●溫?fù)P敏 邱丹纓 羅彩林 謝永華（泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 福建 泉州 362000）

紅樹(shù)植物屬海區(qū)潮間帶的木本植物類群，其獨(dú)特的生境使紅樹(shù)植物富含結(jié)構(gòu)獨(dú)特、具有多種生物活性的化合物，天然的次生代謝產(chǎn)物是篩選藥物先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源[1]。紅樹(shù)植物的果實(shí)、皮和根等在民間長(zhǎng)期作為藥物使用，可用于麻風(fēng)病、糖尿病、風(fēng)濕病等一些常見(jiàn)疾病的治療，以及作為動(dòng)物創(chuàng)傷和中毒的外敷藥等。開(kāi)展紅樹(shù)林植物化學(xué)成份和藥理活性研究，對(duì)紅樹(shù)林資源的保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)具有重要意義。

秋茄（Kandelia candel）屬于紅樹(shù)科秋茄屬植物，是最耐寒的紅樹(shù)植物種類，廣泛分布于越南、印度、日本以及中國(guó)的福建、臺(tái)灣、廣東、廣西等地[2]。Majumdar 等[3]最早從秋茄葉中分離出三萜和甾醇化合物，后來(lái)研究者們陸續(xù)從秋茄中分離鑒定出甾醇、萜類、鞣質(zhì)類、黃酮類等具有一定生理活性的單體化合物。但目前對(duì)秋茄化合物的生理活性研究不夠深入，化學(xué)成分研究還處于起步階段。因此，研究秋茄的化學(xué)成分和生理活性，對(duì)秋茄資源的保護(hù)與利用以及新型先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)具有十分重要的意義[4]。本研究采用活性追蹤方法對(duì)泉州灣紅樹(shù)植物秋茄葉抗腫瘤活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化，為秋茄藥用成分的開(kāi)發(fā)與新型抗腫瘤藥物研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

秋茄葉采自泉州灣紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)洛陽(yáng)橋段，由泉州市紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)陳若海工程師鑒定。采回實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水洗凈后烘箱45℃烘干，粉碎機(jī)粉碎后備用。

1.2 主要儀器與試劑

AVANCE Ⅲ500M 核磁共振儀( 德國(guó)Bruker公司)；KHBST-360 型酶標(biāo)儀（上?？迫A科技公司）；紫外光譜儀( 英國(guó)Amersham Biosciences公司)；HF-90 型CO2培養(yǎng)箱（北京陽(yáng)光思特生物公司）；ESI-MS 質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo 公司)；酶標(biāo)儀（美國(guó)Dynex 公司）；食管癌細(xì)胞株（天呈科技生物公司）；反相柱層析硅膠RPC-18（德國(guó)Merck 公司)；胎牛血清（美國(guó)Hyclone 公司）；凝膠柱層析Sephadex LH-20 (上海宸喬生物科技有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)基（北京賽默飛世爾公司）；正相柱層析硅膠(青島海洋化工有限公司）。

1.3 提取與分離

提取分離流程見(jiàn)圖1。稱兩份質(zhì)量為2kg 的秋茄葉，分別用雙蒸水和95%乙醇浸泡3 次，每次24h，合并三次提取液，過(guò)濾蒸餾獲得浸膏。95%乙醇浸膏用水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，減壓回收溶劑，分別收集石油醚（357g）、乙酸乙酯（534g）和正丁醇（286g）萃取物。將乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱，用氯仿-甲醇梯度洗脫，分別收集氯仿-甲醇40∶1和10∶1 洗 脫2 個(gè) 組 份Fr.1（2 650mg）和Fr.2（1 960mg）。組份Fr.1 再經(jīng)聚酰胺柱，用石油醚-氯仿梯度洗脫，分別收集3個(gè)組份Fr.1-1（660mg）、Fr.1-2（730mg）和Fr.1-3（570mg）。組份Fr.1-1經(jīng)Sephadex LH-20 柱、氯仿-甲醇1∶1 洗脫，得到化合物1（92mg）；組份Fr.1-2 經(jīng)Sephadex LH-20 柱，氯仿-甲醇1∶1 洗脫，得到化合物2（86mg）；組份Fr.1-3 經(jīng)Sephadex LH-20 柱，氯仿-甲醇1∶1 洗脫，得到化合物3（88mg）和化合物4（79mg）。

