程振宇，申屠華松，陳亦華，何忠平，俞北偉，王瑞權(quán)，傅斌

（1.金華市人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 金華 321000；2.金華市食品藥品檢驗檢測研究所，浙江 金華 321000；3.金華市人民醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)檢驗科，浙江 金華 321000；4.金華市人民醫(yī)院 病理科，浙江 金華 321000）

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）主要由腦動脈瘤破裂引起，預(yù)后較差[1]。除腦血管痙攣和遲發(fā)性腦缺血外，早期腦損傷是導(dǎo)致SAH不良預(yù)后的重要原因[2]。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是SAH后早期腦損傷的重要機(jī)制之一。SAH后加劇的神經(jīng)細(xì)胞凋亡可造成患者運動和認(rèn)知功能障礙，影響患者預(yù)后[3]。線粒體途徑是SAH后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的三條重要途徑之一[4]。Omi/HtrA2是一種線粒體絲氨酸蛋白酶。細(xì)胞受到刺激后，Omi/HtrA2分子被釋放到細(xì)胞質(zhì)，通過增強含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）活性參與線粒體凋亡途徑發(fā)揮致凋亡作用[5]。UCF-101是Omi/HtrA2特異性抑制劑，可明顯減少外傷性脊髓損傷、膿毒癥性腦病或腦缺血大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，顯著改善神經(jīng)功能[6-9]。本研究使用UCF-101腹腔注射對SAH大鼠進(jìn)行治療，旨在評價其對SAH大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用及對神經(jīng)功能的改善作用，為SAH藥物治療的研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料 健康Wistar大鼠（上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司），雄性，清潔級，體質(zhì)量250～300 g； UCF-101（規(guī)格：5 mg/支，德國Calbiochem公司）；ApoAlert細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（規(guī)格：100T/盒， 美國Biosciences Clontech公司）；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白定量試劑盒（美國Thermo Scientific公司）；脫色搖床（型號：TY-80B，常州澳華儀器有限公司）；轉(zhuǎn)印槽（型號：Trans-Blot，美國Biorad公司）；電泳儀（型號：DYCP-31C，北京六一生物科技有限公司）；小型垂直電泳槽（型號：164-8001，美國Biorad公司）；生物倒置顯微鏡[型號：IX-71，奧林巴斯（中國）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模：按照隨機(jī)數(shù)字表法將90只大鼠分成Sham組、SAH組和UCF-101組，每組30只。SAH組和UCF-101組大鼠按照50 mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉針麻醉后，采用ROUX等[10]建立的枕大池二次注血法制作SAH大鼠模型，Sham組大鼠2次均注入等量0.9%氯化鈉注射液。在手術(shù)操作前0.5 h， UCF-101組大鼠按照3.0 μmol/kg劑量給予腹腔注射UCF-101，Sham組和SAH組大鼠均按照10 mL/kg劑量腹腔注射0.9%氯化鈉注射液。在24 h后，取每組各10只大鼠，處死后取少量腦組織用于神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測和Western blot檢測，每組剩余10只大鼠用于神經(jīng)功能檢測。實驗過程中，大鼠死亡后補充成活大鼠，保證每亞組10只大鼠。

1.2.2 Western blot檢測：大鼠腦組織經(jīng)細(xì)胞裂解、離心及BCA法蛋白濃度測定后，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，采用5%脫脂奶粉Tris生理鹽水和吐溫20緩沖液在室溫下封閉蛋白，加入兔抗大鼠procaspase-3（1:2 000，英國Abcam公司）、procaspase-9（1:1 000，美國CST公司）、剪切聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）（1:2 000，英國Abcam公司）、caspase-3（1:2 000，英國Abcam公司）、caspase-9（1:1 000，美國CST公司）和GAPDH（1:1 000，美國CST公司）單克隆抗體孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1:2 000，英國Abcam公司）室溫?fù)u床孵育，洗膜，化學(xué)發(fā)光試劑作用，X光膠片曝光、沖洗并掃描。采用Quality one軟件分析雜交條帶灰度值，以GAPDH水平為內(nèi)對照，比較相對灰度值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測：將大鼠腦組織進(jìn)行4%多聚甲醛固定24 h后，脫水、透明、浸蠟進(jìn)行包埋，作成4 μm厚度切片，60 ℃烤片3 h，切片脫蠟至水；取ApoAlert TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒內(nèi)適量試劑 1（TdT）和試劑2（dUTP）按1:9混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37 ℃恒溫箱孵育2 h，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。切片用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）洗滌3次，每次5 min；去除磷酸鹽緩沖液后在圈內(nèi)滴加4，6-二脒基-2-苯基吲哚染液，避光室溫孵育10 min。玻片置于磷酸鹽緩沖液 （pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min， 最后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像，計算凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例。

