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        基于低場(chǎng)核磁共振技術(shù)分析離子液體對(duì)水稻萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

        2020-11-30 12:50:16羅海艷
        關(guān)鍵詞:低場(chǎng)波譜反演

        徐 靜,宋 平,苗 騰,金 莉,羅海艷

        (沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息與電氣工程學(xué)院,沈陽(yáng) 110161)

        水稻是一種重要的糧食作物,中國(guó)是世界最大的稻谷消費(fèi)國(guó),水稻的總產(chǎn)量居世界之首。 離子液體(ionic liquids, ILs)是在室溫或室溫鄰近溫度下由離子構(gòu)成的呈液體的有機(jī)物質(zhì),因其高熱穩(wěn)定性和非易燃性,在分離工程、有機(jī)合成、電化學(xué)及材料加工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[1-2],被稱為替代傳統(tǒng)揮發(fā)性有機(jī)溶劑的“綠色溶液”。但是,離子液體在水中的溶解度較高,不易降解[3],因此在環(huán)境降解、殘留等方面具有潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。隨著離子液體研究的不斷深入,以及應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展,其殘留物不可避免的要流失到自然環(huán)境中,其生態(tài)毒性已引起研究者的關(guān)注。有關(guān)研究表明,離子液體對(duì)藻類[4]、微生物[5-6]、動(dòng)物[7]會(huì)產(chǎn)生不同程度的毒性,對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生抑制影響[8-10]。 低場(chǎng)核磁共振(low field nuclear magnetic resonance, LF-NMR)是一種非損傷、非侵入式的分析檢測(cè)技術(shù),通過(guò)質(zhì)子核共振譜弛豫時(shí)間,進(jìn)行核磁共振波譜分析(magnetic resonance spectroscopy, MRS)獲取樣本內(nèi)部水分含量和分布的信息,實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本無(wú)損、快速檢測(cè),被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)食品、石油化工、材料科學(xué)等領(lǐng)域[11-16]。宋平等[17]應(yīng)用低場(chǎng)核磁共振技術(shù),開展水稻種子侵種過(guò)程內(nèi)部水分流動(dòng)的研究。渠琛玲等[18]利用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)研究干燥過(guò)程中花生仁內(nèi)部含水率的變化,建立干燥過(guò)程花生仁含水率預(yù)測(cè)模型。 程天賦等[19]基于低場(chǎng)核磁共振橫向弛豫時(shí)間分析解凍過(guò)程中肌原纖維水的分布及流動(dòng)性與雞肉食用品質(zhì)間的聯(lián)系。 但利用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)檢測(cè)離子液體脅迫下萌發(fā)期種子內(nèi)部水分變化的研究鮮有報(bào)道。 本研究以水稻種子為研究對(duì)象,以低場(chǎng)核磁共振波譜分析為手段,分析在不同質(zhì)量濃度的離子液體溴化鹽([HMIM]Br)脅迫處理下,萌發(fā)期水稻種子的吸水率及吸水情況的變化規(guī)律,明確離子液體對(duì)種子吸水量和水稻幼苗生長(zhǎng)的影響,以期為離子液體的安全使用及有關(guān)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供一定的參考依據(jù),并提供一種快速無(wú)損的檢測(cè)方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        本研究以水稻種子為試驗(yàn)對(duì)象,供試水稻種子品種為美鋒669,來(lái)自遼寧東亞種業(yè)有限公司。 離子液體為溴化鹽([HMIM]Br),由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院無(wú)機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。 試驗(yàn)于2019 年4~6 月在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院核磁共振檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,試驗(yàn)選擇飽滿、外形均勻的水稻種子1600 粒,每40 粒為1 組,共40 組, 稱重后用蒸餾水洗凈在恒溫下泡發(fā)24h, 然后將每組40 粒種子分別均勻擺放在裝有質(zhì)量濃度為4,6,8,10,12,14,16mg·L-1的溴化鹽的培養(yǎng)皿中,每個(gè)濃度重復(fù) 5 次,以蒸餾水培養(yǎng)作為對(duì)照,在 28℃恒溫箱中進(jìn)行催芽。 催芽48h 后,將不同濃度處理及對(duì)照組水稻種子從培養(yǎng)皿中取出,利用低場(chǎng)核磁共振儀獲取樣本的橫向弛豫時(shí)間的反演譜,分析樣本中水分子的流動(dòng)特性。測(cè)完數(shù)據(jù)后的樣本,繼續(xù)放回對(duì)應(yīng)培養(yǎng)皿中,在培養(yǎng)箱中進(jìn)行育苗。培養(yǎng)箱光照由弱到強(qiáng)共有4 種選擇(0~3),模擬種子發(fā)育的自然條件,將培養(yǎng)箱設(shè)置為2h 25℃2 光照,8h 28℃ 3 光照,2h 26℃ 1 光照,12h 26℃ 0 光照,相對(duì)濕度90%,每天定時(shí)更換培養(yǎng)皿中各濃度的離子液體。在120h,檢測(cè)水稻種子的發(fā)芽勢(shì)。在336h,檢測(cè)水稻種子的發(fā)芽率。在144,192,216,240,264h 用直尺測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)選取的10 株幼苗的苗長(zhǎng)。

