內(nèi)的折疊與解折疊，因此出現(xiàn)變性溫度和焓的變化。當水解度為2%和4%時，蛋白的變性溫度相比于天然大米蛋白有所提高，說明適度的水解可以提高蛋白的熱穩(wěn)定性，擴大蛋白的應用范圍；而當水解度為8%時，蛋白的變性溫度降至80.30 ℃，此時的DSC 圖譜沒有明顯的吸熱峰（數(shù)據(jù)未顯示），表明過度水解會破壞蛋白內(nèi)和蛋白間維持結構穩(wěn)定的氫鍵，加劇蛋白分子間的聚集，進而導致蛋白質(zhì)的耐熱性降低。

表2 不同水解度的大米蛋白的熱力學行為Table 2 Thermodynamic behavior of rice protein hydrolysates with different degrees of hydrolysis

2.4 內(nèi)源熒光

內(nèi)源熒光強度在一定程度上反映色氨酸和酪氨酸殘基暴露于水中的程度，表明它們之間特殊的相互作用和蛋白質(zhì)構型的變化，從而體現(xiàn)蛋白質(zhì)三級結構的變化[27]。當更多的發(fā)色團暴露于溶劑中時，熒光光譜的最大值發(fā)生紅移；反之，當更多的發(fā)色團嵌入蛋白質(zhì)分子內(nèi)部時，則表現(xiàn)為藍移[28]。從圖3可以看出，經(jīng)過酶水解的大米蛋白熒光強度顯著增加，這一過程伴隨著紅移效應。大米蛋白的λmax為333.2 nm，酶解后λmax隨之增大，當DH 為8%時達到最大值349.2 nm。這表明，酶解過程使得更多的發(fā)色集團暴露于溶劑中。其中當DH從0 增至2%時變化最為顯著，說明胰蛋白酶的參與使得生色基團很快暴露，隨著水解程度的增大，這一進程逐漸減緩。

圖3 不同水解度的大米蛋白內(nèi)源熒光變化Fig.3 Intrinsic fluorescence of rice protein with different DH

2.5 表面疏水性及巰基含量分析

蛋白質(zhì)的表面疏水性受蛋白質(zhì)種類和酶的特異性的影響，并隨著水解度的增大表面疏水性增加或降低。不同水解度的大米蛋白表面疏水性如圖4a 所示。與天然大米蛋白相比，經(jīng)酶解處理的樣品表面疏水性顯著降低（P＜0.05），其中水解度2%的大米蛋白酶解產(chǎn)物的表面疏水性最低。這可能是因為輕度的水解使得蛋白分子舒展，部分被水解成更小的片段，同時這些小的片段在疏水作用和二硫鍵的作用下重新聚集，使得表面疏水性基團的數(shù)量減少，導致表面疏水性降低[29]。隨著酶解程度的增大，這些小的片段解折疊，抑制了二硫鍵的生成及小分子肽的聚集，使得更多的疏水基團暴露，這也是隨著水解度的增大表面疏水性升高的原因[30]。

蛋白質(zhì)中巰基和二硫鍵的含量決定了其剛性結構，并對其功能性質(zhì)影響顯著。圖4b 顯示大米蛋白在酶解前、后巰基（總巰基和暴露巰基）含量的變化。與天然大米蛋白相比，酶解過程使得巰基含量降低，這可能是由于在胰蛋白酶的作用下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的巰基被破壞，巰基基團之間的空間阻礙被解除，游離巰基之間形成二硫鍵，進而導致巰基含量降低。也可能是在酶解過程中蛋白質(zhì)分子內(nèi)的巰基被氧化成二硫鍵，造成巰基含量降低。而蛋白結構隨著酶解程度的增大發(fā)生解折疊，促使二硫鍵斷裂并形成新的巰基，使巰基含量升高。

圖4 不同水解度的大米蛋白表面疏水性（a）和巰基含量（b）Fig.4 Surface hydrophobicity（a） and sulfhydryl（b） of rice protein with different DH

