節(jié)陽(yáng)華, 楊曉蓓, 陳衛(wèi)東
(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腫瘤放療科,新疆烏魯木齊 830000;2. 新疆烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科,新疆烏魯木齊 830000;3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肛腸科,四川瀘州 646000)
結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,發(fā)病率高達(dá)30/10 萬(wàn)~50/10 萬(wàn),在世界范圍內(nèi)發(fā)病率居第3位[1-2]。新疆屬于高寒地帶,人們的飲食以高熱量、高脂肪食物為主,新鮮蔬菜攝入較少,以致缺乏大量維生素,這成為了結(jié)直腸癌的易感因素。本課題組前期研究[3]表明,白頭翁湯治療結(jié)直腸癌患者的血液差異表達(dá)基因有159 個(gè),其中38 個(gè)基因上調(diào)、121個(gè)基因下調(diào),功能涉及趨化因子的活動(dòng)、細(xì)胞因子活性及腫瘤炎癥微環(huán)境等。炎癥可以促進(jìn)上皮類腫瘤的發(fā)生,炎癥的刺激導(dǎo)致腫瘤釋放許多直接促進(jìn)其自身生長(zhǎng)的炎癥因子及其受體調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從而構(gòu)成了炎癥微環(huán)境,直接影響著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及藥物的治療反應(yīng)[4-7]。本研究通過(guò)建立結(jié)直腸癌炎癥微環(huán)境小鼠模型,觀察白頭翁湯對(duì)小鼠結(jié)直腸癌炎癥微環(huán)境基因陣列、通路及細(xì)胞因子的影響,探討其作用機(jī)制,以期為白頭翁湯治療結(jié)直腸癌提供依據(jù),現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。
1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞SPF 級(jí)雄性6~8 周齡小鼠24 只,體質(zhì)量(20 ± 2)g,購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(新)2016-0003,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):65000700000993。動(dòng)物飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心,室溫22 ~24 ℃,濕度55%,自由取食飲水。人HCT-116 結(jié)直腸癌細(xì)胞株由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。
1. 2藥物及制備白頭翁湯由白頭翁15 g、黃連6 g、黃柏12 g、秦皮12 g 組成。上述中藥材由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院提供,水煎、濃縮成1.0 g/mL濃度藥液備用,制備工藝按照國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑管理規(guī)范實(shí)施[2007]20號(hào)操作,由本院制劑室完成。
1. 3試劑與儀器脂多糖(LPS)(美國(guó)Sigma 公司);白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-23、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;Janus 蛋白酪氨酸激酶(JAK)2 抗體、磷酸化JAK2(p-JAK2)(Tyr1007)抗體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)3抗體、磷酸化STAT3(p-STAT3)(Tyr705)抗體、RT2Profiler PCR Array、 QuantiNava SYBR Green Kit、RT2First Strand Kit(12)(德國(guó)Qiagen 公司);RT 反 轉(zhuǎn) 錄5X All- In- One RT MasterMix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)(美 國(guó)ABM 公司)。酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司);顯微鏡(日本尼康公司);核酸蛋白定量?jī)x(北京凱奧公司);電泳儀、電泳槽(北京市六一儀器廠); 實(shí)時(shí)PCR儀(美國(guó)ABI公司);凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)。
1. 4結(jié)直腸癌炎癥微環(huán)境小鼠模型構(gòu)建采用直腸癌細(xì)胞株接種法建立結(jié)直腸癌模型,再用LPS誘導(dǎo)腫瘤炎癥微環(huán)境[8]。方法:將小鼠固定于工作臺(tái),以體積分?jǐn)?shù)75%的酒精消毒右側(cè)腹背部皮膚,用注射器將0.1 mL 結(jié)直腸癌細(xì)胞(5 × 106個(gè)/mL)懸液緩慢注入小鼠背部右前方皮下,局部形成隆丘后退針,棉簽壓迫針孔以防細(xì)胞滲漏。以LPS 0.5 mg/kg一次性腹腔注射誘導(dǎo)腫瘤炎癥微環(huán)境。
1. 5分組與給藥造模成功后,將小鼠隨機(jī)分為模型組與中藥組,每組各12 只。中藥組小鼠給予白頭翁湯7.5 g·kg-1·d-1灌胃,模型組給予等體積生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥21 d。
1. 6觀察指標(biāo)與方法
