路福平 黃愛嵐 趙 蕾 劉曉鳳 郭 宵 陳 寧 劉夫鋒

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 天津市工業(yè)微生物重點實驗室 工業(yè)酶國家工程實驗室天津科技大學生物工程學院 天津300457）

酶是一類具有高效催化活性的蛋白質(zhì)，催化活性與其三維結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。高溫、高壓、高滲透壓、極端pH 值等食品工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境會破壞酶的三維結(jié)構(gòu)，使其失活，從而極大限制了其在食品工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用[1-2]。針對此問題，對食品用酶進行結(jié)構(gòu)改造以提升其催化性能，或者從頭設(shè)計（de novo design）[3-4]以獲得自然界中不存在的酶就變得非常必要。

常用的蛋白質(zhì)改造方法主要有隨機進化、半理性設(shè)計和理性設(shè)計3 種[5-6]。隨機進化是在實驗室中模擬自然進化，構(gòu)建隨機突變體文庫，通過多輪迭代獲得性狀改善的突變體，然而突變體文庫受庫容量及高通量篩選方法限制，有益突變體占比不高。為進一步提升定向進化的效率，（半）理性設(shè)計應(yīng)運而生。該技術(shù)基于酶的結(jié)構(gòu)與功能，借助計算機輔助設(shè)計方法發(fā)現(xiàn)潛在突變位點，設(shè)計小而精的突變文庫，從而針對性設(shè)計和改造蛋白質(zhì)，是目前研究的熱點之一[7-9]。

1 食品工業(yè)常用酶制劑分類

食品工業(yè)用酶制劑作為一種高效、安全、環(huán)保的生物催化劑，以它獨特的優(yōu)勢在食品工業(yè)中起著重要作用[10]。酶制劑的使用能夠改變食品的形狀和質(zhì)地，增加食品的營養(yǎng)功能，改善食品風味。食品工業(yè)酶制劑現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于乳制品、食品釀造、肉類、焙烤、飲料、果汁和啤酒等食品工業(yè)中。目前食品工業(yè)中常用酶的種類超過55 種，主要包括：α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶、普魯蘭酶、葡萄糖異構(gòu)化酶、木瓜蛋白酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶等[11-17]。表1列出了常見的食品工業(yè)用酶制劑及其用途。

2 食品工業(yè)用酶設(shè)計的分子模擬方法

食品工業(yè)生產(chǎn)過程中的極端條件不適合大多數(shù)天然酶充分發(fā)揮其催化性能。除了定向進化實驗技術(shù)之外，利用計算機模擬技術(shù)理性設(shè)計獲得在工業(yè)環(huán)境中性能優(yōu)良的酶也是常用的方法之一。計算機模擬輔助酶工程改造通過分析蛋白序列、結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，預測突變位點，限定突變范圍，可顯著增加有效突變體的占比，從而大大縮短實驗周期，減少實驗工作量和節(jié)省成本。在食品工業(yè)用酶分子設(shè)計中常用的計算工具主要有以下5 類：同源建模、分子對接、分子動力學模擬、自由能計算和在線網(wǎng)絡(luò)預測服務(wù)。

2.1 同源建模

蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)決定其功能。酶的高效特異催化性能依賴于其錯綜復雜的三維結(jié)構(gòu)。目前蛋白結(jié)構(gòu)解析主要有X-射線晶體衍射、核磁共振及冷凍電鏡技術(shù)3 種試驗方法。上述方法存在各自的局限性：X 射線晶體衍射必須獲得優(yōu)質(zhì)的蛋白晶體，然而有些食品用酶不易體外表達或結(jié)晶；核磁共振不能解析分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)；冷凍電鏡價格昂貴，普及率較低。與已測得的龐大數(shù)量的蛋白序列相比，目前解析出的蛋白結(jié)構(gòu)非常少。鑒于此，采用計算機模擬技術(shù)預測蛋白三維結(jié)構(gòu)就顯得尤為重要，而同源建模是目前應(yīng)用較為廣泛的方法之一。依據(jù)蛋白序列同源性決定結(jié)構(gòu)同源性的原則，可通過同源性較高且結(jié)構(gòu)已知的蛋白為模板構(gòu)建目標蛋白的三維結(jié)構(gòu)。構(gòu)建流程包括：目標序列的搜索、序列比對、模型構(gòu)建和結(jié)構(gòu)優(yōu)化與評價。一般而言，目標序列與模板序列的同源性越高，構(gòu)建的模型越準確。當兩者序列同源性小于30%時，得到的目標蛋白結(jié)構(gòu)準確性較差，不建議使用該技術(shù)來構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)。目前同源建模常用的軟件有Modeler[18]和SWISS-MODEL[19]等。

