張智勇，裘豐

（寧波醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院東部院區(qū) 胃腸外科，浙江 寧波 315040）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球發(fā)病率、病死率均較高的惡性腫瘤[1]。表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）是上皮腫瘤中最重要的原癌基因之一，72%～89%的CRC組織中存在EGFR的高表達(dá)[2]。西妥昔單抗（Cetuximab）通過(guò)與EGFR內(nèi)源性配體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻斷下游酪氨酸激酶的激活，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用，是晚期CRC的一線治療藥物，但患者均易發(fā)生西妥昔單抗繼發(fā)性耐藥，找到發(fā)生耐藥的機(jī)制對(duì) 于臨床治療方案具有重要的指導(dǎo)意義。抑癌基因PTEN的丟失是導(dǎo)致CRC對(duì)西妥昔單抗耐藥的重要因素[3]，但其丟失的機(jī)制仍有待揭示。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）作為機(jī)體內(nèi)廣泛表達(dá)的表觀調(diào)控因子，參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]。本研究通過(guò)生物信息分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）Linc00658 可能通過(guò)micro RNA-19a-3p（miR-19a-3p）調(diào)控PTEN的表達(dá)，進(jìn)而影響CRC細(xì)胞西妥昔單抗的敏感性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人腎上皮細(xì)胞293T、人CRC細(xì)胞CaCo2（美國(guó)ATCC）。

1.1.2 試劑：Cetuximab（美國(guó)Selleck公司），DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基及FBS（美國(guó)Gibco公司），DMSO、雙抗及CCK-8試劑（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），miRNA Control及miR-19a-3p mimic（上海漢恒生物公司），Linc00658過(guò)表達(dá)載體及Vector對(duì)照載體（上海吉?jiǎng)P基因公司），Lipofectamine 2000（美國(guó)Thermo Fisher公司），PTEN、磷酸化AKT（p-AKT）及磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），TRIzoL及SuperScript IV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），SYBR Green（美國(guó)MedChemExpress公司），Passive Lysis Buffer、Luciferase Assay Reaget、pGL3-basic Vector（美國(guó)Promega公司）。

1.1.3 儀器：iMark酶標(biāo)儀、ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司），7500熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)以PTEN為靶基因的miRNA及其潛在結(jié)合的LncRNA：使用Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)及miRNA Cancer Association數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合預(yù)測(cè)與PTEN相互結(jié)合的miRNA，并采用LncBase v.2數(shù)據(jù)庫(kù)分析與靶miRNA相互作用的LncRNA。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及西妥昔單抗耐藥的誘導(dǎo)[6]：采用RPMI-1640培養(yǎng)基+10% FBS培養(yǎng)CaCo2細(xì)胞，培養(yǎng)環(huán)境：37 ℃、5% CO2、飽和濕度。接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CaCo2細(xì)胞至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，傳代培養(yǎng)至4皿，隨機(jī)平均分為對(duì)照組及抵抗組。抵抗組采用4、8、16、32、64、128及256 nmol/L濃度梯度西妥昔單抗持續(xù)處理CaCo2細(xì)胞，每組濃度處理7 d，待細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)再使用更高濃度處理，直至細(xì)胞在 256 nmol/L西妥昔單抗中生長(zhǎng)狀態(tài)良好；對(duì)照組采用等量的DMSO處理。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：接種1孔對(duì)照組及2孔抵抗組細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，以7.5 μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2000與2 μg Linc00658過(guò)表達(dá)載體混合于無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入其中1孔抵抗組細(xì)胞中作為過(guò)表達(dá)組，另將15 μL脂質(zhì)體與4 μg 對(duì)照載體混合于無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，平均分為2份分別加入對(duì)照組及另1孔抵抗組細(xì)胞中。 6 h后PBS洗細(xì)胞3次后RPMI-1640+10% FBS繼續(xù)培養(yǎng)24 h。同樣利用Lipofectamine 2000在CaCo2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-19a-3p mimic及mimic NC作為本研究的mimic組及NC組。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞西妥昔單抗的半數(shù)抑制濃度（IC50）：接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)照組、抵抗組、過(guò)表達(dá)組細(xì)胞、mimic組及NC組細(xì)胞于96孔板中，接種濃度為1×103/孔，每組細(xì)胞設(shè)置8個(gè)濃度梯度×5個(gè)重復(fù)樣本，12 h后更換含4、8、16、32、64、128、256及512 nmol/L西妥昔單抗的RPMI-1640+10% FBS處理48 h，10 μL CCK-8試劑加入待測(cè)樣本中，避光培養(yǎng)4 h，檢測(cè)450 nm吸光值，Graphpad Prism 8.0軟件繪制擬合曲線并估計(jì)每組細(xì)胞IC50值。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)Linc00658、miR-19a-3p及PTEN mRNA表達(dá)：接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞于6孔板中，1 mL TRIzoL提取細(xì)胞總RNA，1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，其中miR-19a-3p RT-引物為特異性引物，序列為：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTG AGTCAGTTTT-3’，得到cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，引物如下：Linc00658上游（F）：5’-CGAGCAGCTCC ATCTACAGA-3’，下游（R）：5’-GCTGGGTGGTTCAAACTCA G-3’；miR-19a-3p上游（F）：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTG CAAATCTATGCAA-3’，下游（R）為通用引物；PTEN上游（F）：5’-GGACGAACTGGTGTAATGATATG-3’，下游（R）： 5’-TCTACTGTTTTTGTGAAGTACAGC-3’；GAPDH上游（F）： 5’-TCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游（R）：5’-GTTGACTCC GACCTTCAC-3’。每組設(shè)置3個(gè)平行孔，GAPDH作為內(nèi) 參，2（-△△CT）法計(jì)算各組細(xì)胞Linc00658、miR-19a-3p及PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 Western blot檢測(cè)PTEN、p-AKT及p-mTOR蛋白表達(dá)：接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞于6孔板中，收集各組細(xì)胞總蛋白，以30 μg行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，轉(zhuǎn)至PVDF膜1.5 h，10%脫脂牛奶室溫孵育2 h，一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜，PBS洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育條帶1.5 h，PBS洗膜3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光液孵育條帶，化學(xué)發(fā)

