鄒明靜 丁冠聞 李志瑩 劉曉松 馬先鑫

摘? ? ? 要： 在pH=5.91的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液中，多巴胺通過靜電作用使銀納米顆粒聚集，導(dǎo)致其局域表面等離子體共振性質(zhì)改變，使體系的共振光散射強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。當(dāng)多巴胺質(zhì)量濃度在0.002～0.80 μg·mL-1之間時(shí)，共振光散射強(qiáng)度的增強(qiáng)值ΔI490nm與多巴胺的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，可得線性方程為ΔI490nm=? ?1 092.5ρ+6.25，檢出限（3σ）為0.2 ng·mL-1，據(jù)此建立了一種快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)多巴胺新方法。已將本方法用于市售鹽酸多巴胺注射液的檢測(cè)，并與高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果比較，測(cè)定結(jié)果可靠。

關(guān)? 鍵? 詞：銀納米顆粒;多巴胺;局域表面等離子體共振;散射

中圖分類號(hào)：O657.39? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A? ? ? ?文章編號(hào)： 1671-0460（2020）09-1880-04

Abstract： In pH=5.91 Na2HPO4-KH2PO4 buffer solution， silver nanoparticles were aggregated by the electrostatic interaction between dopamine and silver nanoparticles， so the surface plasmon resonance properties of silver nanoparticles were changed and the resonance light scattering intensity at 490 nm enhanced greatly. There was a good linear relationship between the intensity ΔI490nm and the mass concentration of dopamine in the range of 0.002～0.80 μg·mL-1， with the calibration equation of ΔI490nm=1 092.5ρ+6.25 and its detection limit of 0.2 ng·mL-1 （3σ）. Owing to its speediness and simplicity， the method was applied in the determination of dopamine hydrochloride injection， the determination results were compared with that by determined high performance liquid chromatography. The results have proved that the method is reliable.

Key words： Silver nanoparticles; Dopamine; Local surface plasma resonance; Scattering

多巴胺（DA）為人腦所分泌的一種神經(jīng)遞質(zhì)，其可參與調(diào)節(jié)人體心血管、腎臟、內(nèi)分泌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各項(xiàng)生理活動(dòng)，若人體DA分泌失調(diào)可能誘發(fā)心臟病、帕金森病、精神分裂癥和癲癇病等疾病[1-3]。而且，人工合成DA可作為藥物用于心肌梗死、腎功能衰竭和感染性昏迷等癥狀的治療[4-5]。因此，構(gòu)建DA快捷、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法可為其生理功能研究和相關(guān)疾病的臨床診斷治療提供參考，具有重要的臨床意義，目前其常用的測(cè)定方法主要有電化學(xué)方法、熒光光度法和高效液相色譜法等。電化學(xué)方法應(yīng)用較為廣泛，通常利用DA酚羥基的電化學(xué)活性進(jìn)行定量檢測(cè)，但由于DA易在金、鉑等裸電極表面下形成較高過電位導(dǎo)致該類方法靈敏度較低，近年來發(fā)展的化學(xué)修飾電極較好克服了DA過電位高的不足，但該類方法電極修飾過程仍較為復(fù)雜[6-7]。熒光法常采用量子點(diǎn)與DA相互作用而產(chǎn)生熒光信號(hào)變化，該類方法檢測(cè)靈敏度高，但仍存在熒光猝滅的問題[8-9]。高效液相色譜法常用于復(fù)雜樣本中DA的分離分析，方法可靠，但該方法因儀器昂貴且耗時(shí)導(dǎo)致檢測(cè)成本較高，其應(yīng)用易受到限? 制[10]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，金屬納米顆粒可因特定物質(zhì)或反應(yīng)的誘導(dǎo)發(fā)生聚集，其顆粒間距離的變化則導(dǎo)致其原有的表面等離子體共振性質(zhì)改變，并由此產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的光散射信號(hào)[11-14]。其中，金屬銀納米顆粒因其具有的等離子體共振散射特性已被應(yīng)用于藥物小分子檢測(cè)、氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸分析等領(lǐng)域[15-18]。故本文基于銀納米顆粒的表面等離子體共振散射特性，構(gòu)建了一種測(cè)定DA的新方法，用于鹽酸多巴胺注射液的分析，并與高效液相色譜方法對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果可靠。