圖1 秋茄葉化合物分離工藝流程圖

1.4 MTT 實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有方法[5]，在100 mL 細(xì)胞懸液中分別加入不同濃度待測(cè)藥物，培養(yǎng)72h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值，按以下公式計(jì)算腫瘤抑制率。

抑制率=（OD 對(duì)照-OD 實(shí)驗(yàn)）/OD 對(duì)照×100%

2 結(jié)果

2.1 秋茄葉水提物和乙醇提取物抗腫瘤活性

為研究秋茄葉水和乙醇提取物的抗腫瘤活性，分別進(jìn)行人食管癌EC-9706 細(xì)胞株抗腫瘤活性測(cè)定。細(xì)胞培養(yǎng)72h 后結(jié)果，見(jiàn)圖2。從圖2可以看出秋茄葉水提物和乙醇提取物對(duì)人食管癌EC-9706 細(xì)胞均有一定抑制效果。其中水提物和乙醇提取物對(duì)食管癌細(xì)胞抑制IC50為4.81mg/mL 和3.27mg/mL。不同濃度下，乙醇提取物的腫瘤抑制活性均顯著高于水提物（p＜0.05）。除0.2mg/mL外，乙醇提取物和水提物對(duì)食管癌細(xì)胞抑制活性存在極顯著差異（p＜0.01）。

圖2 秋茄葉水提物和乙醇提取物對(duì)人食管癌EC-9706 細(xì)胞的抑制活性

2.2 秋茄葉乙醇提取物不同萃取部分抗腫瘤活性

秋茄葉水提物和乙醇提取物抗腫瘤活性結(jié)果顯示，乙醇提取物對(duì)食管癌細(xì)胞體外抑制活性顯著高于水提物。因此，對(duì)乙醇提取物依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別測(cè)定不同萃取部分對(duì)人食管癌細(xì)胞體外抑制活性（圖3）。從圖3 可以看出，石油醚萃取部分對(duì)食管癌細(xì)胞抑制活性較差，其中濃度為0.5mg/mL 時(shí)，石油醚萃取部分對(duì)食管癌細(xì)胞抑制率最高為5.97%，但不同濃度之間對(duì)食管癌抑制活性無(wú)顯著差異（p＞0.05）。乙酸乙酯和正丁醇萃取部分對(duì)人食管癌均有較強(qiáng)抑制活性，其中對(duì)食管癌細(xì)胞抑 制IC50為2.10mg/mL 和3.01mg/mL。乙 酸 乙酯和正丁醇萃取部分對(duì)人食管癌抑制活性均隨濃度增加而增大。不同濃度下，乙酸乙酯萃取部分對(duì)食管癌抑制活性均極顯著高于正丁醇萃取部分（p＞0.01）。

圖3 秋茄葉乙醇提取物不同萃取部分對(duì)人食管癌EC-9706 細(xì)胞的抑制活性

2.3 硅膠柱分離各洗脫組分抗腫瘤活性

秋茄葉乙醇提取物不同萃取部分抗腫瘤活性結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取部分對(duì)人食管癌體外抑制活性最大，因此采用硅膠柱進(jìn)一步對(duì)乙酸乙酯萃取部分進(jìn)行分離，得到兩個(gè)組分（Fr.1 和Fr.2）。分別測(cè)定Fr.1 和Fr.2 對(duì)人食管癌細(xì)胞體外抑制活性（圖4）。從圖4 可以看出，不同濃度Fr.1 對(duì)人食管癌細(xì)胞均有一定抑制活性，且隨濃度增加抑制活性增大，其中對(duì)食管癌細(xì)胞抑制IC50為0.37mg/mL。而不同濃度Fr.2 對(duì)人食管癌細(xì)胞抑制活性均小于10%，且不存在劑量關(guān)系。Fr.1 對(duì)人食管癌細(xì)胞抑制活性極顯著高于Fr.2（p＜0.01）。