光成像系統(tǒng)對(duì)條帶印跡進(jìn)行曝光顯影并拍照。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)Linc00658與miR-19a-3p的結(jié)合：將Linc00658構(gòu)建至pGL3-basic載體上（長(zhǎng)沙優(yōu)寶生物公司），DMEM+10% FBS培養(yǎng)293T細(xì)胞，接種至6孔板中并分為Negative control（NC）組及mimic組，NC組共轉(zhuǎn)染pGL3-basic-Linc00658及miRNA control，mimic組共轉(zhuǎn)染pGL3-basic-Linc00658及miR-19a-3p mimic，48 h后收集細(xì)胞懸液，預(yù)冷PBS洗細(xì)胞3次，100 μL PBL裂解液室溫孵育30 min，2組細(xì)胞各取10 μL上樣至96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)平行孔，加入100 μL預(yù)混Luciferase Assay Reagent II檢測(cè)熒光強(qiáng)度為RLU1，加入100 μL 預(yù)混Stop & Glo Reagent檢測(cè)熒光強(qiáng)度為RLU2，以RLU1/RLU2作為各組相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)Linc00658對(duì)miR-19a-3p介導(dǎo)的PTEN抑制的影響：將PTEN 3’UTR區(qū)構(gòu)建至pGL3-basic載體上，接種293T細(xì)胞至6孔板中并分為PTEN+NC+Vector（PNV）組、PTEN+mimic+ Vector（PMiV）組及PTEN+mimic+Linco0658（PMi58）組，PNV組轉(zhuǎn)染pGL3-basic-PTEN、miRNA control及Vector；PMiV組轉(zhuǎn)染pGL3-basic-PTEN、miR-19a-3pmimic及Vector；PMi58組轉(zhuǎn)染pGL3-basic-PTEN、miR-19a-3p mimic及Linc00658過(guò)表達(dá)載體，方法同前。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用Graphpad Prism 8.0軟件。正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)Linc00658可部分逆轉(zhuǎn)CaCo2細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的耐藥 與對(duì)照組比，抵抗組及過(guò)表達(dá)組在4～512 nmol/L西妥昔單抗處理時(shí)，細(xì)胞存活率顯著增高（P＜0.01），通過(guò)曲線擬合法計(jì)算IC50，抵抗組及過(guò)表達(dá)組西妥昔單抗IC50均顯著增高（P＜0.01）；而相比抵抗組，過(guò)表達(dá)組在32～512 nmol/L 西妥昔單抗處理時(shí)，細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01），通過(guò)曲線擬合法計(jì)算IC50，過(guò)表達(dá)組西妥昔單抗IC50顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 3組細(xì)胞在不同濃度西妥昔單抗下的細(xì)胞存活率

2.2 miR-19a-3p mimic可促進(jìn)CaCo2細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的抵抗 與NC組比，mimic組在8～512 nmol/L 西妥昔單抗處理時(shí)，細(xì)胞存活率顯著增高（P＜0.01），通過(guò)曲線擬合法計(jì)算IC50，mimic組西妥昔單抗IC50顯著增高（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

2.3 過(guò)表達(dá)Linc00658可抑制miR-19a-3p并上調(diào)PTEN mRNA的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，抵抗組Linc00658及PTEN mRNA表達(dá)顯著降低，miR-19a-3p表達(dá)顯著增高（P＜0.01）；相比抵抗組，過(guò)表達(dá)組Linc00658及PTEN mRNA表達(dá)顯著增高，miR-19a-3p表達(dá)顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖2 NC及mimic組細(xì)胞在不同濃度西妥昔單抗下的細(xì)胞存活率

