陳金良， 張青， 吳亮， 黃世文， 田少華

（1. 赤壁市人民醫(yī)院醫(yī)療聯(lián)合體中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科，湖北赤壁 437300；2. 武漢科技大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)科，湖北武漢 430000）

缺氧缺血性腦?。╤ypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是由于各種圍生期因素引起的新生兒缺氧缺血 性 腦 損 傷（hypoxic- ischemic brain damage，HIBD），可引起不可逆的腦組織損傷，且多伴有嚴(yán)重的遠(yuǎn)期后遺癥如腦癱、癲癇等[1]。研究[2]顯示，在HIBD的同時(shí)常伴隨心臟等重要臟器缺血再灌注損傷，心腦血管疾病常相伴發(fā)生，臨床治療需在減輕腦組織損傷的同時(shí)保護(hù)心肌組織損傷。目前，HIBD 發(fā)生的病理機(jī)制尚不明確，可能與線(xiàn)粒體功能障礙、過(guò)多的氧自由基、細(xì)胞凋亡等有關(guān)，臨床主要采用對(duì)癥治療、支持治療及腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等治療，尚無(wú)特效的治療藥物[3-4]。那么，尋找有效的治療藥物，改善HIBD的心腦組織損傷具有重要的意義。HIBD 急性期可歸屬于中醫(yī)文獻(xiàn)記載的 “胎驚”“胎癇”“胎搐”，以鎮(zhèn)肝熄風(fēng)，清心安神為主。龍膽為龍膽科植物龍膽Gentiana scabra Bge. 及三花龍膽Gentiana triflora Pall. 的根及根莖。味苦，性寒，入肝、膽經(jīng)，瀉肝膽實(shí)火，除下焦?jié)駸?，可治頭痛，目赤，脅痛，小兒驚癇等。龍膽苦苷（gentiopicroside）是從龍膽中提取的有效活性成分，具有利膽、抗炎、健胃、降壓等作用[5]。已有研究[6]顯示，龍膽苦苷可以保護(hù)小鼠缺血缺氧再灌注心肌組織損傷。因此，本研究建立了大鼠HIBD 模型，旨在分析龍膽苦苷治療HIBD 心肌損傷的作用機(jī)制，為臨床治療提供一定的理論依據(jù)，也為新藥的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1. 1動(dòng)物SPF級(jí)7日齡新生SD大鼠60只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（京）2015-0001，飼養(yǎng)于本院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，保持室溫恒定為25 ℃，模擬晝夜，自由攝食與飲水。

1. 2藥物、試劑與儀器龍膽苦苷（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：G21690），純度≥98%，化學(xué)式為C16H20O9，分子量為356.32。戊巴比妥鈉（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）和肌紅蛋白（Mb）檢測(cè)試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ活性檢測(cè)試劑盒（北京綠源伯德生物科技有限公司）；兔抗人c-Myc、腺苷酸活化蛋白激酶α1（AMPKα1）和Nrf2、Bcl-2、Bax 和cleaved Caspase-3單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（上海信裕生物科技有限公司）。XBS-02-3D 小鼠缺氧（高低氧）裝置（杭州艾普儀器設(shè)備有限公司）；Sequoia512型心臟彩色多普勒超聲（德國(guó)西門(mén)子公司）；UV-240紫外分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）。

1. 3造模、分組與干預(yù)將60 只新生SD 大鼠隨機(jī)選取50 只采用結(jié)扎頸總動(dòng)脈結(jié)合低氧環(huán)境建立HIBD模型[7]。操作方法：給予大鼠腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉溶液2 mL/kg進(jìn)行麻醉，分離并結(jié)扎左頸總動(dòng)脈，恢復(fù)2 h 后再置于體積分?jǐn)?shù)8%氧氣的低氧環(huán)境中2 h，之后放回母鼠身邊繼續(xù)喂養(yǎng)7 d。其余10 只大鼠設(shè)為假手術(shù)組，僅分離左頸總動(dòng)脈，不進(jìn)行結(jié)扎。50只造模大鼠死亡6只，隨機(jī)選取4 只造模大鼠斷頭取腦組織，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，若HE 染色出現(xiàn)明顯病變，則表明造模成功。將40 只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和龍膽苦苷低、中、高劑量組，每組各10 只。造模后6 h，給予龍膽苦苷低、中、高劑量組大鼠灌胃龍膽苦苷（劑量[8]分別為30、60、120 mg·kg-1·d-1），模型組和假手術(shù)組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃7 d。