2.6 溶解性

溶解性是決定蛋白功能性質(zhì)的先決條件，因此良好的溶解性對于蛋白質(zhì)的起泡性和乳化性至關重要。在不同pH 條件下大米蛋白在酶解前、后的溶解性如圖4所示。大米蛋白在不同的pH 條件下顯示出不同的溶解度，其中在等電點附近溶解性最差，遠離等電點后溶解性逐漸增大。這是由于在等電點附近蛋白分子間的靜電斥力減小，蛋白出現(xiàn)聚集而導致溶解度降低[31]。與天然大米蛋白相比，經(jīng)酶解處理的樣品溶解性有了明顯的提升，這是因為天然大米蛋白具有致密的分子結構，其亞基通過分子內(nèi)或分子間的二硫鍵和疏水相互作用進行交聯(lián)[32]，而酶解過程促使大米蛋白分子的巰基斷裂，分子質(zhì)量降低，肽鏈舒展，暴露出更多的親水性基團，不溶性的聚集體含量降低，從而使得溶解性增加[33]。另外，酶解過程使蛋白質(zhì)的等電點發(fā)生偏移，這可能是由于蛋白質(zhì)水解物的帶電基團的種類和數(shù)量發(fā)生了變化，從而引起等電點的變化，這與Xu 等[18]的研究結果是一致的。

2.7 乳化性和乳化穩(wěn)定性分析

蛋白質(zhì)的兩親性常被應用于食品乳液制備中。乳化特性是植物蛋白重要的物化特性之一，包括乳化性和乳化穩(wěn)定性。通常情況下，乳化性越強，形成乳狀液越穩(wěn)定，越不容易形成沉淀。圖6顯示大米蛋白在酶解前、后乳化性及乳化穩(wěn)定性的變化。經(jīng)胰蛋白酶處理的大米蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性均有明顯的提高，可能與大米蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性和肽鏈靈活性增加有關，水解度在一定范圍內(nèi)對乳化性的影響沒有顯著性差異（P<0.05）。酶解后的大米蛋白斷裂成許多肽段，有更多的親水基團暴露于水相中，大量肽分子附著于油水界面，降低了界面張力，親水基團緊密包裹在油層表面，增加了其親水、親油平衡值，進而提高了乳化性。而乳化穩(wěn)定性呈先升高后降低的趨勢，這表明乳化穩(wěn)定性和乳化性不一定呈正相關。這可能是由于過度的水解導致蛋白質(zhì)被分解成更小的肽段，使其在油水界面的相互作用受到抑制，肽段之間的電荷斥力造成乳狀液的穩(wěn)定性降低。

圖5 不同水解度大米蛋白的溶解性差異Fig.5 Solubility of rice protein with different DH

圖6 不同水解度大米蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性差異Fig.6 Emulsifying activity index（EAI） and emulsifying stability index（ESI） of native and hydrolyzed rice protein

2.8 體外抗氧化活性

由于抗氧化機制的不同，因此使用多種測定方法（DPPH 自由基抑制能力、還原力和ABTS 自由基清除能力） 對大米蛋白及其酶解物的抗氧化性質(zhì)進行評估。選取5 個質(zhì)量濃度（0，1，2，4，8 mg/mL），測定這些樣品的水解度，以常見抗氧化劑BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）作為陽性對照。