1? 實(shí)驗(yàn)部分

1.1? 儀器和試劑

納米粒度與Zeta電位分析儀，Zetasizer Nano ZSE，Malvern;磁力加熱攪拌器，TP-350S，杭州米歐;熒光分光光度計(jì)，CRT970，上海精密;高效液相色譜儀，LC-20AT，Shimadzu;紫外-可見分光光度計(jì)，UV2100，北京瑞利;軌道式搖床，GS-20，杭州米歐;超純水儀，上海芷昂。

鹽酸多巴胺，Sigma;10 mg·mL-1硝酸銀，上海國(guó)藥;10 mg·mL-1檸檬酸鈉，上海國(guó)藥; 0.005 mol·L-1十二烷基硫酸鈉，上海國(guó)藥; 4-乙基鄰苯二酚，Aladdin;乙腈，西隴化工;冰乙酸，上海國(guó)藥;? ? ?0.1 mol·L-1乙二胺四乙酸二鈉，上海國(guó)藥;Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液：準(zhǔn)確移取KH2PO4溶液（0.067 mol·L-1）與KH2PO4溶液（0.067 mol·L-1）并按一定比例混勻;實(shí)驗(yàn)均采用符合18.2 M?·cm純水。

1.2? ?方法

合成銀納米顆粒：移取100 mL超純水至錐形瓶中，準(zhǔn)確加入新鮮配制0.35 mg·mL-1 AgNO3溶液4.00 mL，加熱至沸騰。在磁力加熱攪拌作用下，緩慢加入2.00 mL 10 mg·mL-1檸檬酸鈉溶液，加速攪拌并保持沸騰30 min。將制備的銀膠溶液自然冷卻，定容至100 mL，4 ℃保存，通過動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定銀納米顆粒的粒徑。

在5 mL比色管中，依次加入0.50 mL pH=5.91 Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液、鹽酸DA標(biāo)準(zhǔn)溶液、? 2.25 mL銀膠溶液，準(zhǔn)確稀釋至5.00 mL，混勻，室溫反應(yīng)15 min后掃描體系的紫外-可見吸收光譜和共振光散射光譜。共振光散射光譜掃描條件：在熒光分光光度計(jì)工作界面設(shè)置λex=λem，靈敏度2，同步掃描，選擇490 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2? 結(jié)果與討論

采用檸檬酸鈉還原法合成的銀納米顆粒表面被檸檬酸根包被而帶負(fù)電。若控制適宜的pH條件，DA鹽酸鹽在溶液中可帶正電，其可通過靜電作用誘使帶負(fù)電的銀納米顆粒聚集，聚集現(xiàn)象的發(fā)生改變了銀納米顆粒的局域表面等離子體共振性質(zhì)，使體系共振光散射增強(qiáng)，據(jù)此通過檢測(cè)體系的共振光散射信號(hào)變化可建立DA檢測(cè)的新方法。

2.1? 動(dòng)態(tài)光散射

以檸檬酸還原法獲得銀納米顆粒平均粒徑約為6 nm，如圖1（a）所示。當(dāng)DA與銀納米顆粒相互作用后，其粒徑約為110 nm，見圖1（b）。結(jié)果表明，在適宜的pH條件下，DA誘使銀納米顆粒發(fā)生聚集。

2.2? 吸收光譜

銀膠溶液呈澄清亮黃色，在420 nm處存在表面等離子體共振吸收，隨DA加入量逐漸增加時(shí)，在420 nm處的吸收峰強(qiáng)度值逐漸減弱（圖2），體系溶液的顏色亮黃色至棕黃色。結(jié)果表明，當(dāng)銀納米顆粒在DA作用下發(fā)生聚集后，其局域等離子體共振吸收被抑制。

2.3? 共振光散射光譜

DA鹽酸鹽溶液僅有微弱的共振光散射信號(hào)。銀膠溶液在490 nm處存在較弱的共振光散射信號(hào)。當(dāng)在銀膠溶液中加入DA溶液后，隨DA加入量逐漸增加時(shí)，體系在490 nm處的共振光散射強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（圖3）。結(jié)果表明，DA通過靜電作用誘使銀納米顆粒聚集，其局域表面等離子體共振性質(zhì)改變可使體系的等離子體共振散射增強(qiáng)。本文選擇了490 nm的共振光散射強(qiáng)度用于后續(xù)測(cè)定。

