陳琴，陳黎黎，周愛明，黃旭才，潘景業(yè)

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325015；2.樂清市第三人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325604）

膿毒血癥是一種由病原微生物干擾引起的宿主抗感染免疫失調(diào)導(dǎo)致的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征，病死率高[1]。研究表明，血管內(nèi)皮細胞的炎癥損傷是膿毒癥引起多器官功能障礙的關(guān)鍵因素[2]。姬松茸多糖（agaricus blazei polysaccharide，ABP）是從優(yōu)質(zhì)姬松茸實體內(nèi)提取的有效生物活性成分，已有研究表明其具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等多種功能[4-6]。本研究以脂多糖（lipopoly saccharides，LPS）作為誘導(dǎo)劑，構(gòu)建人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）損傷模型，觀察ABP對LPS誘導(dǎo)的HUVECs損傷的保護作用，探討其可能的作用機制。

圖1 CCK-8法檢測各濃度ABP對HUVECs細胞活性的影響

圖2 各組HUVECs中TNF-α和IL-6的表達變化

1 材料和方法

1.1 材料 HUVECs購于中國科學(xué)院生命科學(xué)研究院細胞庫；ABP購于麗水方格藥業(yè)公司；LPS購自美國Sigma公司；COX-2、iNOS、ICAM-1，VCAM-1和GAPDH 購于美國Abcam公司；p65、p-p65、IκB、p-IκB購于美國Cell Signaling Technology公司；Cell Counting KIT-8細胞活性檢測試劑盒購于日本Dojindo公司；DMEM/F-16細胞培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶購于美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組：HUVECs用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙重抗生素的DMEM/F-16培養(yǎng)基傳代，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中。細胞分組：Control組、LPS組、LPS+ABP組。Control組為單純HUVECs培養(yǎng)，LPS組為單純HUVECs培養(yǎng)基礎(chǔ)上，加入終濃度為1 μg/mL LPS液。LPS+ABP組為LPS組基礎(chǔ)上，24 h后分別加入終濃度為10、20、50 μg/mL ABP。

1.2.2 細胞毒性檢測：以細胞密度為1×104/mL接種于96孔板，用0、10、20、50、100、200 μg/mL ABP處理24 h，CCK-8試劑盒檢測各組細胞數(shù)。

1.2.3 ELISA檢測：各組細胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后，檢測各組細胞TNF-α、IL-6的相對含量，重復(fù)3次，具體參照ELISA試劑盒說明書操作步驟。

1.2.4 Western blot檢測：LPS預(yù)處理細胞培養(yǎng) 24 h后，胰蛋白酶法提取各組細胞蛋白，細胞蛋白濃度測定試劑BCA法蛋白定量。Western blot檢測各組細胞炎癥因子、細胞黏附分子及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達。

1.2.5 RT-PCR檢測：RT-PCR檢測各組細胞炎癥因子、細胞黏附分子及NF-κB信號通路相關(guān)基因表達，具體參考試劑盒說明書上操作步驟。

圖3 各組HUVECs中COX-2、iNOS的表達變化

1.2.6 免疫熒光檢測：各組細胞4%的多聚甲醛溶液固定，一抗溶液充分覆蓋細胞，4 ℃冰箱過夜；二抗溶液充分覆蓋細胞，使用DAPI細胞核染色1 min 后，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，比較采用單因素方差分析和重復(fù)測量資料的方差分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度ABP對HUVECs細胞毒性的影響 終濃度為10、20及50 μg/mL ABP作用于HUVECs細胞24、 48 h后，其細胞增殖較空白組均無明顯抑制（P＞0.05）。終濃度為100、200 μg/mL ABP作用于HUVECs 細胞24、48 h后，其細胞增殖較空白組均有明顯下降（P＜0.05），見圖1。因此選擇10、20、50 μg/mL 3個ABP藥物濃度用于后續(xù)實驗。

2.2 各組HUVECs中TNF-α和IL-6的表達情況 LPS組中TNF-α和IL-6蛋白表達顯著高于Control組（P＜ 0.01）；LPS+ABP組隨藥物濃度升高，其TNF-α和IL-6蛋白表達較LPS組呈下降趨勢，20、50 μg/mL濃度組均明顯低于LPS組（P＜0.05）。LPS組中TNF-α和IL-6 mRNA表達顯著高于Control組（P＜0.01）；LPS+ABP組隨藥物濃度升高，TNF-α mRNA表達逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；50 μg/mL組IL-6 mRNA較LPS組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖4 各組HUVECs中ICAM-1、VCAM-1的表達變化