表1 常見的食品工業(yè)用酶制劑及其用途Table 1 Enzymes widely used in food industry and their usage

2.2 分子對接

分子對接是將小分子配基置于蛋白的結(jié)合位點處，基于特定的算法搜尋其合理的取向和構(gòu)象，使得配基與目標蛋白的形狀和相互作用都能較好地契合，從而形成互相匹配的結(jié)合模式[20]。根據(jù)分子對接過程中是否考慮配基和目標蛋白的柔性，可以將分子對接分為3 類，即：剛性對接、半柔性對接和柔性對接。剛性對接是指在對接過程中配體和受體都為剛性的，對接過程中構(gòu)象不發(fā)生變化。該方法計算量和計算難度較小，然而，對接的準確性較差。半柔性對接指在對接過程中僅考慮配體的構(gòu)象變化，受體構(gòu)象固定不變，其準確度和計算量均適中，因此半柔性分子對接是目前應(yīng)用較為廣泛的方法。柔性對接是指在對接過程中受體和配體的構(gòu)象均不受限制，可以自由發(fā)生變化。與前兩種方法相比，該方法準確度更高，然而計算量也大幅增加，只適用于較小的模擬體系。目前常用的分子對接軟件為Glide[21]、AutoDock[22]、DOCK[23]和GOLD[24]等。

2.3 分子動力學模擬

分子動力學（Molecular Dynamic，MD）模擬是基于經(jīng)典力學/統(tǒng)計力學的理論，根據(jù)隨機給定的初始位置和勢能函數(shù)計算出作用在粒子上的力，利用經(jīng)典的牛頓運動方程，通過數(shù)值積分得到下一時刻體系的構(gòu)象，如此反復，最終獲得體系構(gòu)象隨模擬時間的變化軌跡[25]。分子力場是經(jīng)驗勢函數(shù)，分子力場的參數(shù)是根據(jù)試驗測量值或從頭計算擬合得到。目前已開發(fā)出針對生物大分子（如蛋白、DNA、RNA 及脂質(zhì)）的全原子力場[26]，小分子力場參數(shù)可通過量化計算獲得?；贛D 模擬計算除了可以獲得模擬體系動態(tài)的結(jié)構(gòu)信息外，還可獲得詳細的蛋白-蛋白、蛋白-小分子之間的相互作用。MD 模擬流程一般包括：結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換、溶劑環(huán)境的構(gòu)建（不同pH 值、溶劑及模擬溫度）、能量最小化、平衡模擬、采樣模擬和模擬數(shù)據(jù)分析。目前MD 模擬常用的軟件有Amber[27-28]、Gromacs[29]、CHARMM[26，30]和NAMD[31]等。

2.4 自由能計算

自由能計算方法[32-33]可定量分析蛋白-蛋白、蛋白-小分子之間的結(jié)合作用力。近年來已發(fā)展出多種自由能計算方法，包括經(jīng)典的自由能微擾理論、熱力學積分和分子力學-泊松玻爾茲曼表面積（Molecular Mechanics-Poisson Bolzmann Surface Area，MM-PBSA）自由能計算方法等。自由能微擾和熱力學積分的計算結(jié)果雖精確，但需要的計算資源較多，且計算時間長[34]?；贛D 模擬軌跡，利用MM-PBSA 自由能計算方法可以分別獲得分子力學作用能、極性溶劑化作用能和非極性溶劑化作用能。由于MM-PBSA 計算極性溶劑化作用能時采用隱式溶劑模型[35]，因此兼顧了計算精度和效率，被廣泛應(yīng)用于底物-酶相互作用模式研究。

2.5 在線網(wǎng)絡(luò)預測服務(wù)

為了方便初學者的使用，研究人員開發(fā)出用戶友好操作簡單的在線網(wǎng)絡(luò)服務(wù)來提高計算機模擬的可及性。突變引起的折疊自由能變化（ΔΔG）與突變體的熱穩(wěn)定性密切相關(guān)，ΔΔG 小于0 表明突變后蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性得到提升，反之則表明突變會造成蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的喪失[36]。為了提高在線網(wǎng)絡(luò)預測的準確度，目前已開發(fā)出3 種類型的打分函數(shù)（即基于機器學習，基于統(tǒng)計和基于力場）來評估突變對酶穩(wěn)定性的影響。常用的在線網(wǎng)絡(luò)服務(wù)包括：I-Mutant[37]、FoldX[38]、PoPMuSiC[39]和ddg_monomer[40]。

B 因子（B-factor）是一個從X 射線數(shù)據(jù)中獲得的原子位移參數(shù)，反映因熱運動而導致的電子密度相對于其平衡位置的振動程度。B 因子常用來鑒定蛋白質(zhì)單個殘基的柔性[41]。針對B 因子較大的氨基酸進行替換，可降低酶結(jié)構(gòu)柔性，從而提升蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[42]?；诘鞍仔蛄屑敖Y(jié)構(gòu)的B因子預測方法主要有B-FITTER[43]和FIRST[44]。

