胡嘉祺 齊 芪 蔣湘寧 蓋 穎

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京 100083； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 北京 100193)

木質(zhì)素是陸生植物細(xì)胞壁中含量僅次于纖維素的天然大分子聚合物,在植物的生長過程中有著十分重要的意義,為植物向上生長提供支撐力(Voelkeretal.,2011)；并且在植物抵御生物侵害中起到了天然屏障作用(Vanceetal.,1980)。雖然木質(zhì)素的存在對(duì)于植物十分重要,但它會(huì)降低傳統(tǒng)造紙的出漿率和紙張質(zhì)量,并且降低牲畜對(duì)草料的消化和吸收,所以長期以來木質(zhì)素一直被當(dāng)做廢料排放到自然環(huán)境中(Baucher,2003)。但近些年發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素在工業(yè)生產(chǎn)中有著重要作用,如,作為粘合劑中酚類的替代物(Fangetal.,2011),作為塑料中的新型偶聯(lián)劑(Justoetal.,2013)。由于在不同行業(yè)中對(duì)木質(zhì)素有著不同的需求,所以對(duì)工業(yè)原料中木質(zhì)素含量的調(diào)控有著重要意義。

木質(zhì)素是一類由肉桂醇、松柏醇和芥子醇氧化聚合成的大分子物質(zhì),在木質(zhì)素的生物合成和氧化聚合過程中共有11個(gè)酶參與,這些酶被分成木質(zhì)素生物合成途徑中參與縱向反應(yīng)的酶PAL(苯丙氨酸裂解酶phenylalanine ammonia-lyase)、C4H(肉桂酸4-羥化酶cinnamate 4-hydroxylase)、4CL(4-香豆酸輔酶A連接酶4-coumarate:coenzyme A ligase)、CCR(香豆酰輔酶A還原酶 coumaryl:coenzyme A reductase)和CAD(肉桂醇脫氫酶cinnamyl alcohol dehydrogenase)，參與橫向反應(yīng)即木質(zhì)素單體之間轉(zhuǎn)化的酶C3H(對(duì)香豆酸-3-羥基化酶p-coumarate-3-hydroxylase)、F5H(阿魏酸5-羥化酶 ferulate 5-hydroxylase)、CSE(咖啡酰莽草酸酯酶caffeoyl shikimate esterase)、COMT(咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶caffeic acid-O-methyltransferase)和CCoAOMT(咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase)，以及木質(zhì)素單體氧化聚合的酶POD(過氧化物酶peroxidase)和LAC(漆酶laccase)。調(diào)控縱向反應(yīng)的酶主要引起木質(zhì)素總量的改變,通過下調(diào)4CL酶活性使得擬南芥(Arabidopsisthaliana)中G型木質(zhì)素單體含量顯著降低(Leeetal.,1997),通過抑制4CL基因表達(dá)獲得的轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotianatabacum)、毛白楊(Populustomentosa)和柳枝稷(Panicumvirgatum)的木質(zhì)素都明顯減少(Kajitaetal.，1997；Voelkeretal.，2010；Xuetal.,2011；Tianetal.,2013)。在白樺雜交種(Betulaplatyphylla×B.pendula)中過表達(dá)CCR基因木質(zhì)素含量增加了14.6%,而抑制CCR表達(dá)后木質(zhì)素含量降低了6.3%(Zhangetal.,2015)。而調(diào)控橫向反應(yīng)的酶會(huì)影響木質(zhì)素總含量和單體組成,在分別下調(diào)C3H和F5H的擬南芥中,F5H的表達(dá)量的改變只引起木質(zhì)素各個(gè)單體比例的改變而并沒有影響木質(zhì)素總量,而C3H表達(dá)量的變化不僅減少了木質(zhì)素總量也改變了3種木質(zhì)素單體所占比例(Reddyetal.,2005)。