2.4? 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.4.1? 優(yōu)化緩沖條件

實(shí)驗(yàn)考察了pH=4.49～6.98 Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液對(duì)體系ΔI490nm的影響。實(shí)驗(yàn)表明，體系的? ?ΔI490nm在pH=4.92～6.47 Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液中均較為穩(wěn)定，當(dāng)pH=5.91時(shí)，體系ΔI490nm最大（圖4）。故選用pH=5.91 Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液，在本實(shí)驗(yàn)中加入該pH值緩沖溶液0.50 mL。

2.4.2? 優(yōu)化銀膠溶液用量

銀膠溶液用量對(duì)體系ΔI490nm影響如圖5。結(jié)果表明，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，ΔI490nm隨銀膠溶液加入量的增加而相應(yīng)增強(qiáng)。當(dāng)銀膠溶液用量在2.00～2.50 mL（ρAg=5.53～6.91 μg·mL-1）時(shí)，ΔI490nm較大。本文選擇了2.25 mL銀膠溶液，即 6.22 μg·mL-1銀膠溶液。

2.4.3? 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)溫度與反應(yīng)時(shí)間

考察了實(shí)驗(yàn)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系ΔI490nm的影響。選擇了10、20、30、40 ℃分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在10～40 ℃溫度條件下，體系ΔI490nm均能在10 min后即趨于穩(wěn)定。由于溫度對(duì)該反應(yīng)體系影響較小，本文選在室溫條件下，于搖床振蕩反應(yīng)15 min 后用于測(cè)定。

2.4.4? 工作曲線

按照優(yōu)化后的最佳實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定不同DA質(zhì)量濃度相應(yīng)的ΔI490nm，ΔI490nm= I490nm – （I490nm）b，以DA質(zhì)量濃度ρ對(duì)ΔI490nm作圖，DA在0.002～0.80 μg·mL-1范圍內(nèi)與共振光散射強(qiáng)度增強(qiáng)值ΔI490 nm線性相關(guān)，其方程為ΔI490nm=1 092.5ρ+6.25，相關(guān)系數(shù)R=0.993 2，檢出限（3δ）為0. 2 ng·mL-1，該方法可靈敏檢測(cè)DA。

2.4.5? 方法選擇性

在測(cè)定0.40 μg·mL-1 DA時(shí)，控制相對(duì)誤差在±10%之間，考察方法的選擇性，100倍葡萄糖、葉酸、維生素C、蔗糖、Na+、Mn2+、K+、Zn2+、Ca2+對(duì)測(cè)定無明顯干擾，該方法的選擇性良好。

2.5? 樣品測(cè)定

準(zhǔn)備不同藥業(yè)公司生產(chǎn)的鹽酸多巴胺注射液，分別移取100 μL注射液至100 mL容量瓶并準(zhǔn)確定容，即為DA稀釋液。取200 μL DA稀釋液按本法測(cè)定，并采用高效液相色譜法（HPLC法）作為對(duì)照方法[19]，測(cè)定結(jié)果一致（表1）。對(duì)鹽酸多巴胺注射液采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收試驗(yàn)，測(cè)得回收率在98.3%～105.0%之間，如表2所示。樣品分析及回收試驗(yàn)均表明，該法用于測(cè)定鹽酸多巴胺注射液中DA質(zhì)量濃度準(zhǔn)確可靠。

3? 結(jié) 論

DA與銀納米顆粒體系的共振光散射光譜、吸收光譜及動(dòng)態(tài)光散射變化均證實(shí)，合適的pH緩沖環(huán)境可使DA帶正電，與帶負(fù)電的銀納米顆粒發(fā)生靜電吸引作用可使銀納米顆粒聚集。聚集現(xiàn)象的發(fā)生使銀納米顆粒原有的局域表面等離子體共振性質(zhì)被改變，其等離子體共振吸收被抑制而等離子體共振散射則增強(qiáng)，故體系在490 nm產(chǎn)生了顯著的共振散射光信號(hào)，且散射光強(qiáng)度增強(qiáng)值與DA質(zhì)量濃度呈現(xiàn)線性相關(guān)，其已用于鹽酸多巴胺注射液的檢測(cè)，并進(jìn)行了方法對(duì)照和加標(biāo)回收試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果可靠，建立了通過共振光散射光譜測(cè)定DA注射液的新方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]REDGRAVE P， GURNEY K. The short-latency dopamine signal： a role in discovering novel actions[J]. Nature Reviews Neuroscience， 2006， 7 （12）： 967-975.