表2 食品工業(yè)用酶設(shè)計的在線網(wǎng)絡(luò)工具Table 2 The online network tools for design of food industrial enzymes

二硫鍵是蛋白質(zhì)中相鄰兩個半胱氨酸側(cè)鏈巰基脫氫形成的共價鍵，對維持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象和穩(wěn)定性有重要作用。試驗數(shù)據(jù)表明，每一個天然的二硫鍵能為蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性貢獻2.3～5.2 kcal/mol 的能量，因此，在合適位置引入二硫鍵可極大地提升蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性。常用的在線預測軟件有SSBOND[45]、MODIP[46]、DbD2[47]和BridgeD[48]。表2列出了食品工業(yè)用酶設(shè)計過程中常用的在線網(wǎng)絡(luò)工具及所需的輸入文件。

3 計算機模擬方法在食品工業(yè)用酶改造中的應(yīng)用

現(xiàn)代食品工業(yè)中的極端環(huán)境往往會破壞天然酶的構(gòu)象，使其酶活降低甚至完全失活。為了獲得性能優(yōu)良的工業(yè)酶制劑，可利用計算機模擬技術(shù)進行合理設(shè)計[9，49-50]。

3.1 提升酶的熱穩(wěn)定性

食品工業(yè)過程常涉及高溫條件操作，因此對工業(yè)用酶的耐高溫能力有很高的要求。例如，高溫普魯蘭酶具有降低糖化溶液黏度和強化傳質(zhì)等優(yōu)點，然而，目前大多數(shù)普魯蘭酶是中溫型的。為了提高該酶的耐高溫能力，利用在線計算工具預測正向突變點是目前常用的策略之一。Bi 等[51]利用I-Mutant/FoldX 在線網(wǎng)絡(luò)工具預測酶的單點突變穩(wěn)定性，獲得芽孢桿菌普魯蘭酶突變體G692M。該突變體在70 ℃時Tm比野生型升高3.8 ℃，半衰期延長2.1 倍（見表3）。此外，作者還利用MD 模擬解析了該突變體熱穩(wěn)定性提高的分子機制：降低區(qū)域690～700 的RMSF 值，增強該區(qū)域的剛性，最終提高了該酶的熱穩(wěn)定性。有時單點突變的效果不明顯，需要通過多點突變來獲得穩(wěn)定性更高的酶。Chen 等[52]綜合利用BFITTER/PoPMuSiC 計算工具預測潛在突變位點，獲得普魯蘭酶多點突變體E518I-S662R-Q706P，該酶的最適溫度從60℃提高到65 ℃，60 ℃下的Tm升高了9.5 ℃，半衰期延長11 倍。MD 模擬分析表明多點突變增加了酶分子內(nèi)的氫鍵、疏水和靜電相互作用。另外，662位的精氨酸取代也可能對酶熱穩(wěn)定性有所貢獻。前期研究表明，精氨酸出現(xiàn)在嗜熱蛋白表面的頻率較高[53]，這一策略也用于提高淀粉酶[54]和α-L-鼠李糖苷酶[55]的耐熱性能。

單一計算策略提升酶穩(wěn)定性效果有限，多種計算策略聯(lián)用可大大提高其計算效率。Janssen等[66]開發(fā)了FRESCO 流程，該流程綜合利用計算機模擬軟件Rosetta DDG、FoldX 和二硫鍵Dynamic Disulfide Discovery 算法預測潛在突變點，然后利用MD 模擬去除結(jié)構(gòu)不合理的突變體，最后通過試驗驗證突變體的耐高溫能力。目前已利用FRESCO 策略獲得了許多耐高溫的酶，包括環(huán)己酮單加氧酶[67]、脂肪酶[56]、植酸酶[68]和羰基還原酶[69]等。

由于脯氨酸具有特殊的吡咯烷結(jié)構(gòu)，比其它殘基具有更少的構(gòu)象自由度，因此脯氨酸取代也是提升酶熱穩(wěn)定性的常用方法之一[70]。針對脂肪酶熱穩(wěn)定性不高的問題，Zhang 等[57]通過試驗與計算機模擬結(jié)合的方法獲得了耐高溫酶。整個試驗流程如下：①同源建模野生型酶的三維結(jié)構(gòu)；②野生型酶在不同溫度下的MD 模擬，以此確定RMSF值較高的氨基酸殘基位點，這些位點通常意味著所在區(qū)域構(gòu)象不穩(wěn)定，對這些位點進行脯氨酸替換可降低主鏈構(gòu)象自由度，增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性；③再次利用MD 模擬來篩選熱穩(wěn)定性好的突變體；④試驗驗證突變體的耐高溫性能（圖1）。利用上述試驗方法改造獲得耐高溫的突變體V213P。結(jié)果表明，V213P 突變體最適溫度比野生型高5.0℃，半衰期比野生型延長了70%。