在以往的轉(zhuǎn)基因研究中多是調(diào)控木質(zhì)素合成途徑中的單個(gè)基因(Wengetal.,2010；Prashantetal.,2011；Tamasloukhtetal.,2011),尚未見將木質(zhì)素合成過程中兩步酶促反應(yīng)的酶融合為一個(gè)復(fù)合體來調(diào)控木質(zhì)素代謝的報(bào)道。由于在植物體內(nèi)4CL和CCR的催化是一個(gè)連續(xù)反應(yīng)的過程,所以作者所在課題組將毛白楊(Populustomentosa)的4CL1和CCR基因的編碼區(qū)連接在一起,構(gòu)建了融合基因4CL1-CCR并在體外對(duì)其編碼的融合蛋白4CL1-CCR進(jìn)行酶活性分析，發(fā)現(xiàn)它具有4CL1和CCR 2個(gè)酶的催化活性(侯佳音,2014),并且此融合蛋白在大腸桿菌(Escherichiacoli)內(nèi)可以高效催化4-香豆酸、咖啡酸和阿魏酸生成相應(yīng)的醛類,與雙轉(zhuǎn)4CL1+CCR的大腸桿菌比較,轉(zhuǎn)融合基因的菌株有更高的催化效率,增加了對(duì)底物酚酸的利用率(Liuetal.,2015)。在前期研究的基礎(chǔ)上,本研究將毛白楊融合基因4CL1-CCR轉(zhuǎn)到煙草中,分析了轉(zhuǎn)基因煙草木質(zhì)素含量和沉積狀態(tài)的變化,期望在轉(zhuǎn)基因植株中驗(yàn)證融合蛋白的功能并為今后融合基因的應(yīng)用提供分子研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

重組原核表達(dá)載體pQE31-4CL1-CCR和無菌煙草組培苗均為實(shí)驗(yàn)室保存,融合基因?yàn)槊讞?CL1(GenBank 登錄號(hào)：AY043495.1)和CCR(GenBank 登錄號(hào)：EU760388.1),將4CL1的終止密碼子和CCR的起始密碼子去除后,在2個(gè)基因中間添加一段DNA序列作為linker，這段DNA序列編碼的是3個(gè)以4個(gè)色氨酸和1個(gè)苯丙氨酸為重復(fù)單位的多肽,這個(gè)多肽保證了融合酶的2個(gè)蛋白在空間上的獨(dú)立性從而保證了2個(gè)酶的活性。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草的轉(zhuǎn)化及分子鑒定 利用PCR技術(shù)在融合基因4CL1-CCR兩端引入酶切位點(diǎn),再用酶切連接將其構(gòu)建到植物表達(dá)載體pBI121上,并將重組載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101中,通過葉盤法獲得轉(zhuǎn)基因煙草。剪取2片通過抗性篩選(篩選培養(yǎng)基為MS+50 mg·L-1Kan)的煙草無菌苗葉片,用CTAB法提取基因組用于PCR鑒定。將PCR初篩的陽性的轉(zhuǎn)基因煙草用Southern 雜交進(jìn)一步鑒定。

1.2.2 煙草的木質(zhì)素單體含量測定 將1月齡的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草組培苗移栽至花盆中,截取移栽的3月齡轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草第5至第13莖節(jié),經(jīng)過液氮研磨后稱取100 mg粉末,參照Tian等(2013)測定木質(zhì)素時(shí)的前處理方法獲得細(xì)胞壁組分,將細(xì)胞壁組分按Qi等(2019)方法對(duì)細(xì)胞壁木質(zhì)素進(jìn)行衍生化,反應(yīng)完成后,取1 μL反應(yīng)液進(jìn)行GC/MS(Thermo Finnigan)(色譜柱：DB 5 MS 30 m×0.25 mm 0.25 μm Agilent USA)分析。每個(gè)樣品重復(fù)3次,取平均值。

1.2.3 煙草的解剖結(jié)構(gòu)觀察 取移栽的3月齡轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草(非溫室培養(yǎng)土培苗),將莖剪成5 cm長的段,用刀片將其切成薄且透明性好的完整切片放置于載玻片上,用鹽酸-間苯三酚染色法對(duì)切片進(jìn)行染色并在Nikon E200光學(xué)顯微鏡下觀察,并通過Image Pro Plus軟件處理照片,計(jì)算所有木質(zhì)部細(xì)胞細(xì)胞壁厚度、木質(zhì)部寬度和導(dǎo)管周長。

另取未經(jīng)間苯三酚染色的煙草經(jīng)切片后平鋪于載玻片上,蓋好蓋玻片,在低倍物鏡下找到煙草木質(zhì)部,換高倍鏡并切換到紫外燈下激發(fā)木質(zhì)素使其自發(fā)熒光并進(jìn)行觀察拍照。