圖3 各組細(xì)胞Linc00658、miR-19a-3p及PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.4 過(guò)表達(dá)Linc00658可上調(diào)PTEN并抑制p-AKT及p-mTOR的蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，抵抗組PTEN表達(dá)顯著降低，p-AKT及p-mTOR蛋白表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；相比抵抗組，過(guò)表達(dá)組PTEN表達(dá)顯著增高，p-AKT及p-mTOR蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 各組細(xì)胞PTEN、p-AKT及p-mTOR的Western blot結(jié)果

2.5 miR-19a-3p可抑制Linc00658熒光素酶活性 LncBase數(shù)據(jù)庫(kù)分析與miR-19a-3p具有潛在結(jié)合的LncRNA，結(jié)果顯示miR-19a-3p與Linc00658轉(zhuǎn)錄本48～65位點(diǎn)以8mer的形式結(jié)合（見(jiàn)圖5A），同時(shí)，相比NC組，mimic組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5B。

2.6 Linc00658對(duì)PTEN熒光素酶活性的影響 TargetScan及miRcancer數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合分析與PTEN相互作用miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-19a-3p與PTEN 3’UTR區(qū)411-417位點(diǎn)以7mer-m8的形式結(jié)合（見(jiàn)圖6A），相比PNV組，PMiV組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01）；相比PMiV組，PMi58組熒光素酶活性顯著增高（P＜0.01），見(jiàn)圖6B。

3 討論

ncRNA作為分布廣泛的表觀遺傳調(diào)控因子，參與機(jī)體絕大多數(shù)生物學(xué)過(guò)程。西妥昔單抗耐藥的發(fā)生同樣存在ncRNA的異常表達(dá)及調(diào)控，LU等[7]及THOMAS等[8]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA miR100HG可協(xié)同miR-100和miR-125b介導(dǎo)Wnt/β-catenin通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)CRC及頭頸鱗癌細(xì)胞西妥昔單抗耐藥；JING 等[9]及PENG等[10]發(fā)現(xiàn)LncRNA Linc00973可通過(guò)調(diào)控糖代謝促進(jìn)西妥昔單抗耐藥細(xì)胞株的惡性表型。另外，miR-204、miR-143、miR-145及miR-146a等均被發(fā)現(xiàn)通過(guò)不同途徑參與影響腫瘤細(xì)胞西妥昔單抗耐 藥[11-13]。

miR-19a-3p作為PTEN的上游負(fù)性調(diào)控因子，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用，包括骨肉瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌及乳腺癌等[14-17]，其中，LI等[15]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA SLC25A5-AS1可作為miR-19a-3p的內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），抑制其介導(dǎo)的PTEN丟失及胃癌細(xì)胞的惡性表型；miR-19a-3p在結(jié)直腸癌中同樣也被發(fā)現(xiàn)可通過(guò)抑制FOXF2 mRNA水平，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、遷移和增殖能力[18]?？紤]到PTEN的丟失是腫瘤細(xì)胞西妥昔單抗耐藥的重要原因之一[19-20]， 同時(shí)，基于LncRNA與西妥昔單抗耐藥的廣泛聯(lián)系，本研究首先通過(guò)生物信息技術(shù)在CRC細(xì)胞中預(yù)測(cè)到與miR-19a-3p潛在結(jié)合的LncRNA Linc00658，并觀察到Linc00658及miR-19a-3p在西妥昔單抗抵抗的CRC細(xì)胞株中異常表達(dá)，提示兩者可能存在相互作用并參與調(diào)控PTEN進(jìn)而影響CRC細(xì)胞西妥昔單抗抵抗的形成。故我們?cè)诘挚辜?xì)胞中外源性過(guò)表達(dá)Linc00658，發(fā)現(xiàn)miR-19a-3p表達(dá)顯著降低，而PTEN mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增高，其靶分子AKT及mTOR顯著激活，同時(shí)抵抗細(xì)胞西妥昔單抗敏感性增高，表明Linc00658可能作為miR-19a-3p的ceRNA發(fā)揮表觀調(diào)控作用，間接影響PTEN的表達(dá)，進(jìn)而影響CRC細(xì)胞西妥昔單抗敏感性。進(jìn)一步我們通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證了Linc00658與miR-19a-3p存在顯著結(jié)合，表明Linc00658同SLC25A5-AS1一樣[15]，可作為miR-19a-3p的ceRNA發(fā)揮調(diào)控PTEN的作用。綜上，Linc00658通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-19a-3p，促進(jìn)CRC細(xì)胞PTEN的表達(dá)及西妥昔單抗的敏感性。我們將進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建突變體及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)上述推論，為相關(guān)藥物靶點(diǎn)及標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

圖5 miR-19a-3p對(duì)Linc00658熒光素酶活性的影響

圖6 Linc00658對(duì)PTEN熒光素酶活性的影響