俞超楠

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053）

缺血組織恢復(fù)血液灌注后組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆損傷的現(xiàn)象為缺血再灌注損傷[1]。心肌缺血再灌注損傷往往會(huì)導(dǎo)致心肌梗死面積擴(kuò)大，心功能下降，最終導(dǎo)致心力衰竭[2]。缺血再灌注損傷是一種復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其發(fā)生機(jī)制與氧自由基產(chǎn)生、鈣超載、線粒體損傷、能量代謝異常、炎癥反應(yīng)等相關(guān)[1，3]。研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）介導(dǎo)的相關(guān)途徑HMGB1/Toll 樣受體4（Toll-like receptors 4， TLR4）/核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號(hào)通路參與了心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制[4]。

表兒茶素[（-）-epicatechin]是多種植物、食品及中藥材中的重要活性成分之一，是具有類黃酮結(jié)構(gòu)的兒茶素類化合物，其生理活性包括抗氧化、抗炎、降糖降脂等[5]。有研究[6]報(bào)道，表兒茶素對(duì)缺氧處理后小鼠心肌缺血損傷具有一定的保護(hù)作用。因此，表兒茶素在缺血再灌注損傷中對(duì)心臟的保護(hù)作用引起了人們的關(guān)注[7]，但其作用機(jī)制并未闡述完全。本研究通過(guò)構(gòu)建心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（hepoxia/reoxygenation，H/R）模型模擬動(dòng)物心肌缺血再灌注損傷[8]，探究表兒茶素是否通過(guò)調(diào)控HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路對(duì)H/R 細(xì)胞損傷產(chǎn)生修復(fù)作用，以期為心肌缺血再灌注的治療提供新方向，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1. 1細(xì)胞及培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H9C2 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM 中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1. 2藥物與試劑表兒茶素（美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：E4081），純度≥98%。HMGB1抑制劑（Glycyrrhizin）（美國(guó)Selleck 公司）；DMEM（美國(guó)Hyclone 公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK8）、兔抗HMGB1 抗體、兔抗TLR4 抗體、兔抗 磷 酸 化NF- κB（p-NF- κB）p65 抗 體、 兔 抗NF-κB p65抗體、兔抗GAPDH抗體（武漢Bioswamp公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）；SYBR Green PCR 試劑盒（美國(guó)KAPA Biosystems 公司）；化學(xué)發(fā)光試劑（美國(guó)Millipore公司）。

1. 3主要儀器厭氧發(fā)生裝置（日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)）；倒置顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)ACEA公司）；熒光定量PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能公司）。

1. 4 H/R損傷細(xì)胞模型構(gòu)建收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后分裝于6 孔板中，每孔2 mL，約1 × 106個(gè)細(xì)胞/孔，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。再將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至不含血清的低糖低氧DMEM 中，在含體積分?jǐn)?shù)94%N2、5% CO2和1% O2的培養(yǎng)箱中作用6 h，溫度為37 ℃。后用新鮮完全培養(yǎng)基于常氧狀態(tài)培養(yǎng)6 h。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1. 5細(xì)胞分組與處理收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9C2 細(xì)胞，分布于6 孔板中，約1 × 106個(gè)細(xì)胞/孔。將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、表兒茶素組、HMGB1 抑制劑組等4組。對(duì)照組：正常細(xì)胞；模型組：構(gòu)建H/R 細(xì)胞模型；表兒茶素組：構(gòu)建H/R 細(xì)胞模型，在細(xì)胞造模前30 min 加入終濃度為20 μmol/L 的表兒茶素溶液[磷酸鹽緩沖液（PBS）為溶劑[9]]；HMGB1抑制劑組：構(gòu)建H/R 細(xì)胞模型，于細(xì)胞造模前30 min，加入終濃度為100 μg/mL 的HMGB1 抑制劑Glycyrrhizin[10]。

1. 6 CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖能力收集H9C2 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后分裝于96孔板中，每孔180 μL，約5 × 103個(gè)細(xì)胞/孔，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁。按照上述分組處理細(xì)胞，分別于12、24、48、72 h 時(shí)取出細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。應(yīng)用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔的吸光值。