1.2.4 煙草莖的木質(zhì)素合成基因半定量PCR 分別提取經(jīng)PCR-Southern 雜交鑒定過的轉(zhuǎn)基因煙草的總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以煙草的管家基因(Actin)為內(nèi)參基因分別設(shè)計(jì)正向引物Actin-sense和反向引物Actin-antisense,以縱向反應(yīng)基因(4CL1-CCR,CAD)和橫向反應(yīng)基因(C3H,COMT和F5H)為目的片段設(shè)計(jì)特異性引物,具體見表1。以內(nèi)參基因調(diào)整PCR循環(huán)數(shù)和各煙草模板添加量,對(duì)各轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行半定量PCR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉盤法獲得煙草轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定

分別提取經(jīng)抗性篩選的轉(zhuǎn)基因煙草植株總DNA,以35S啟動(dòng)子部分序列+4CL1基因部分序列為模板設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,陽性對(duì)照與部分篩選植株均擴(kuò)增出了約1 100 bp的特異條帶,將PCR產(chǎn)物用于Southern 雜交檢測(雜交探針序列為35S啟動(dòng)子)。由圖1可以看出經(jīng)抗性篩選的煙草轉(zhuǎn)基因株系具有明顯的雜交信號(hào),而野生型煙草中無信號(hào),此結(jié)果可以證明引入的外源基因已經(jīng)整合到煙草基因組中。經(jīng)鑒定共獲得5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。

圖1 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR-Southern 雜交鑒定Fig.1 Identification of transgenic tobacco plants by Southern Blotting+:陽性對(duì)照;1:WT;2,3,4,5,6:PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)正義株系4CL1-CCR 2、4CL1-CCR 5-2、4CL1-CCR 10-1、4CL1-CCR 16-1、4CL1-CCR 20-2。+:Positive control;1:WT;2,3,4,5,6:Positive plants identified by PCR,4CL1-CCR 2,4CL1-CCR 5-2,4CL1-CCR 10-1,4CL1-CCR 16-1 and 4CL1-CCR 20-2,respectively.

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草木質(zhì)素單體含量分析

采用優(yōu)化后的硫代硫酸解法斷裂木質(zhì)素的鏈接鍵后結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀來測定轉(zhuǎn)基因煙草的木質(zhì)素單體含量,該方法具有減少試驗(yàn)操作時(shí)間、減少待測樣品需求量、可重復(fù)性好和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),因?yàn)樵诹虼蛩峤膺^程中破壞掉的是木質(zhì)素單體中的β—O—4鏈接鍵,該鏈接鍵占木質(zhì)素鏈接鍵的65%～75%,所以該方法常用來裂解分析木質(zhì)素單體組成(Qietal.,2019)。該方法中加入二十四烷作為內(nèi)標(biāo)可在定性的同時(shí)做到對(duì)待測物的定量分析(圖2)。過表達(dá)異源4CL1-CCR融合基因,不僅可以影響煙草細(xì)胞壁中木質(zhì)素的含量,也可以改變木質(zhì)素單體的組成(表2)。與野生型對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因煙草不同株系中,G+S型木質(zhì)素含量均升高,從野生型的16.59%升高到23.62%(4CL1-CCR 5-2)。在所有轉(zhuǎn)基因株系中G型木質(zhì)素單體均有增加,其中4CL1-CCR 5-2增幅為34.64%；而同時(shí)S型木質(zhì)素的含量在不同株系中變化并不一致,在株系4CL1-CCR 5-2和4CL1-CCR 2中S型木質(zhì)素單體有一定升高,但在其他轉(zhuǎn)基因株系中無顯著變化。雖然在不同株系中G型木質(zhì)素和S型木質(zhì)素含量變化不一致,但在所有轉(zhuǎn)4CL1-CCR的煙草中G∶S都有所升高(表2)。另一方面,在所有煙草株系(WT和4CL1-CCR)中都未檢測到H型木質(zhì)素單體。

圖2 轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞壁木質(zhì)素單體氣相色譜峰Fig.2 Characteristic peaks of monolignols in transgenic tobacco cell wall analyzed by gas chromatographIS:內(nèi)標(biāo);G:G型木質(zhì)素單體;S:S型木質(zhì)素單體。IS:Internal standard;G:G-unit monolignol;S:S-unit monolignol.