1. 4觀察指標(biāo)與方法

1. 4. 1 大鼠心功能及心肌損傷檢測(cè) 治療后，采用心臟彩色多普勒超聲檢查心率（HR）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（FS）以及左心室壁厚度（LVWT）的檢測(cè)。檢測(cè)心功能后，迅速斷頭取血，離心（3 500 r/min，10 min），分離血清，置于-20 ℃冰箱暫存，取大鼠左心室組織置于-80 ℃冰箱暫存。采用ELISA 法檢測(cè)心肌損傷標(biāo)記物CK-MB、cTnI 和Mb 水平，氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA和LDH水平。

1. 4. 2 HE 染色法觀察大鼠腦組織病理表現(xiàn) 無(wú)菌取大鼠腦海馬組織，用40 g/L多聚甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋，切片（4 μm），HE染色，光鏡下觀察大鼠的海馬組織損傷情況。

1. 4. 3 HE 染色法觀察心肌病理?yè)p傷情況 取各組大鼠左心室冠狀面中部的環(huán)狀心肌組織，用40 g/L多聚甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)的脫水、透明、浸蠟和包埋，切片（4 μm）。進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察大鼠的心肌組織損傷情況。

1. 4. 4 采用分光光度法檢測(cè)心肌線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ活性 取各組大鼠左心室組織，提取心肌組織細(xì)胞線(xiàn)粒體，采用比色法測(cè)定線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ活性。

1. 4. 5 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測(cè)心肌組織Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3、c-Myc、AMPKα1和Nrf2 的表達(dá) 取各組大鼠左心室組織，勻漿，用細(xì)胞裂解液嚴(yán)格按照蛋白裂解步驟提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法進(jìn)行蛋白定量。取50 μg總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫封閉2 h。加入洗膜緩沖液洗膜，加Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3、c-Myc、AMPKα1 和Nrf2 等一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜緩沖液洗膜，加HRP 標(biāo)記的二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育2 h。電化學(xué)發(fā)光（ECL）法顯示圖像，選用β-actin 作為內(nèi)參，凝膠成像分析系統(tǒng)分析條帶強(qiáng)弱。

1. 5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x ± s）表示，對(duì)計(jì)量資料首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，各組均滿(mǎn)足正態(tài)性且2組間方差齊，采用單因素方差分析比較多組間差異性，若組間比較有差異，采用SNK-q進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1各組大鼠腦組織病理表現(xiàn)比較圖1 結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠海馬組織排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯異常。模型組可見(jiàn)明顯的細(xì)胞腫脹，大量細(xì)胞出現(xiàn)核固縮呈三角形。龍膽苦苷中、高劑量組大鼠海馬組織病理變化較模型組明顯減輕，細(xì)胞形態(tài)趨于正常，僅見(jiàn)少量核固縮細(xì)胞；龍膽苦苷低劑量組大鼠海馬組織與模型組比較，無(wú)明顯改善。

圖1 各組大鼠腦組織病理表現(xiàn)比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of the pathological features of rat brain tissues in various groups（by HE staining，×400）

2. 2各組大鼠心功能比較表1 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠HR、LVEF、FS和LVWT均明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷低、中、高劑量組大鼠HR、LVEF、FS 和LVWT均明顯下降，且隨著劑量升高，其作用逐漸增強(qiáng)，其中龍膽苦苷中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2. 3各組大鼠心肌損傷程度比較圖2 結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠心肌組織排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯異常。模型組大鼠心肌組織細(xì)胞間隙變寬、排列松散，肌纖維橫截面積明顯縮小。龍膽苦苷中、高劑量組大鼠心肌組織細(xì)胞排列較整齊，肌纖維橫截面積明顯大于模型組；龍膽苦苷低劑量組大鼠心肌組織與模型組比較，無(wú)明顯改善。