1. 6. 1 聚合酶鏈反應(yīng)陣列(PCR Array)檢測(cè)2組結(jié)直腸癌小鼠結(jié)直腸組織的差異基因 取結(jié)直腸組織,提取RNA,用核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA 濃度,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性。然后按照PCR Array試劑盒說(shuō)明書操作。
1. 6. 2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測(cè)2 組結(jié)直腸組織中差異基因Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Cxcr3、Spp1 的表達(dá) 選取與結(jié)直腸癌最緊密的基因Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Cxcr3、Spp1,采用qRTPCR 法進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)用TRIzol 提取結(jié)直腸組織RNA,核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)RNA 濃度,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性。RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃2 min,1次;95 ℃5 s,60 ℃1 min,循環(huán)40 次。Ccr1 的上游引物為5’-CTCATGCAGCATAGGAGGCTT-3’,下游引物為5’-ACATGGCATCACCAAAAATCCA-3’,擴(kuò)增片段142 bp。Cxcl1 的上游引物為5’-AC TGCACCCAAACCGAAGTC-3’,下游引物為5’-T GGGGACACCTTTTAGCATCTT-3’,擴(kuò)增片段114 bp。Cxcl5 的上游引物為5’-GTTCCATCTCGCCAT TCATGC-3’,下游引物為5’-GCGGCTATGACTG AGGAAGG-3’,擴(kuò)增片段103 bp。Cxcr3 的上游引物為5’-CTCTTTGCCCTCCCAGATTTC-3’,下游引物為5’-GGCATAGCAGTAGGCCATGAC-3’,擴(kuò)增片段168 bp。Spp1的上游引物為5’-AGCAAGAAA CTCTTCCAAGCAA-3’,下游引物為5’-GTGAGA TTCGTCAGATTCATCCG- 3’, 擴(kuò) 增 片 段134 bp。GAPDH的上游引物為5’-AGGTCGGTGTGAACGG ATTTG-3’,下游引物為5’-TGTAGACCATGTAGT TGAGGTCA-3’,擴(kuò)增片段123 bp。
1. 6. 3 ELISA 法檢測(cè)血清IL-17、IL-23、TNF-α含量 取血清樣本, 嚴(yán)格按照IL- 17、 IL- 23、TNF-α試劑盒說(shuō)明操作,用酶標(biāo)儀于450 ~630 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)值,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度及對(duì)應(yīng)的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得各細(xì)胞因子的含量。
1. 6. 4 qRT- PCR 法檢測(cè)結(jié)直腸組織JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá) 操作方法同“1.6.2” 項(xiàng)。JAK2 的上游引物為5’-AAAGTGCGTTCGAGCGAA G-3’;下游引物為5’-TTCTGTCAGTGTCTCACTT TCC-3’,擴(kuò)增片段301 bp。STAT3 的上游引物為5’-AGAACCTCCAGGACGACTTTG-3’,下游引物為5’-T CACAATGCTTCTCCGCATCT-3’,擴(kuò)增片段159 bp。
1. 6. 5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)結(jié)直腸組 織JAK2 、 p-JAK2 、 STAT3 、 p-STAT3 蛋 白表達(dá) 取結(jié)直腸樣本加入蛋白裂解液,于冰上用超聲粉碎儀粉碎組織,放置冰上裂解30 min,于4 ℃12 000 r/min 離心10 min,吸取上清液,以二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。加上樣緩沖液,100 ℃加熱煮沸5 min 使蛋白變性。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,經(jīng)50 g/L 脫脂牛奶封閉2 h,一抗4 ℃過(guò)夜孵育,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h,滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色劑,自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)曝光成像。采用Image Lab軟件測(cè)定其灰度值, 計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量, 以GAPDH為內(nèi)參。
1. 7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量數(shù)據(jù)均以均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。數(shù)據(jù)若符合正態(tài)分布,采用單因素方差分析方法;數(shù)據(jù)若不符合正態(tài)分布,先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化,使數(shù)據(jù)正態(tài)化,再按照上述單因素方差分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2. 1 2組結(jié)直腸癌小鼠結(jié)直腸組織差異基因表1結(jié)果顯示:經(jīng)PCR Array 檢測(cè),2 組結(jié)直腸組織共有11 個(gè)炎癥相關(guān)差異基因:Ccl19、Ccl7、Ccr1、Cxcl1、 Cxcl5、 Cxcr3、 Il16、 Il1a、 Il1b、 Spp1、Tnfrsf11b。這些基因均和結(jié)直腸癌的發(fā)生與預(yù)后密切相關(guān)。提示白頭翁湯可能通過(guò)改善以上11 個(gè)基因發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用。