2.8.1 DPPH 自由基清除能力 DPPH 自由基是一種常見的自由基，能夠在有機試劑中穩(wěn)定存在，在波長517 nm 處有明顯吸收，在清除劑存在的情況下自由基的孤對電子迅速配對，使吸光度發(fā)生變化。圖7a 比較了不同水解度的大米蛋白在不同濃度下對DPPH 自由基的抑制率，結果顯示，隨著樣品濃度的升高，其自由基抑制能力提高，即樣品的濃度與其DPPH 自由基抑制能力呈現(xiàn)正相關。在相同濃度下大米蛋白酶解物的DPPH 自由基抑制能力明顯高于天然大米蛋白，說明酶解物具有更強的供氫能力，通過終止自由基的鏈式反應將自由基轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而清除自由基[34]。當樣品質(zhì)量濃度低于2 mg/mL 時，DPPH 抑制率隨濃度的增大呈現(xiàn)較快的增長；當樣品的質(zhì)量濃度高于2 mg/mL 時，抑制率的增長速度逐漸減緩。在不同的樣品中DPPH 自由基的抑制率存在較為明顯的差異，其中水解度為2%的大米蛋白酶解物表現(xiàn)出最強的DPPH 自由基抑制能力，當樣品質(zhì)量濃度為8 mg/mL 時抑制率達80.32%，與同濃度下BHT 的抑制率（81.05%）基本持平。還有研究表明蛋白水解物的DPPH 抑制能力與疏水性氨基酸和表面疏水性有關，通常情況下表面疏水性越低抑制能力越強[35]，這與作者先前的研究結果一致（圖4）。

2.8.2 還原力 還原力是評價天然產(chǎn)物提供氫和電子能力大小的一個重要指標。大米蛋白及酶解物可作為電子供體將K3Fe（CN）6中Fe3+還原為Fe2+并產(chǎn)生普魯士藍色，樣品在700 nm 處的吸光度值即可表示還原力的大小。通常情況下，溶液的顏色越深，吸光度值越大，還原力越強。圖7b 顯示不同水解度的大米蛋白還原力的差異。大米蛋白及酶解物的還原力均與樣品濃度呈現(xiàn)良好的線性相關，酶解后的大米蛋白相較天然大米蛋白具有更強的還原力。這可能是由于酶解反應提高了蛋白的溶解性，隨著酶解過程的進行，一些具有還原性的肽段不斷被水解出來，導致還原力提高。在較低的樣品濃度下，水解度越高還原力越強，而當樣品質(zhì)量濃度為8 mg/mL 時，不同水解度的大米蛋白的還原力無顯著性差異。

2.8.3 ABTS 自由基清除能力 圖7c 為不同水解度的大米蛋白對ABTS 自由基清除能力的影響。ABTS 在一些氧化劑的作用下被氧化成深綠色的ABTS·+工作液，在抗氧化化合物存在的情況下會抑制ABTS·+的生成，表現(xiàn)為在波長734 nm 處吸光度值降低。研究發(fā)現(xiàn)，酶解后的大米蛋白ABTS自由基清除率明顯高于天然大米蛋白，當樣品質(zhì)量濃度低于2 mg/mL 時，水解度為2%的大米蛋白顯示出略低的清除率；當樣品質(zhì)量濃度大于2 mg/mL 時，大米蛋白酶解物均表現(xiàn)出良好的ABTS 自由基清除能力且清除率高達95%以上，與BHT 相當。

圖7 不同水解度大米蛋白的DPPH 自由基抑制能力（a）、還原力（b）和ABTS 自由基清除能力（c）變化Fig.7 DPPH radical scavenging activities（a），reducing power（b） and ABTS radical scavenging activities（c） of rice protein with different DH

3 結論

以大米蛋白為研究對象，制備不同水解度的大米蛋白酶解物，探究水解度對其結構、功能以及體外抗氧化活性的影響，結果顯示：酶解過程可以改善大米蛋白的結構功能特性，且體外抗氧化活性也顯著提高。以天然大米蛋白為對照，經(jīng)過酶解處理的大米蛋白具有更加靈活舒展的二級結構，使其更有利于吸附在油水界面，提高乳化性能。酶解物的結構疏松多孔，大大提高其溶解性。適度的水解可以提高大米蛋白的熱穩(wěn)定性，而水解度為8%時酶解物結構被破壞，導致耐熱性降低。同時，酶解過程也會引起蛋白質(zhì)發(fā)色團、表面疏水性基團以及巰基含量的變化。另外，對比天然大米蛋白，酶解后的產(chǎn)物在抗氧化活性方面顯著提升。大米蛋白作為一種低敏、安全且高品質(zhì)、低價格的蛋白質(zhì)，可以通過酶法改性擴大其應用范圍，充分挖掘其潛在的商業(yè)價值，以滿足消費需求。