表2結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠CK-MB、cTnI 和Mb 均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷低、中、高劑量組大鼠CK-MB、cTnI和Mb均明顯下降，且隨著劑量升高，其作用逐漸增強(qiáng)，其中龍膽苦苷中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心功能比較Table 1 Comparison of rat cardiac functions in various groups （x ± s）

圖2 各組大鼠心肌組織病理表現(xiàn)比較（HE染色，×200）Figure 2 Comparison of pathological manifestations of rat myocardial tissues in various groups（by HE staining，×200）

表2 各組大鼠心肌損傷標(biāo)記物水平比較Table 2 Comparison of rat myocardial injury markers in various groups （x ± s）

2. 4各組大鼠氧化應(yīng)激水平比較表3 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠SOD 活性明顯下降（P＜0.05），MDA 和LDH 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷低、中、高劑量組大鼠SOD 活性均明顯升高，MDA 和LDH 水平明顯下降，且隨著劑量升高，其作用逐漸增強(qiáng)，其中龍膽苦苷中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激水平比較Table 3 Comparison of rat oxidative stress levels in various groups （x ± s）

2. 5各組大鼠線(xiàn)粒體功能比較表4 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ和線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅱ活性明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷低、中、高劑量組大鼠線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ和線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅱ活性均明顯升高，且隨著劑量升高，其作用逐漸增強(qiáng)，其中龍膽苦苷中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2. 6各組大鼠線(xiàn)粒體損傷標(biāo)記分子水平比較圖3結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Bcl-2/Bax比值顯著下調(diào)（P＜0.05），cleaved Caspase-3和c-Myc的表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷低、中、高劑量組大鼠Bcl-2/Bax 比值明顯上調(diào)，cleaved Caspase-3和c-Myc 的表達(dá)量明顯下調(diào)，且隨著劑量升高，其作用逐漸增強(qiáng)，其中龍膽苦苷中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠線(xiàn)粒體損傷標(biāo)記分子水平比較（x ± s）Figure 3 Comparison of the levels of rat mitochondrial injury marker molecules in various groups（x ± s）

2. 7各組大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激標(biāo)記蛋白AMPKα1、Nrf2表達(dá)量比較圖4 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠AMPKα1 和Nrf2 的表達(dá)量明顯下調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷低、中、高劑量組大鼠AMPKα1 和Nrf2 的表達(dá)量明顯上調(diào)，且隨著劑量升高，其作用逐漸增強(qiáng)，其中龍膽苦苷中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激標(biāo)記蛋白AMPKα1、Nrf2表達(dá)量比較（x ± s）Figure 4 Comparison of the expression contents of rat mitochondrial oxidative stress marker proteins AMPKα1，Nrf2 in various groups（x ± s）

3 討論

缺氧缺血性腦損傷（HIBD）是圍生期新生兒常見(jiàn)的一種疾病，可以引起多組織臟器功能障礙。CK-MB、cTnI和Mb是臨床常用的反映心肌組織損傷的標(biāo)志物，HR、LVEF、FS和LVWT是反映心功能的指標(biāo)[9]。本研究結(jié)果顯示，HIBD 模型大鼠的腦組織和心肌組織出現(xiàn)明顯病變，CK-MB、cTnI和Mb 水平明顯升高，HR、LVEF、FS 和LVWT 水平均明顯下降，提示HIBD模型大鼠出現(xiàn)明顯腦組織損傷，心肌組織損傷和功能障礙。已有研究[10]顯示，HIBD 發(fā)生的同時(shí)常伴隨著心臟組織的缺血再灌注損傷，與本研究結(jié)果基本一致，提示HIBD可以引起心肌組織損傷。但現(xiàn)有研究多集中在HIBD所引起的腦組織損傷，對(duì)于HIBD引起的心肌組織損傷及治療研究報(bào)道較少，因此，本研究建立了新生大鼠的HIBD 模型來(lái)探討龍膽苦苷對(duì)HIBD 大鼠心肌組織損傷的影響。結(jié)果顯示，HIBD 模型大鼠經(jīng)龍膽苦苷治療后，腦組織和心肌組織病變明顯減輕， CK- MB、 cTnI 和Mb 水平明顯降低，HR、LVEF、FS和LVWT水平均明顯升高，且隨著龍膽苦苷劑量的增加，其作用逐漸增強(qiáng)，提示龍膽苦苷可以呈濃度依賴(lài)性地緩解腦組織和心肌組織損傷，改善心功能。