表1 2組結(jié)直腸癌小鼠結(jié)直腸組織差異基因Table 1 Data of differential genes in colorectal tissue from mice with colorectal cancer in the two groups
2. 2 2組結(jié)腸癌小鼠結(jié)直腸組織Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Cxcr3、Spp1 mRNA表達(dá)水平比較鑒定Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Cxcr3、Spp1 以及內(nèi)參基因GAPDH 的PCR 產(chǎn)物大小。圖1 結(jié)果顯示:Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Cxcr3、Spp1 基因的PCR 產(chǎn)物大小符合檢測(cè)基因的片段長(zhǎng)度,且產(chǎn)物條帶單一。說(shuō)明設(shè)計(jì)引物片段大小正確。圖2結(jié)果顯示:與模型組比較,中藥組結(jié)腸癌組織Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Spp1 mRNA 表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05),Cxcr3 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。
2. 3 2組結(jié)直腸癌小鼠血清IL-17、IL-23、TNF-α含量比較圖3結(jié)果顯示:與模型組比較,中藥組小鼠血清IL-17、IL-23、TNF-α含量顯著降低(P<0.01)。表明白頭翁湯可減輕結(jié)直腸癌炎癥反應(yīng)。
2. 4 2組結(jié)直腸癌小鼠結(jié)直腸癌組織JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)水平比較圖4結(jié)果顯示:與模型組比較, 中藥組結(jié)直腸癌小鼠結(jié)直腸組織JAK2、 STAT3 mRNA 表 達(dá) 水平 顯 著 降 低(P<0.05)。表明白頭翁湯可能通過(guò)下調(diào)JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)水平發(fā)揮抗腫瘤的作用。
圖1 PCR產(chǎn)物鑒定電泳圖Figure 1 Electrophoretogram of PCR product identification
圖2 2組結(jié)腸癌小鼠結(jié)直腸組織Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Cxcr3、Spp1 mRNA表達(dá)水平比較Figure 2 Comparison of mRNA expression levels of Ccr1,Cxcl1,Cxcl5,Cxcr3,Spp1 in colorectal tissue from mice with colorectal cancer in the two groups
圖3 2組結(jié)直腸癌小鼠血清IL-17、IL-23、TNF-α含量比較Figure 3 Comparison of contents of IL-17,IL-23,TNF-α in serum from mice with colorectal cancerin the two groups
圖4 2組結(jié)直腸癌小鼠結(jié)直腸癌組織JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)水平比較Figure 4 Comparison of mRNA expression levels of JAK2 and STAT3 in colorectal tissue from mice with colorectal cancer in the two groups
圖5 2組結(jié)直腸癌小鼠結(jié)直腸癌組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平比較Figure 5 Comparison of the protein expression levels of JAK2,p-JAK2,STAT3 and p-STAT3 in colorectal tissue from mice with colorectal cancer in the two groups
2. 5 2組結(jié)直腸癌小鼠結(jié)直腸組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平比較圖5 結(jié)果顯示: 與模型組比較, 中藥組JAK2、 p- JAK2、STAT3 表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),p-STAT3 表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。表明白頭翁湯可通過(guò)下調(diào)p-STAT3 表達(dá)量,抑制JAK2-STAT3通路的激活,進(jìn)而抑制炎癥,干預(yù)結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展。