1.2.4 認(rèn)知功能測試：參照VORHEES等[11]的方法對大鼠進(jìn)行Morris水迷宮定位航行實驗，在術(shù)后第1天到第3天每天3次對大鼠進(jìn)行訓(xùn)練，在術(shù)后第4天測定大鼠逃避潛伏期。如果大鼠在規(guī)定時間120 s 內(nèi)找到平臺，記錄這個時間作為逃避潛伏期，若在120 s內(nèi)找不到平臺，將其引導(dǎo)至平臺，讓其在平臺上站立10 s，這時逃避潛伏期記為120 s。

1.2.5 神經(jīng)行為學(xué)測試：在術(shù)后第24小時，采用KAOUTZANIS等[12]的方法對大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測定，內(nèi)容包括運動反應(yīng)、睜眼反應(yīng)和進(jìn)食3部分，分值依次為5、4和2分，總分3～11分，11分正常，3分最差。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，3組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCF-101對SAH大鼠Kaoutzanis M神經(jīng)行為學(xué)評分的影響 SAH組大鼠Kaoutzanis M神經(jīng)行為學(xué)評分較Sham組顯著下降（P＜0.01），而UCF-101組大鼠Kaoutzanis M神經(jīng)行為學(xué)評分較SAH組顯著升高（P＜0.05），見圖1。

2.2 UCF-101對SAH大鼠逃避潛伏期的影響 SAH組大鼠逃避潛伏期較Sham組顯著升高（P＜0.01），而UCF-101組大鼠逃避潛伏期較SAH組顯著下降（P＜0.01），見圖2。

2.3 UCF-101對SAH大鼠顳底皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 SAH組大鼠顳底皮層procaspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)較Sham組顯著升高（均P＜0.01），而UCF-101組大鼠顳底皮層pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)較SAH組顯著下降（均P＜0.05），見圖3。

圖1 UCF-101對SAH大鼠Kaoutzanis M神經(jīng)行為學(xué)評分的影響（每組n=10）

2.4 UCF-101對SAH大鼠顳底皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 SAH組大鼠顳底皮層凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例較Sham組顯著升高（P＜0.01），而UCF-101組大鼠顳底皮層凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例較SAH組顯著下降（P＜0.01），見圖4-5。

圖2 UCF-101對SAH大鼠逃避潛伏期的影響（每組n=10）

3 討論

細(xì)胞凋亡是一種程序化的細(xì)胞死亡方式，它的一個顯著特征就是細(xì)胞染色質(zhì)的DNA降解。Caspase 與真核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡按照起始 caspase的不同，可將哺乳細(xì)胞的凋亡分為線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路、死亡受體通路3種途徑[13]。線粒體通路是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase從而激活下游信號通道誘發(fā)細(xì)胞凋亡。caspase-3和caspase-9是參與細(xì)胞凋亡線粒體通路的重要信號蛋白。細(xì)胞凋亡發(fā)生時，pro-caspase-3和pro-caspase-9生成增多，同時轉(zhuǎn)化為caspase-3和caspase-9。PARP是DNA修復(fù)酶，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。PARP是caspase的切割底物。當(dāng)caspase-3和caspase-9被激活時，PARP被切割成為剪切PARP，從而失去對DNA的修復(fù)功能[4]。因此，如同本研究所示，在SAH大鼠腦組織中，神經(jīng)細(xì)胞凋亡加劇的同時會伴有腦組織pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)水平的升高。當(dāng)然，神經(jīng)細(xì)胞凋亡的加劇勢必造成神經(jīng)功能的破壞，這個現(xiàn)象在既往研究[14-15]和本研究中也得到了論證。因此，判定SAH大鼠腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞及pro-caspase-3、procaspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9等細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)可評價大鼠腦組織的損傷情況，從而反映大鼠神經(jīng)功能的損傷程度。