臨床研究[11]顯示，HIBD 發(fā)生的機(jī)制與機(jī)體氧化應(yīng)激增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡、線(xiàn)粒體功能障礙等均有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，龍膽苦苷治療可以降低HIBD 模型大鼠的MDA 和LDH 水平，升高SOD 活性，提示龍膽苦苷治療可能通過(guò)降低HIBD模型大鼠的氧化應(yīng)激水平，清除機(jī)體過(guò)多的氧自由基，修復(fù)HIBD模型大鼠心肌組織損傷。線(xiàn)粒體是真核細(xì)胞內(nèi)參與機(jī)體能量代謝的重要細(xì)胞器，也是細(xì)胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生的主要來(lái)源，在細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等多種生理病理過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用[12]。本研究結(jié)果顯示，龍膽苦苷治療后，HIBD 模型大鼠心肌線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ和線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅱ的活性明顯升高。線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ和線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅱ參與組成線(xiàn)粒體上的呼吸鏈復(fù)合物，參與調(diào)節(jié)氧自由基的生成[13]。多項(xiàng)研究[14-15]顯示，缺血缺氧條件下，機(jī)體產(chǎn)生的過(guò)多的氧自由基可以破壞線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)，引起線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能障礙，誘導(dǎo)心肌組織細(xì)胞凋亡，加重心肌組織損傷。故提示龍膽苦苷可能通過(guò)降低HIBD模型大鼠的氧化應(yīng)激水平，保護(hù)線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能。c-Myc是機(jī)體的一種參與調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖、代謝和凋亡[16]。研究[17]顯示，c-Myc 可能通過(guò)激活Bax，引起線(xiàn)粒體膜結(jié)構(gòu)的改變，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C 的釋放，激活凋亡執(zhí)行分子Caspase，降解細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)龍膽苦苷治療后，HIBD 模型大鼠心肌組織Bcl-2/Bax 的比值明顯上調(diào)，cleaved Caspase-3 和c-Myc 的表達(dá)量明顯下調(diào)，提示龍膽苦苷可能通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)，保護(hù)HIBD大鼠心肌線(xiàn)粒體膜結(jié)構(gòu)和功能，抑制氧自由基的生成。

AMPK 是AMP 依賴(lài)的蛋白激酶，也是骨骼肌細(xì)胞的能量感受器，與線(xiàn)粒體的功能密切相關(guān)，是機(jī)體能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。Nrf2是堿性亮氨酸拉鏈家族中活力最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，是機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)作用最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子[18]。臨床研究[19-20]顯示，AMPK/Nrf2信號(hào)通路在降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少內(nèi)皮損傷、抑制線(xiàn)粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。Li等[21]的研究顯示，龍膽苦苷可以激活LKB1/AMPK 信號(hào)通路，發(fā)揮其保肝作用。本研究結(jié)果顯示，龍膽苦苷可以上調(diào)HIBD模型大鼠心肌AMPKα1 和Nrf2 的表達(dá)，提示龍膽苦苷可能通過(guò)激活A(yù)MPK/Nrf2 信號(hào)通路，發(fā)揮其抗氧化作用，修復(fù)HIBD模型大鼠心肌組織損傷和保護(hù)線(xiàn)粒體功能。

綜上所述， 龍膽苦苷可能通過(guò)激活心肌AMPK/Nrf2信號(hào)通路，發(fā)揮其抗氧化的作用，并具有修復(fù)HIBD大鼠的心肌組織損傷和保護(hù)心肌線(xiàn)粒體的功能，為臨床治療提供了一定的理論依據(jù)。但本研究尚處于基礎(chǔ)研究階段，尚需臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。