3.2 提升酶的酸堿穩(wěn)定性

極端pH 值也是影響酶在工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。常規(guī)α-淀粉酶在低pH 值條件下易失活[71]。為了提高其耐酸性，Yang 等[58]首先基于枯草芽孢桿菌α-淀粉酶三維結(jié)構(gòu)，選擇位于活性位點空腔內(nèi)的堿性組氨酸His222、His275、His293 和His310 作為突變點，分別用酸性天冬氨酸替換得到4 個單點突變體，其中H222D 突變體失活；進一步構(gòu)建兩突變和三突變體，最終獲得耐酸性最好的突變體H275D/H293D/H310D，該突變體在pH 4.5 時Kcat/Km提高16.7 倍，保溫24 h 后初始活性保留92%，約為野生型3 倍。類似的突變策略用于GH11 木聚糖酶，基于氨基酸序列比對的分析結(jié)果，將堿性精氨酸、賴氨酸突變?yōu)楣劝滨０泛吞K氨酸，得到的兩株突變體比野生型具有更高的耐酸能力，在pH 3 的環(huán)境下，催化活性分別提高50%和40%[59]。反之，用堿性氨基酸替換酸性氨基酸，可提高酶在堿性環(huán)境下的穩(wěn)定性。例如：增加木聚糖酶中絲氨酸/蘇氨酸表面的精氨酸數(shù)量后，突變體的最適pH 值比野生型酶的最適pH 值高[60]。

表3 利用計算機輔助技術(shù)結(jié)構(gòu)改進食品工業(yè)用酶性能應(yīng)用實例Table 3 Application of computer-aided structural modification for improving the performance of food industrial enzymes

3.3 提升酶催化活性

利用計算機模擬解析酶的催化機理，進而通過適當增加底物與活性位點之間的親和力提高酶的催化性能。Chen 等[61]結(jié)合同源建模和分子對接模擬技術(shù)發(fā)現(xiàn)L-鼠李糖異構(gòu)酶的催化口袋中柔性loop 環(huán)對底物的親和性影響較大。為了提高其催化活性，將位于loop 環(huán)上的疏水殘基用極性氨基酸替換獲得V48N/G59N/I63N 和V48N/G59N/I63N/F335S 突變體，結(jié)果表明：上述兩個突變體的催化活性均得到大幅提高。最后，利用MD 模擬揭示了催化活性提高的分子機制為兩個關(guān)鍵殘基突變（V48N 和F335S）使得催化口袋收縮，從而增強了酶與底物分子中C6 位羥基的相互作用，最終提高了酶對底物的親和性（表3）。類似的策略也應(yīng)用于高效GH10 木聚糖酶的改造[62]。

N-糖基化修飾同樣也能提升酶的催化性能。N-糖基化修飾位點的選擇至關(guān)重要。為了選擇合適的修飾位點，Wang 等[63]基于β-葡萄糖醛酸苷酶的序列和三維結(jié)構(gòu)分析，選取位于loop/turn 區(qū)域且遠離活性中心的糖基化位點，獲得3 個糖基化的突變體。其中N28 位糖基化突變體的Km減小，Kcat/Km增加，表明突變體與底物的親和力增強，催化效率提升。同樣的策略應(yīng)用到β-木糖苷酶[64]、過氧化物酶[65]中，均通過增加N-糖基化位點成功提高了酶的催化活性（見表3）。

圖1 提高脂肪酶熱穩(wěn)定性的理性設(shè)計流程Fig.1 The rational design procedure for improving the thermostability of lipase

4 總結(jié)和展望

為了滿足規(guī)?；?、集約化的食品工業(yè)發(fā)展需求，研制性能優(yōu)良的食品工業(yè)用酶制劑，對食品工業(yè)的快速發(fā)展具有重要的意義。酶工程改造中借助計算機模擬技術(shù)可以更高效地獲得突變體，減少試驗工作量和縮短試驗周期，極大促進了人們對酶結(jié)構(gòu)與功能構(gòu)效關(guān)系的認識。隨著計算硬件和理論方法的發(fā)展，大數(shù)據(jù)及深度學習、人工智能的方法也開始應(yīng)用在食品工業(yè)用酶改造中[72-76]。這一數(shù)據(jù)驅(qū)動的技術(shù)為蛋白質(zhì)工程提供了新的開發(fā)思路，未來計算機輔助酶設(shè)計將向著更加智能和高效的方向發(fā)展。