HtrA是細(xì)菌體內(nèi)一種蛋白質(zhì)分子，屬于絲氨酸蛋白酶家族，其含義最初是指這種蛋白質(zhì)在細(xì)菌的耐熱特性中發(fā)揮重要作用，即當(dāng)環(huán)境溫度正常時作為分子伴侶存在，環(huán)境溫度升高時則作為蛋白酶，參與降解細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)。隨著研究的深入，人們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其作用在于使折疊錯誤的蛋白質(zhì)分子重新折疊或發(fā)生降解。在哺乳動物體內(nèi)，目前觀察到的HtrA同源物有人類Omi/HtrA2[5]。Omi/HtrA2是細(xì)胞凋亡線粒體途徑中重要的信號蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，然后由基質(zhì)導(dǎo)入順序/線粒體定位信號引導(dǎo)轉(zhuǎn)運進(jìn)入線粒體，在線粒體內(nèi)被線粒體加工肽酶降解形成成熟的Omi/HtrA2，并儲存在線粒體膜間隙中。在病理情況下，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時線粒體膜通透性增加，Omi/HtrA2從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，與X染色體連鎖凋亡抑制蛋白結(jié)合，解除了它對caspase-9的抑制，導(dǎo)致下游caspase-3活化，而PARP被剪切失去活性，DNA斷裂得不到修復(fù)，促成了細(xì)胞凋亡的加劇，進(jìn)而引起了疾病的發(fā)生和發(fā)展[5]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，Omi/HtrA2可以促進(jìn)腦損傷大鼠皮層pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)量升高，破壞血腦屏障，從而加重腦水腫；這些證據(jù)說明，Omi/HtrA2可能通過促發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡而參與了膿毒癥性腦病大鼠、癲癇持續(xù)狀態(tài)幼鼠和腦缺血/再灌注損傷大鼠腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程[6-9，16-18]。

圖3 UCF-101對SAH大鼠顳底皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

UCF-101是Omi/HtrA2特異性抑制劑，通過抑制Omi/HtrA2活性從而減少對X染色體連鎖凋亡抑制蛋白的降解，進(jìn)而增強對caspase-9抑制作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的下降；UCF-101對心肌梗死、膿毒癥和急性腎損傷等疾病已經(jīng)發(fā)揮了較好的保護(hù)作用[19]。在動物實驗階段，UCF-101多采用腹腔注射的方式來抑制各種疾病的細(xì)胞凋亡[6-9]。而UCF-101所使用的劑量變化較大。LIU等[20]發(fā)現(xiàn)，UCF-101劑量在 0.6～1.8 μmol/kg范圍內(nèi)對心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，而1.5 μmol/kg劑量對心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用效果最佳。在膿毒血癥腦病大鼠的研究中，UCF-101腹腔注射所使用的劑量是 10 μmol/kg[8]。而在兩個腦缺血大鼠的研究中，UCF-101腹腔注射所使用的劑量是1.5 μmol/kg[6-7]。本研究為了提高對UCF-101對SAH大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用，在腦缺血研究[6-7]的基礎(chǔ)上增加UCF-101腹腔注射的劑量到3 μmol/kg。本研究數(shù)據(jù)顯示，SAH組大鼠腦組織pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)量、凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例和逃避潛伏期較Sham組大鼠顯著升高，而SAH組大鼠Kaoutzanis M神經(jīng)行為學(xué)評分較Sham組大鼠顯著降低；而UCF-101腹腔注射均不同程度地逆轉(zhuǎn)了上述指標(biāo)的變化。在腦缺血大鼠中，UCF-101腹腔注射可以顯著抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而改善大鼠神經(jīng)功能[6-7]。在膿毒血癥腦病大鼠中，UCF-101腹腔注射可以明顯抑制caspase-3和 caspase-9活性及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而改善大鼠的認(rèn)知功能[8]。本研究檢測了多種細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，同時評價了SAH大鼠運動行為功能和認(rèn)知功能，研究數(shù)據(jù)支持按照3 μmol/kg劑量腹腔注射UCF-101也可顯著抑制SAH大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而改善大鼠神經(jīng)功能。由于腦組織諸多細(xì)胞可以發(fā)生凋亡，而本研究沒有采用NeuN共標(biāo)染色凋亡細(xì)胞，可能導(dǎo)致所顯示的凋亡細(xì)胞不全是神經(jīng)元細(xì)胞。但在腦組織內(nèi)，神經(jīng)元細(xì)胞還是占有較大比例，因此，本研究顯示的UCF-101對神經(jīng)元的保護(hù)作用應(yīng)該存在。當(dāng)然，采用NeuN共標(biāo)染色凋亡細(xì)胞對本研究的結(jié)論的嚴(yán)謹(jǐn)性具有較大的提升作用。綜上所述，UCF-101對SAH大鼠神經(jīng)功能具有顯著保護(hù)作用，而UCF-101可能是SAH藥物治療研究的新方向。

圖4 UCF-101對SAH大鼠顳底皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡影響的代表性TUNEL熒光染色圖（×200）

圖5 UCF-101對SAH大鼠顳底皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響（n=10）