圖4 硅膠柱各洗脫組分對(duì)人食管癌EC-9706 細(xì)胞抑制活性

2.4 分離單體化合物抗腫瘤活性

Fr.1 和Fr.2 對(duì)人食管癌細(xì)胞體外抑制結(jié)果顯示，F(xiàn)r.1 的抗腫瘤活性顯著大于Fr.2。因此，采用聚酰胺柱和葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20）柱分離得到四個(gè)單體化合物。本文分別測(cè)定了四個(gè)化合物對(duì)人食管癌細(xì)胞體外抑制活性（圖5）。從圖5 可以看出四個(gè)化合物對(duì)人食管癌細(xì)胞均有一定抑制活性，且抑制活性均隨濃度增加和培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增大。細(xì)胞培養(yǎng)72h 后，化合物1、化合物2、化合物3 和化合物4 對(duì)食管癌細(xì)胞抑制IC50分別為27.28μg/mL、30.47μg/mL、93.17μg/mL 和34.10μg/mL。

圖5 秋茄分離單體化合物對(duì)人食管癌EC-9706 細(xì)胞的抑制活性

2.5 結(jié)構(gòu)鑒定

單體化合物抗腫瘤活性結(jié)果顯示，四個(gè)化合物均有一定抗腫瘤活性，所以分別對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2.5.1 化合物1白色粉末, mp 294～296℃。Liebermann-Burchard 反應(yīng)陽(yáng)性，Molish 反應(yīng)陰性。由HR-ESI-MS 得到分子式C30H48O3。ESI-MSm/z:456 [M]+。1H-NMR (400 MHz, C5D5N)δH: 4.94(1H, brs, H-29α), 4.76 (1H, brs, H-29β), 3. 52 (1H,d,J= 9. 8 Hz, H-19),3. 49 (2H, t,J= 7. 8 Hz, H-3),1.94 (3H, brs, H-30), 1.21 (3H, s,H-27), 1.06 (3H, s,H-26), 1.05 (3H, s, H-23), 1.00 (3H, s, H-25), 0.82(3H, s, H-24).以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[6]，加上與對(duì)照品呈現(xiàn)一致的Rf 值,故鑒定化合物為白樺脂酸（圖6-A）。

2.5.2 化合物2白色粉末, mp 275～276℃。Liebermann-Burchard 反應(yīng)陽(yáng)性，Molish 反應(yīng)陰性，溴甲酚綠反應(yīng)陽(yáng)性。ESI-MSm/z: 456 [M]+,分子式為C30H48O3。1H-NMR (400 MHz, C5D5N)δH: 5.48 (1H, t,J= 3.2 Hz, H-12), 3.47 (1H, dd,J=11.5, 4.8 Hz, H-3), 2.64 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-18),1.36 (3H, s, 29-CH3), 1.24 (3H, s, H-27), 1.21(3H, s, H-23β), 1.04 (3H, s,H-24α), 1.01 (3H, s,H-30), 0.94 (3H, s, H-26), 0.87 (3H, s, H-5). 以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[7],加上與對(duì)照品呈現(xiàn)一致的Rf 值,故鑒定化合物為熊果酸（圖6-B）。

2.5.3 化合物3白色粉末, mp 253～255℃。Liebermann-Burchard 反應(yīng)陽(yáng)性，茴香醛顯色為紫紅色。EI-MSm/z:442[M]+。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δH:4.67(1H,s,H-29α),4.57(1H,s,H-29β),4.03(1H,d,J=9.8Hz,H-28b),3.32(1H,d,J=9.8 H z,H-2 8 a),3.1 8(2 H,t,J=7.8 H z,H-3),2.38(1H,m,H-19),1.93(3H,s,H-30),1.01(3H,s,H-26),0.96(3H,s,H-23),0.81(3H,s,H-25),0.75(3H,s,H-24)以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8],加上與對(duì)照品呈現(xiàn)一致的Rf 值,故鑒定化合物為白樺脂醇（圖6-C）。