表2 轉(zhuǎn)基因煙草中木質(zhì)素單體的組成①Tab.2 Lignin monolignols composition of control and transgenic tobacco

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草莖的解剖分析

經(jīng)GC-MS測定木質(zhì)素可知,株系4CL1-CCR 5-2中木質(zhì)素含量增加最多,株系4CL1-CCR 20-2木質(zhì)素含量增加最少,分別對(duì)這2個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系和野生型煙草的莖橫截面進(jìn)行顯微觀察。在靠近煙草植株基底部3 cm處截取莖段用間苯三酚染色觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因煙草的木質(zhì)部寬度明顯大于野生型對(duì)照組(圖3A、B、C),且轉(zhuǎn)基因煙草的導(dǎo)管內(nèi)徑增大。這一結(jié)果與Tian等(2013)和Chen等(2019)分別在毛白楊和煙草中轉(zhuǎn)入單個(gè)4CL基因引起的植物木質(zhì)部變化一致。

木質(zhì)素在紫外線照射下可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光且熒光的亮度與木質(zhì)素局部密度呈正相關(guān)。為更好地揭示轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞壁中木質(zhì)素變化的空間信息,用紫外顯微鏡對(duì)WT和4CL1-CCR株系的成熟莖橫截面進(jìn)行觀測。結(jié)果顯示,在野生型煙草與轉(zhuǎn)基因煙草中木質(zhì)素沉積密度的分布均為細(xì)胞角隅(圖3D、E、F中紅色箭頭所示)和復(fù)合胞間層密度高，而次生細(xì)胞壁中木質(zhì)素沉積密度低。由結(jié)果可知融合基因4CL1-CCR并未改變木質(zhì)素沉積的狀態(tài),即高密度區(qū)依然在細(xì)胞角隅和復(fù)合胞間層,低密度區(qū)依然在次生壁。

用Image Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)木纖維細(xì)胞壁厚度、導(dǎo)管壁周長及木質(zhì)部寬度(圖3A、B、C中綠線所示)。與野生型煙草相比,轉(zhuǎn)融合基因4CL1-CCR的煙草木纖維細(xì)胞壁顯著增厚,其中4CL1-CCR 5-2株系增加17.2%,4CL1-CCR 20-2株系增加7.11%(圖3G)；導(dǎo)管顯著加粗,其中4CL1-CCR 5-2株系導(dǎo)管周長增加100.2%,4CL1-CCR 20-2株系增加43.66%(圖3H)；木質(zhì)部寬度增加,其中4CL1-CCR 5-2株系增加86.4%,4CL1-CCR 20-2株系增加44.6%(圖3I)。

圖3 轉(zhuǎn)基因煙草莖橫截面解剖結(jié)構(gòu)Fig.3 The transverse anatomical structure of stem of transgenic tobaccoA,D:WT;B,E:4CL1-CCR 20-2;C,F:4CL1-CCR 5-2.A,B,C:間苯三酚染色圖(綠線:木質(zhì)部寬度)；D,E,F:木質(zhì)素自發(fā)熒光圖(紅色箭頭為細(xì)胞角隅，白色箭頭為復(fù)合胞間層)；G,H,I:轉(zhuǎn)基因煙草莖結(jié)構(gòu)元件測量。*表示平均值差異顯著(P <0.05),用ANOVA法做差異分析，用Dunnett做事后檢驗(yàn);下同。A,B,C:Phloroglucinol stain(Green line:Xylem width);D,E,F:Lignin autofluorescence(Red arrow:Cell corner;White arrow:Compound middle lamella);G,H,I:Measurements of some elements of stem.Significantly different values at P<0.05 are represented by asterisk(*),and determined by ANOVA followed by Dunnett’s post-hoc test;the same below.

2.4 木質(zhì)素生物合成相關(guān)基因的半定量PCR分析

通過對(duì)木質(zhì)素單體合成途徑中的4個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行半定量PCR分析后發(fā)現(xiàn),調(diào)控4CL1-CCR基因的表達(dá)將會(huì)對(duì)下游基因產(chǎn)生協(xié)同調(diào)控作用(圖4)。位于CCR下游的CAD和位于4CL1下游的C3H和COMT的表達(dá)量都有不同程度的升高,但是F5H變化不顯著。C3H和COMT都參與了木質(zhì)素單體從H型向G型的轉(zhuǎn)化過程,因?yàn)檫@2個(gè)基因的表達(dá)量升高所以在轉(zhuǎn)基因煙草中G型木質(zhì)素含量增加。在G型木質(zhì)素單體向S型木質(zhì)素單體轉(zhuǎn)化過程中最關(guān)鍵的酶是F5H,但在轉(zhuǎn)基因煙草中F5H基因表達(dá)量沒有顯著變化,所以與WT相比轉(zhuǎn)基因煙草的S型木質(zhì)素含量變化并不顯著。