結(jié)直腸癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤,具有惡性程度高、侵襲力強(qiáng)等特點(diǎn),早期缺乏典型臨床癥狀,一旦確診往往處于疾病中晚期,預(yù)后不佳[9]。結(jié)直腸癌屬中醫(yī) “腸積”“積聚”“癥瘕” 等范疇,多由正氣內(nèi)虛、外感邪毒,亦或情志怫郁、飲食失節(jié)、素有舊疾等因素導(dǎo)致脾胃受損,水谷精微運(yùn)化失司,以致水濕停滯體內(nèi),濕濁內(nèi)生。濕濁下注于大腸,日久化生濁毒。濁毒壅滯腸道,日久化熱積聚成塊。因此,濕毒內(nèi)蘊(yùn)是結(jié)直腸癌的病機(jī)根本。白頭翁湯出自《傷寒論》,由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮組成,具有清熱解毒、涼血止痢的功效?!夺t(yī)方集解》曰,白頭翁湯中 “白頭翁苦寒能入陽(yáng)明血分,而涼血止??;秦皮苦寒性澀,能涼肝益腎而固下焦;黃連涼心清肝,黃柏瀉火補(bǔ)水,能燥濕止痢而厚腸,取寒能勝熱,苦能堅(jiān)腎,澀能斷下也”。腹瀉、膿血便、里急后重、肛門灼熱、身熱、口渴、小便短黃是濕熱內(nèi)蘊(yùn)的常見(jiàn)臨床表現(xiàn),這些均與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本課題組前期研究[3]顯示,炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的過(guò)度表達(dá),約占到顯著性結(jié)直腸癌基因富集的62.5%。亦有研究[10-11]顯示,白頭翁湯具有較好的抗炎、抗腫瘤、抗菌、修復(fù)潰瘍、免疫調(diào)節(jié)等作用。
慢性炎癥的炎性微環(huán)境中,充斥大量的炎性細(xì)胞因子、趨化因子及前列腺素類物質(zhì),這些物質(zhì)可以引起DNA 損壞以及抑癌基因的失活和癌基因的過(guò)表達(dá),最終引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,形成腫瘤。本研究結(jié)果顯示:經(jīng)PCR Array 檢測(cè), 2 組小鼠結(jié)直腸組織共有11 個(gè)炎癥相關(guān)差異基因Ccl19、Ccl7、 Ccr1、 Cxcl1、 Cxcl5、 Cxcr3、 Il16、 Il1a、Il1b、Spp1、Tnfrsf11b。這些基因均與結(jié)直腸癌的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)。提示白頭翁湯可能通過(guò)改善以上11 個(gè)基因發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用。選取與結(jié)直腸癌最緊密的基因Ccr1、 Cxcl1、 Cxcl5l、Cxcr3、Spp1,采用qRT-PCR法進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示,與模型組比較,中藥組結(jié)腸癌組織Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Spp1 mRNA 表達(dá)水平均顯著降低(P <0.05),Cxcr3 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化。提示白頭翁湯可能通過(guò)改善Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Spp1等基因表達(dá)發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用。
隨著腫瘤的發(fā)生以及炎性微環(huán)境的形成,腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的產(chǎn)生和維持均依賴于STAT3活性。JAK2-STAT3通路是介導(dǎo)腫瘤炎癥微環(huán)境的關(guān)鍵信號(hào)通路,其中STAT3 作為慢性炎癥介導(dǎo)腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),可使慢性炎癥導(dǎo)致的腫瘤處于持續(xù)活化狀態(tài)。在慢性炎癥炎性微環(huán)境中,STAT3的激活調(diào)控一系列細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-17、IL-23等)的表達(dá)[12-13],維持著腫瘤炎性微環(huán)境,而腫瘤炎性微環(huán)境中的細(xì)胞因子又可進(jìn)一步誘導(dǎo)STAT3持續(xù)性活化,進(jìn)而形成 “炎癥-腫瘤” 的惡性循環(huán)。IL-23 可以介導(dǎo)STAT3 的磷酸化,激活STAT3,促進(jìn)IL-17 的分泌[14]。IL-23 與其受體結(jié)合,引起JAK2 磷酸化,進(jìn)一步促進(jìn)STAT 的磷酸化,激活JAK-STAT通路。有研究顯示,在致癌物誘導(dǎo)的小鼠皮膚癌模型中,缺乏IL-17受體的動(dòng)物表現(xiàn)出較低的腫瘤發(fā)生率或較小的腫瘤[15]。由于TNF-α 參與慢性炎癥性疾病,因此它是作為一種與炎癥介質(zhì)相關(guān)的細(xì)胞因子參與其中的。TNF-α可以引起DNA損傷,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在很大程度上已與癌癥聯(lián)系起來(lái)[16]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究結(jié)果顯示:與模型組比較,中藥組血清IL-17、IL-23、TNF-α 含量降低,結(jié)直腸癌組織JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)降低,p-STAT3 蛋白表達(dá)降低。提示白頭翁湯可能是通過(guò)抑制IL-17、IL-23、TNF-α 等炎癥因子的分泌釋放,下調(diào)JAK2、STAT3 mRNA 和p-STAT3蛋白的表達(dá),阻斷JAK2-STAT3通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而調(diào)控腫瘤炎癥微環(huán)境中炎性因子的表達(dá)從而發(fā)揮控制結(jié)直腸腫瘤的作用。
綜上所述,白頭翁湯可通過(guò)改變結(jié)直腸癌炎性微環(huán)境而起到抗腫瘤的作用。