2.5.4 化合物4白色粉末，mp 213～215℃。Liebermann-Burchard 反應(yīng)陽(yáng)性，茴香醛顯色為紫紅色，三氯醋酸反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z:427[M ＋ H]+。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δH:4.68(1H,d,J=2.4Hz,H-29a),4.58(1H,d,J=2.4Hz,H-29b),3.19(1H,dd,J=11.4,4.8Hz,H-3),1.68(3H,s,H-30),1.03(3H,s,H-26),0.97(3H,s,H-23),0.94(3H,s,H-27),0.83(3H,s,H-25),0.79(3H,s,H-28),0.76(3H,s,H-24)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[9],加上與對(duì)照品呈現(xiàn)一致的Rf 值,故鑒定化合物為羽扇豆醇（圖6-D）。

圖6 秋茄葉中分離化合物的分子結(jié)構(gòu)

3 討論

秋茄是一種常見(jiàn)的紅樹(shù)植物，生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶海岸潮間帶特殊生境，不僅具有重要的生態(tài)意義，還具有重要經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值[10]。由于秋茄所處的特殊生長(zhǎng)環(huán)境，已從秋茄中分離出多種具有特定生理功能的化合物。Majumdar 等[3]從秋茄葉分離出β-香樹(shù)脂醇、木醛酮、蒲公英甾醇3 個(gè)三萜化合物和1 個(gè)甾醇化合物β-谷甾醇。Ghoshet 等[11]從秋茄的樹(shù)皮中分離出包括6 個(gè)新鞣質(zhì)類化合物。盧昌義等[12]等對(duì)秋茄葉脂肪酸組成研究表明秋茄葉中脂肪酸碳鏈多為12～28 個(gè)碳原子，富含軟脂酸和硬脂酸等飽和脂肪酸，油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸。從秋茄葉中分離出黃酮化合物蘆丁對(duì)動(dòng)脈樣硬化和高血壓有一定治療作用。秋茄作為海洋藥用植物已經(jīng)被《現(xiàn)代本草綱目》收錄[13]。

腫瘤是當(dāng)前危害人類健康的主要疾病之一，研究表明秋茄的皮、果實(shí)、葉子等均有不同程度抗腫瘤活性。研究證實(shí)秋茄乙醇提取物對(duì)人鼻癌細(xì)胞CNE-1 具有抑制作用[14]。本研究結(jié)果顯示秋茄葉乙醇提取物對(duì)人食管癌細(xì)胞體外抑制活性顯著高于水提取物。陳虹等[15]研究表明，秋茄根石油醚提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16 和人胃癌細(xì)胞BCG803 等均有體外抑制活性，其半致死濃度IC50分別為335.2μg/mL、378.6μg/mL 和275.6μg/mL。 本 研究結(jié)果與以上結(jié)論相似，顯示秋茄葉乙醇提取物的石油醚萃取部分對(duì)人食管癌細(xì)胞具有體外抑制活性，其中秋茄葉乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分對(duì)人食管癌細(xì)胞體外抑制活性顯著高于石油醚萃取部分。

為克服天然產(chǎn)物傳統(tǒng)的先分離化合物再進(jìn)行活性測(cè)定研究模式的盲目性，有效提高分離抗腫瘤活性物質(zhì)的準(zhǔn)確性。本研究以對(duì)人食管癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)抑制活性為指標(biāo)，采用活性追蹤的方式從秋茄葉中得到的4 個(gè)三萜類單體化合物：白樺脂酸、熊果酸、白樺脂醇和羽扇豆醇。且4 個(gè)三萜類單體化合物對(duì)人食管癌細(xì)胞均具有一定體外抑制活性，其結(jié)果與其他研究一致[16-17]。證實(shí)秋茄中含有多種抗腫瘤活性成分，具有重要的抗腫瘤等藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值。未來(lái)有待進(jìn)一步研究秋茄活性成分的抗腫瘤機(jī)制，為新型抗腫瘤藥物及紅樹(shù)植物開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。