        1.2 試驗(yàn)設(shè)備

        本研究利用低場(chǎng)核磁共振分析儀 NNMI20-015V-I(上海紐邁電子科技有限公司),磁場(chǎng)強(qiáng)度(0.5±0.08)T,射頻脈沖頻率18MHz;磁體溫度32℃;探頭線圈直徑5mm。 智能人工氣候培養(yǎng)箱RTOP-268D(浙江托普儀器有限公司),控溫范圍 0~50℃,溫度波動(dòng)度±0.5℃,溫度均勻度±1℃,控濕范圍 50%~95%RH,溫度波動(dòng)±5%RH,可設(shè)定 1~30 個(gè)溫度、時(shí)間、光照段。

        1.3 方法

        1.3.1 核磁共振技術(shù) 核磁共振技術(shù)主要包括核磁共振波譜分析和核磁共振成像。 其中核磁共振波譜分析是利用核磁共振信號(hào)經(jīng)傅立葉轉(zhuǎn)換得到波譜信號(hào),利用波譜信號(hào)進(jìn)行定量分析檢測(cè),主要通過(guò)橫向弛豫時(shí)間T2反演波譜反映樣本內(nèi)部水分子分布情況。核磁共振成像是利用核磁共振基本原理,依據(jù)所釋放的能量在物質(zhì)內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)環(huán)境中不同的衰減,通過(guò)外加梯度磁場(chǎng)檢測(cè)所發(fā)射出的電磁波,得到構(gòu)成物體原子核的位置和種類,經(jīng)電子計(jì)算機(jī)繪制出物體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)圖像。 本研究主要采用核磁共振波譜分析技術(shù)。

        1.3.2 核磁共振波譜試驗(yàn) 水稻種子在恒溫箱中催芽48h 后, 利用低場(chǎng)核磁共振儀獲取樣本的橫向弛豫時(shí)間的反演譜。核磁共振波譜分析系統(tǒng)中,硬脈沖回波(carr-purcell-meiboom-gill sequence, CPMG)序列參數(shù)是根據(jù)硬脈沖自由感應(yīng)衰減(free induction decay, FID)序列尋找的中心頻率及硬脈沖脈寬設(shè)置的。 試驗(yàn)前,首先將標(biāo)準(zhǔn)油樣試管放置于低場(chǎng)核磁共振分析儀磁體箱的中心位置,通過(guò)FID 序列標(biāo)定中心頻率及90°,180°脈沖脈寬。本試驗(yàn)設(shè)置的參數(shù)值為:主頻 SF=21MHZ,90°脈沖脈寬 P1=17.52 μs,180°脈沖脈寬 P2=35.52 μs。 然后將不同濃度處理及對(duì)照組水稻種子從培養(yǎng)皿中取出,用吸水紙吸干樣品表面水分,將其裝入試管中放入磁體箱的中心位置,利用CPMG 脈沖序列進(jìn)行檢測(cè),獲取不同質(zhì)量濃度離子液體處理下的水稻種子的T2反演波譜。CPMG 脈沖序列參數(shù)值為:回波個(gè)數(shù)NHCH=6000,重復(fù)次數(shù)NS=16,每個(gè)樣本重復(fù)采樣4 次獲得樣本的T2弛豫時(shí)間,并通過(guò)反演運(yùn)算得到樣本的T2反演波譜。