1. 7 AnnexinV-FITC/碘化丙啶（PI）雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡情況模型構(gòu)建后24 h，H9C2 細(xì)胞經(jīng)消化處理后收集于離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取約5 × 105個(gè)細(xì)胞，以1 000 r/min 離心5 min，棄上清。預(yù)冷PBS 重懸細(xì)胞沉淀，以1 000 r/min 離心5 min，棄上清。加入200 μL Binding buffer 懸浮細(xì)胞，再加入10 μL AnnexinV-FITC 和10 μL PI，混勻后，4 ℃避光孵育30 min。加入300 μL Binding buffer，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，以NovoExpressTM軟件進(jìn)行分析。

1.8實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法檢測(cè)細(xì)胞HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA的表達(dá)收集各組H9C2 細(xì)胞，TRIzol 提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為SYBR Green Mix（10 μL）、上游引物（0.5 μL）、下游引物（0.5 μL）、cDNA 模板（1 μL）、ddH2O（8 μL），共20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，30 min；95 ℃，5 s；56 ℃，10 s；72 ℃，25 s。共39個(gè)循環(huán)。PCR引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，引物序列如下。HMGB1 上游引物為5’-ATCCATTGGTGATGTTGC-3’，下游引物為5’-TCTTTTCATAGGGCTGCT-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度80 bp。TLR4 上游引物為5’-ATCCCTTA TTCAACCA-3’，下游引物為TGTCTCCACAGCCA CC-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度255 bp。NF-κB p65 上游引物為5’- TGTTTCCCCTCATCTTTCC- 3’， 下 游引 物 為5’-GTGGTATCTGTGCTTCTCTCC-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為154 bp。GAPDH 上游引物為5’-CAAGTTCAACGG CACAG-3’，下游引物為5’-CCAGTAGACTCCAC GACAT-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度138 bp。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。

1. 9蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測(cè)細(xì)胞HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白的表達(dá)提取各組細(xì)胞蛋白，定量后以20 μg蛋白上樣量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，并用50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉2 h。將膜放入濕盒中，加入一抗[HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65，稀釋比為1∶1 000；GAPDH，稀釋比為1∶2 000]，室溫孵育1 h。PBST 洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。PBST洗膜，滴加化學(xué)發(fā)光試劑，與膜充分接觸后，置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)，讀取條帶灰度值。

1. 10統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 H/R損傷心肌細(xì)胞模型形態(tài)學(xué)表現(xiàn)圖1 結(jié)果顯示：對(duì)照組H9C2細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，大部分細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則星形，貼壁生長(zhǎng)，排列緊密，而H/R 模型組細(xì)胞間距較大，細(xì)胞變圓，皺縮，近30%的細(xì)胞呈圓形漂浮于培養(yǎng)液上，呈現(xiàn)出明顯的凋亡特征。

圖1 H/R損傷H9C2細(xì)胞形態(tài)（×200）Figure 1 Morphological features of H/R injury H9C2 cells（×200）

2. 2表兒茶素對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞增殖的影響圖2結(jié)果顯示，H/R模型組細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），而與H/R 模型組比較，表兒茶素組、 HMGB1 抑制劑組細(xì)胞增殖能力升高（P＜0.05）。表明表兒茶素、HMGB1抑制劑處理可使H/R細(xì)胞增殖能力得到恢復(fù)。

圖2 表兒茶素對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞增殖的影響Figure 2 Effects of（-）-Epicatechin on the proliferation of H/R injury H9C2 cells

2. 3表兒茶素對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞凋亡的影響圖3結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，H/R模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與H/R 模型組比較，表兒茶素組和HMGB1 抑制劑組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。

圖3 表兒茶素對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effects of（-）-Epicatechin on the apoptosis of H/R injury H9C2 cells

2. 4表兒茶素對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞HMGB1、TLR4及NF-κB p65 mRNA表達(dá)的影響圖4 結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，H/R 模型組細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）；而與H/R 模型組比較，表兒茶素組和HMGB1 抑 制 劑 組HMGB1、 TLR4 及NF- κB p65 mRNA表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。

2. 5表兒茶素對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值的影響圖5結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，H/R模型組細(xì)胞HMGB1、 TLR4 蛋白表達(dá)水平及p- NF- κB p65/NF-κB p65 比值均明顯升高（P＜0.05）；而與H/R 模型組比較，表兒茶素組和HMGB1 抑制劑組HMGB1、 TLR4 蛋白表 達(dá) 水 平 及p-NF- κB p65/NF-κB p65比值均降低（P＜0.05）。