2.3 各組HUVECs中COX-2和iNOS的表達情況 LPS組HUVECs細胞COX-2、iNOS的蛋白表達量較Control組顯著升高（P＜0.01）；20、50 μg/mL濃度LPS+ABP組，其COX-2、iNOS蛋白表達較LPS組逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。LPS組COX-2、iNOS mRNA表達量較Control組顯著升高（P＜0.01）；LPS+ABP組隨藥物濃度升高，其COX-2、iNOS mRNA表達較LPS組有下降趨勢，與LPS組比，50 μg/mL LPS+ ABP組COX-2 mRNA下降明顯（P＜0.05）；與LPS組比，20、50 μg/mL LPS+ABP組iNOS mRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

2.4 各組HUVECs中ICAM-1、VCAM-1的表達情況 LPS組中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達量顯著高于Control 組（P＜0.01）；20、50 μg/mL LPS+ABP組其ICAM-1、VCAM-1蛋白表達較LPS組降低（P＜0.05）；10 μg/mL LPS+ABP組ICAM-1蛋白表達較LPS組降低（P＜0.05）。LPS組ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達量較Control組顯著升高（P＜0.01）；LPS+ABP組隨藥物濃度升高，其ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達較LPS組逐漸下降，20、50 μg/mL濃度組均明顯低于LPS組（P＜0.05），見圖4。

2.5 各組HUVECs中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達情況 LPS組中p-p65/p65及p-IκB/IκB蛋白相對表達量顯著高于Control組（P＜0.01）；10、20、 50 μg/mL LPS+ABP組p-p65/p65相對表達量較LPS組逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；20、 50 μg/mL LPS+ABP組p-IκB/IκB蛋白相對表達量較LPS組降低（P＜0.01），見圖5。

2.6 ABP抑制由LPS誘導(dǎo)的HUVECs中p65蛋白核移位 LPS組中代表p65蛋白的綠色熒光主要集中于細胞核中；LPS+ABP組中，代表p65蛋白的綠色熒光的大部分聚集在內(nèi)皮細胞的細胞質(zhì)中，少部分集中于細胞核中（見箭頭標注處），見圖6。

3 討論

IL-6是一種急性期反應(yīng)的重要細胞因子。研究表明，IL-6及其家族成員的含量水平對疾病的預(yù)后判斷有重要作用[9]。TNF-α可以促進細胞內(nèi)iNOS的合成及釋放，而iNOS則可以進一步促進NO的生成，最終導(dǎo)致炎癥[10]。本研究中LPS組IL-6和TNF-α的表達顯著升高，在不同濃度ABP干預(yù)后，其含量則顯著下降，表明ABP可能抑制HUVECs中炎癥因子的表達。

圖5 各組HUVECs中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達變化

有研究報道在膿毒癥小鼠模型中，血液循環(huán)中iNOS和COX-2的含量顯著上升[11]。抑制iNOS和COX-2表達，可減輕炎癥，緩解膿毒血癥臨床癥狀[13]。 本研究發(fā)現(xiàn)LPS可促進HUVECs細胞iNOS、COX-2蛋白基因表達，加入不同濃度ABP干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，且呈劑量依賴性，表明ABP可抑制LPS誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)炎癥因子（iNOS和COX-2）合成與釋放。

圖6 各組HUVECs中p65蛋白的核移位圖（免疫熒光染色，×400）

另外，LPS可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞合成、釋放ICAM-1、VCAM-1等細胞間黏附分子[14]。ZHENG等[15]研究表明，蒲公英甾醇可通過抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷中ICAM-1、VCAM-1的表達，進而發(fā)揮抗炎作用。王莎等[16]研究證明葛根素可明顯減輕由LPS所致的小鼠血管內(nèi)皮的損傷，機制可能與下調(diào)損傷的血管細胞間黏附分子相關(guān)。本研究顯示，LPS可誘導(dǎo)HUVECs高表達ICAM-1、VCAM-1，而加入不同濃度ABP干預(yù)后則可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象?？梢?，ABP可能通過下調(diào)ICAM-1和VCAM-1表達保護血管內(nèi)皮細胞。

NF-κB信號通路是機體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄途徑，研究認為細胞間黏附分子的抗炎作用可能與NF-κB信號通路的活化相關(guān)[17]。細胞內(nèi)細胞間黏附分子基因的啟動子上均含有NF-κB相關(guān)蛋白的對應(yīng)結(jié)合位點，當(dāng)外界或體內(nèi)的各種刺激因素導(dǎo)致NF-κB信號通路被激活后，可促進細胞內(nèi)各種細胞間黏附分子大量表達[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS可上調(diào)HUVECs細胞p-p65和p-IκB蛋白表達，而加入不同濃度ABP干預(yù)后，能以劑量依賴性的方式逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，最終減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，ABP可能通過下調(diào)NF-κB信號通路逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的HUVECs損傷。