        1.3.3 指標(biāo)測(cè)試 樣本種子指標(biāo)的測(cè)定按種子質(zhì)量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。 水稻種子發(fā)芽試驗(yàn)的初次計(jì)數(shù)時(shí)間為5d,末次計(jì)數(shù)時(shí)間為14d。 分別在120h 和336h 測(cè)定不同質(zhì)量濃度離子液體處理的樣本發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率, 并在144,192,216,240,264h 用直尺測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)選取的10 株幼苗的苗長(zhǎng)。

        1.3.4 數(shù)據(jù)處理 本研究核磁共振采集分析軟件為上海紐邁電子科技有限公司的紐邁核磁共振分析應(yīng)用軟件,采集CPMG 脈沖序列核磁信號(hào),每組樣本重復(fù)4 次,將平均值進(jìn)行核磁共振反演得到樣本的T2反演波譜。將樣本的 T2反演波譜數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS 21.0(IBM,Chicago,USA)和 Hxcel 2013(Microsoft,USA)進(jìn)行處理。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同質(zhì)量濃度離子液處理的水稻種子萌發(fā)期水分分布

        根據(jù)低場(chǎng)核磁共振原理可知,橫向弛豫時(shí)間T2與氫質(zhì)子的種類及所處狀態(tài)存在密切關(guān)系,橫向弛豫時(shí)間的長(zhǎng)短反映樣本內(nèi)部水分自由度的大小,通常橫向弛豫時(shí)間分成短橫向弛豫時(shí)間和長(zhǎng)橫向弛豫時(shí)間,其中橫向弛豫時(shí)間在0.1~10ms,看作短弛豫時(shí)間,代表樣本內(nèi)部結(jié)合水分布情況,在10~100ms,看作長(zhǎng)弛豫時(shí)間,代表樣本內(nèi)部自由水分布情況。 對(duì)于不同質(zhì)量濃度離子液處理下的水稻種子,在處理的第48h 獲取每組種子樣本的核磁共振 T2反演波譜數(shù)據(jù),在反演頻率為 10000 時(shí),對(duì)照組和質(zhì)量濃度為 4,6,8,10,12,14,16mg·L-1的 T2反演波譜(圖1)。 T2反演波譜數(shù)據(jù)橫坐標(biāo)為橫向弛豫時(shí)間,縱坐標(biāo)為單位質(zhì)量濃度樣品核磁共振信號(hào)幅值,橫向弛豫時(shí)間越大,代表水分子的結(jié)合性越稀疏,核磁共振信號(hào)幅值越強(qiáng),樣本內(nèi)部含水率越大。 由圖1 可知,對(duì)照組和不同質(zhì)量濃度離子液處理下的水稻種子樣本T2反演波譜均有2 個(gè)波峰, 橫向弛豫時(shí)間0.1~10ms 和10~100ms,隨著離子液質(zhì)量濃度的增大,種子樣本內(nèi)部結(jié)合水和自由水的峰面積均表現(xiàn)為逐漸減小,可以看出在離子液的處理下,水稻種子樣本的含水率在不斷減小,表明由于離子液的處理限制了水稻種子的吸水能力,離子液質(zhì)量濃度越大,限制作用越大。

        圖1 不同質(zhì)量濃度處理下水稻種子的T2 反演波譜Figure 1 T2 inversion spectrum of rice seeds under different solutions

        2.2 不同質(zhì)量濃度離子液處理的水稻種子各相態(tài)水分含量

        種子水分是種子維持其正?;盍Φ谋匦栉镔|(zhì),種子水分的含量通常是測(cè)定種子內(nèi)部結(jié)合水和自由水的含量。 有關(guān)研究顯示,核磁共振橫向弛豫譜信號(hào)幅值與種子內(nèi)部含水率具有顯著的線性關(guān)系[20-22],可以利用核磁共振信號(hào)幅值估測(cè)種子內(nèi)部含水率情況。 本研究利用核磁共振T2反演波譜,獲取不同質(zhì)量濃度離子液處理的水稻種子樣本核磁共振信號(hào)幅值(圖2)。 由圖2 可知,在離子液的處理下,水稻種子樣本中結(jié)合水和自由水的含量有著明顯的差異,隨著離子液質(zhì)量濃度的增大,水稻種子樣本內(nèi)部的結(jié)合水和自由水的含量減小,吸水能力下降,并在質(zhì)量濃度大于等于8mg·L-1變化顯著。