圖4 表兒茶素對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞HMGB1、TLR4及NF-κB p65 mRNA表達(dá)的影響Figure 4 Effects of（-）-Epicatechin on the mRNA expression levels of HMGB1，TLR4 and NF-κB p65 of H/R injury H9C2 cells

圖5 表兒茶素對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值的影響Figure 5 Effects of（-）-Epicatechin on the protein expression levels of HMGB1，TLR4 and ratio of p-NF-κB p65/NF-κB p65 of H/R injury H9C2 cells

3 討論

急性心肌梗死是世界上發(fā)病率及死亡率最高的疾病之一[11]。目前，急性ST 段抬高心肌梗死的臨床標(biāo)準(zhǔn)治療方法是再灌注策略，可改善急性冠脈綜合征[12]。然而，再灌注本身是一把 “雙刃劍”，在改善梗死相關(guān)冠狀動(dòng)脈通暢性的同時(shí)，以時(shí)間依賴的方式積累產(chǎn)生再灌注相關(guān)的病理癥狀[13]。再灌注引起的病理變化，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載，引起細(xì)胞凋亡和壞死，最終導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞死亡。再灌注引起的心律失常和心肌頓抑為可逆的，而微血管阻塞和致死性心肌再灌注損傷為不可逆的[14]。

再灌注損傷涉及到氧自由基產(chǎn)生、炎性介質(zhì)釋放以及細(xì)胞凋亡等一系列病理反應(yīng)。機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的激活，將造成心肌進(jìn)一步的損傷，使心肌細(xì)胞凋亡加劇，心肌梗死面積擴(kuò)大[15]。本研究結(jié)果顯示，H/R損傷心肌細(xì)胞增殖能力減弱，而凋亡率升高，經(jīng)過(guò)表兒茶素或是HMGB1抑制劑提前處理后，細(xì)胞增殖能力得到一定的恢復(fù)，凋亡率降低，表明表兒茶素與HMGB1 對(duì)H/R 損傷心肌細(xì)胞具有相似的修復(fù)作用，可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，抑制凋亡。

HMGB1是一種非組蛋白DNA結(jié)合蛋白，壞死的心肌細(xì)胞在缺血環(huán)境中會(huì)被動(dòng)釋放HMGB1，而HMGB1 不可控制地釋放會(huì)觸發(fā)和誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷，因此，HMGB1 是缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)的早期介質(zhì)[4，16]。TLR4 是HMGB1 的膜受體之一，研究[17]發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注損傷時(shí)，HMGB1/TLR4 軸在心肌細(xì)胞的凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，其作用機(jī)制可能與HMGB1/TLR4 相關(guān)信號(hào)通路中細(xì)胞因子釋放和炎癥反應(yīng)有關(guān)。 HMGB1 與TLR4 結(jié) 合 后， 也 可 通 過(guò) 激 活NF-κB 信號(hào)通路促進(jìn)炎性因子的表達(dá)，加重機(jī)體炎癥反應(yīng)[18]。 本研究中， H/R 損傷心肌細(xì)胞HMGB1 和TLR4 的表達(dá)及NF-κB 磷酸化激活水平均明顯高于對(duì)照組正常細(xì)胞， 而表兒茶素和HMGB1 抑制劑可抑制HMGB1 和TLR4 H/R 損傷心肌細(xì)胞中HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的表達(dá)及NF-κB 磷酸化激活水平。表明表兒茶素與HMGB1抑制劑對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞的修復(fù)作用相似，其機(jī)制可能與抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

通過(guò)調(diào)控機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)相關(guān)通路，提高缺血組織器官對(duì)再灌注損傷的抵抗能力，對(duì)心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生內(nèi)源性的保護(hù)作用，被稱為缺血預(yù)處理。綜上所述，將表兒茶素干預(yù)作為缺血預(yù)處理，通過(guò)調(diào)控HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路可發(fā)揮抑制缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的作用。表兒茶素對(duì)缺血再灌注損傷具有修復(fù)作用，可為臨床上心肌缺血再灌注損傷的治療提供新思路，值得進(jìn)一步研究探討。