圖4 煙草木質(zhì)素合成基因半定量PCRFig.4 The semi-quantitative PCR of lignin biosynthesis genes in tobacco 1:4CL1-CCR 2;2:4CL1-CCR 5-2;3:4CL1-CCR10-1;4:4C1L-CCR 16-1;5:4CL1-CCR 20-2.F5H:阿魏酸5-羥化酶;COMT:咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶;C3H:香豆酸-3-羥化酶；CAD:肉桂醇脫氫酶;4CL1-CCR:融合基因。F5H:Ferulate 5-hydroxylase;COMT:Caffeic acid O-methyltransferase;C3H:Coumarate-3-hydroxylase;CAD:Cinnamyl alcohol dehydrogenase;4CL1-CCR:Fusion gene.

3 討論

本研究將2個(gè)功能上有聯(lián)系的基因融合后在煙草細(xì)胞內(nèi)表達(dá),發(fā)現(xiàn)引入此融合基因4CL1-CCR使得煙草細(xì)胞壁中木質(zhì)素總量增加了36.44%；由于4CL1和CCR均為木質(zhì)素合成中參與縱向反應(yīng)的酶,木質(zhì)素的增加表現(xiàn)為G型木質(zhì)素單體增加,而S型單體變化不顯著。

對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)一步做半定量分析發(fā)現(xiàn),在上調(diào)4CL1-CCR基因表達(dá)后增加了CAD的表達(dá),CAD參與了木質(zhì)素單體合成的最后一步酶促反應(yīng)。在被子植物中CAD對(duì)酚醛的催化被認(rèn)為沒有底物特異性(Chaoetal.,2014),但在煙草中可以檢測到G型和S型木質(zhì)素單體,但是并未檢測到H型木質(zhì)素單體,推測煙草的CAD蛋白對(duì)對(duì)羥基肉桂醛的催化活性可能很低。對(duì)于參與橫向反應(yīng)的基因影響表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因煙草中C3H和COMT表達(dá)量升高,其中C3H和COMT是H型木質(zhì)素單體轉(zhuǎn)向G型木質(zhì)素單體必須的2個(gè)酶,因此,在縱向反應(yīng)蛋白4CL1和CCR含量增加后,這2個(gè)酶催化產(chǎn)生的產(chǎn)物不能被進(jìn)一步催化生成羥基肉桂醇,而是由C3H和COMT更多地轉(zhuǎn)化成為G型的前體物質(zhì),最終表現(xiàn)為G型木質(zhì)素單體含量顯著增加。4CL1可以催化肉桂酸、阿魏酸和咖啡酸生成相應(yīng)的CoA酯,但不能催化芥子酸(侯佳音,2014),所以S型木質(zhì)素單體的生物合成需要經(jīng)COMT和F5H催化G型木質(zhì)素的前體物質(zhì)才可以生成,在這一過程中最重要的F5H的表達(dá)量沒有改變,所以S型木質(zhì)素單體含量與野生對(duì)照植株相比無顯著差異。

由煙草莖的鹽酸-間苯三酚染色結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草木質(zhì)素均沉積在木質(zhì)部。雖然融合基因4CL1-CCR是在非組織特異性的強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV35S(花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子)下啟動(dòng)表達(dá),但是木質(zhì)素單體合成過程中其他基因具有組織特異性(MacMillanetal.,2017),只在木質(zhì)部細(xì)胞中可以形成完整的木質(zhì)素生物合成途徑,因此融合基因并沒有改變木質(zhì)素出現(xiàn)的組織特異性。但是融合基因的表達(dá)使轉(zhuǎn)基因煙草木質(zhì)化的細(xì)胞增加最終表現(xiàn)為木質(zhì)部寬度增加,木質(zhì)部中導(dǎo)管壁周長增加,木纖維細(xì)胞壁厚度明顯增加(圖3)。這種調(diào)控木質(zhì)素單體合成的基因影響植物導(dǎo)管形態(tài)及木質(zhì)部厚度在多種轉(zhuǎn)基因植物中均有報(bào)道,下調(diào)雜交楊樹(Populustremula×P.alba)CCR基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)其木質(zhì)部中導(dǎo)管明顯塌陷(Lepleetal.,2007)；上調(diào)CCR的白樺雜交種中導(dǎo)管數(shù)量增加,并且呈現(xiàn)出異常的導(dǎo)管成串現(xiàn)象,從而增加導(dǎo)管占木質(zhì)部的面積比例(Zhangetal.,2015)；下調(diào)CCR表達(dá)的番茄(Solanumlycopersicum)莖中被染色的木質(zhì)部細(xì)胞層數(shù)少于野生型(Van der Restetal.,2006)；在抑制4CL基因表達(dá)的新西蘭輻射松(Pinusradiata)莖的橫切面中,木質(zhì)化細(xì)胞的面積顯著低于野生型(Wagneretal.,2009)；過表達(dá)4CL基因的煙草(Chenetal.,2019)和毛白楊(Tianetal.,2013)中也觀察到了木質(zhì)部細(xì)胞數(shù)量增多。