        圖2 不同質(zhì)量濃度處理下水稻種子各相態(tài)水分Figure 2 Phase state water of rice seeds under different solutions

        2.3 不同質(zhì)量濃度離子液處理對(duì)水稻種子發(fā)芽的影響

        對(duì)不同質(zhì)量濃度離子液處理的水稻種子樣本核磁共振橫向弛豫時(shí)間信號(hào)數(shù)據(jù)的分析,可以看出離子液對(duì)水稻種子的吸水能力具有一定的抑制作用,并隨著濃度的增大抑制作用越明顯。 為了進(jìn)一步確定這種影響,在培養(yǎng)箱中進(jìn)行育苗,并分別在120h 和336h 對(duì)水稻種子樣本統(tǒng)計(jì)發(fā)芽力(表 1)。 在 144,192,216,240,264h 用直尺測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)選取的10 株幼苗的苗長(zhǎng)(表2)。 由表1 和表2 可知,隨著離子液質(zhì)量濃度增大,水稻種子的發(fā)芽能力呈下降趨勢(shì), 幼苗的生長(zhǎng)受到抑制。 這與核磁共振的檢測(cè)結(jié)果一致。

        表2 不同質(zhì)量濃度處理下水稻幼苗苗長(zhǎng)Table 2 Seedling length under different solutions

        表1 不同質(zhì)量濃度處理下水稻種子發(fā)芽力Table 1 Germinative ability of rice seeds under different solutions

        3 討論與結(jié)論

        近年來(lái),低場(chǎng)核磁共振技術(shù)作為一種新興的無(wú)損檢測(cè)方法,廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)食品、生命科學(xué)、石油化工等領(lǐng)域。國(guó)內(nèi)一些學(xué)者,利用核磁共振弛豫時(shí)間T2反演波譜,開展食品含水、含油率,果蔬中水分的分布及水分的流動(dòng)性,食品的保鮮和貯藏,速凍食品的品質(zhì),農(nóng)作物種子浸種過(guò)程水分傳遞等方面的研究。周然等[23]為研究可食性涂膜對(duì)冷藏黃花梨的保鮮效果,利用核磁共振成像檢測(cè)不同保鮮膜浸涂的黃花梨儲(chǔ)藏后內(nèi)部品質(zhì),結(jié)果確定通過(guò)涂膜可達(dá)到貯藏保鮮的目的,同時(shí)蟲膠涂膜能更有效地保持黃花梨的品質(zhì)。宋平等[24]基于核磁共振技術(shù)研究不同水稻浸種方法對(duì)水稻種子吸水量的影響,通過(guò)硬脈沖回波序列測(cè)定水稻種子橫向弛豫時(shí)間,分析水稻種子內(nèi)部水分相態(tài)及其變化規(guī)律,揭示水稻種子含水量的影響因素,為水稻浸種過(guò)程中吸水量的測(cè)定提供一種有效的方法。 但目前,基于核磁共振技術(shù)研究離子液對(duì)農(nóng)作物種子吸水性影響未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

        本研究結(jié)果表明,根據(jù)橫向弛豫時(shí)間的不同,將水稻種子樣本內(nèi)部的水分劃分成結(jié)合水和自由水2 種水分相態(tài)。 橫向弛豫時(shí)間在0.1~10ms 的結(jié)合水和橫向弛豫時(shí)間在10~100ms 的自由水,隨著離子液體濃度的增大,反射峰面積逐漸減小,結(jié)合水和自由水的含量減小,并在質(zhì)量濃度大于等于8mg·L-1變化顯著。 對(duì)水稻種子樣本的發(fā)芽能力和水稻幼苗苗長(zhǎng)的檢測(cè),也表明離子液體降低了水稻種子的發(fā)芽率,對(duì)水稻幼苗的生長(zhǎng)起到抑制作用,這與核磁共振檢測(cè)結(jié)果一致,證明核磁共振檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

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