[2]王歡，李芳，陳曉英，等.谷胱甘肽包覆的碲化鎘量子點(diǎn)熒光探針法快速測(cè)定多巴胺[J].當(dāng)代化工，2015，40（10）：2497-2499.

[3]XING F， HU X， JING J， et al.A meta-analysis of low-dose dopamine in heart failure[J]. International Journal of Cardiology，2016，222： 1003-1011.

[4]GRACE A A. Dysregulation of the dopamine system in the patho- physiology of schizophrenia and depression[J]. Nature Reviews Neuroscience，2016，17（8）：524-532.

[5]SU H， SUN B， CHEN L， et al. Colorimetric sensing of dopamine based on the aggregation of gold nanoparticles induced by copper ions[J]. Analytical Methods，2012，4（12）：3981-3986.

[6]ROBINSON D L，HERMANS A， SEIPEL A T，et al.Monitoring rapid chemical communication in the brain[J]. Chemical Review，2008，108： 2554-2584.

[7]CHANDRA U， SWAMY B， KUMER M， et al.Simple flame etching of pencil electrode for dopamine oxidation in presence of ascorbic acid and uric acid[J]. International Journal of Nanotechnology，2017，14（9）： 739-751.

[8]AMIN N， AFKHAMI A， HOSSEINZADEH L， et al.Ratiometric bioassay and visualization of dopamine β-hydroxylase in brain cells utilizing a nanohybrid fluorescence probe[J]. Analytica Chimica Acta， 2020， 1105： 187-196.

[9]ZHAO J， ZHAO L， LAN C， et al.Graphene quantum dots as effective probes for label-freefluorescence detection of dopamine[J]. Sensors and Actuators B： Chemical，2016，223：246-251.

[10]RIBEIRO R P， GASOARETT J C， DEVO R O， et al.Simultaneous determination of levodopa， carbidopa， entacapone， tolcapone， 3-O-methyldopa and dopamine in human plasma by an HPLC MS/MS method[J]. Bioanalysis，2015，7（2）：207-220.

[11]YANG Y C， TSENG W L. 1，4-Benzenediboronic-Acid-Induced Aggregation of Gold nanoparticles： application to hydrogen peroxide detection and biotin-avidin-mediated immunoassay with naked-eye detection[J]. Analytical Chemistry， 2016， 88（10）： 5355-5362.

[12]KINOSHITAT，KISO K， LE D， et al. Light scattering characteristics of metal nanoparticles on a single bacterial cell [J]. Analytical Science， 2016，32（3）：301-305.

[13]LEE G J，KANG M，KIM Y，et al.Optical assessment of chiral-achiral polymer blends based on surface plasmon resonance effects of gold nanoparticles[J]. Journal of Physics D： Applied Physics，2019，53（9）： 95102.

[14]鄒明靜，王娜. 基于納米金等離子體共振光散射法測(cè)定阿米卡星[J].河北工業(yè)科技，2017，34（1）：18-22.

[15]DLIMA L，PHADKE M，ASHOK V D. Biogenic silver and silver oxide hybrid nanoparticles： a potential antimicrobial against multi drug-resistant Pseudomonas aeruginosa[J]. New Journal of Chemistry，2020，44（12）：4935-4941.

[16]NAQVI S，ANWER H，AHMED S，et al. Synthesis and characterization of maltol capped silver nanoparticles and their potential application as an antimicrobial agent and colorimetric sensor for cysteine[J]. Spectrochimica Acta Part A： Molecular and Biomolecular Spectroscopy， 2019， 229：11802.

[17]HEIDARZADEH H. Highly sensitive plasmonic biosensor based on ring shape nanoparticles for the detection of ethanol and D-glucose concentration[J]. IEEE Transactions on Nanotechnology，2020，19： 397-404.

[18]JANG K， PARK C， PARK? W，et al. A method for highly sensitive detection of silver nanoparticles using a micro-resonator and DNA assisted conjugation[J]. Journal of Mechanical Science and Technology，2020，34（4）：1675-1681.

[19]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S]. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.