由熒光顯微觀測可知,轉(zhuǎn)融合基因4CL1-CCR的煙草和野生型煙草中具有相同的木質(zhì)素密度分布,即在細(xì)胞角隅和復(fù)合胞間層中木質(zhì)素密度高,而在次生細(xì)胞壁中木質(zhì)素密度低。但與野生型煙草對(duì)比,轉(zhuǎn)基因煙草中木質(zhì)素高密度區(qū)域的面積有所增加，在次生壁中木質(zhì)素沉積的面積增加。這種基因影響木質(zhì)素沉積的現(xiàn)象與已報(bào)道的研究結(jié)論一致。在下調(diào)CAD基因表達(dá)的毛果楊(Populustrichocarpa)中,高密度木質(zhì)素區(qū)域(細(xì)胞角隅和復(fù)合胞間層)和低密度木質(zhì)素區(qū)域(次生細(xì)胞壁)的面積都減少,但是并沒有出現(xiàn)木質(zhì)素密度分布紊亂現(xiàn)象(Segmehletal.,2019)。推測控制木質(zhì)素密度分布可能與細(xì)胞木質(zhì)化進(jìn)程有關(guān),細(xì)胞木質(zhì)化過程首先在細(xì)胞角隅和復(fù)合胞間層中出現(xiàn)木質(zhì)素然后再沉積在次生細(xì)胞壁中。并且在細(xì)胞木質(zhì)化的前期主要積累的是G型木質(zhì)素單體,G型木質(zhì)素單體可以形成更多的鏈接鍵,所以此時(shí)的木質(zhì)素網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密呈現(xiàn)出高密度,當(dāng)次生壁加厚時(shí)S型木質(zhì)素單體逐漸增加而形成的網(wǎng)狀木質(zhì)素結(jié)構(gòu)相對(duì)松散所以呈現(xiàn)出低密度狀態(tài)(Terashimaetal.,1988)。在本研究中融合基因使煙草細(xì)胞壁中G型木質(zhì)素單體含量增加,所以增加了轉(zhuǎn)基因煙草的木質(zhì)素高密度區(qū)面積,但并不能改變木質(zhì)素單體在細(xì)胞壁區(qū)域內(nèi)沉積的順序,所以并未改變木質(zhì)素密度的分布狀態(tài)。

4 結(jié)論

由毛白楊4CL1和CCR基因構(gòu)建的融合基因4CL1-CCR不僅增加了轉(zhuǎn)基因煙草莖中木纖維細(xì)胞壁的厚度,同時(shí)也使得煙草莖木質(zhì)部寬度增加、木質(zhì)化細(xì)胞數(shù)量增加,最終表現(xiàn)為木質(zhì)素含量增加。但是由于這2個(gè)基因編碼的酶均參與木質(zhì)素生物合成中縱向反應(yīng),其自身的表達(dá)量升高只增加了木質(zhì)素單體反應(yīng)中縱向反應(yīng)量,通過半定量PCR分析,發(fā)現(xiàn)橫向反應(yīng)的關(guān)鍵基因F5H并未受到外源基因的影響,所以木質(zhì)素單體組成中只有G型單體的含量增加。融合基因4CL1-CCR在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)并未改變木質(zhì)素沉積的狀態(tài),即細(xì)胞角隅和復(fù)合胞間層為高密度木質(zhì)素區(qū)域,而次生細(xì)胞壁為低密度木質(zhì)素沉積區(qū)域,但是轉(zhuǎn)基因煙草中高密度的復(fù)合胞間層面積略有增加。