蔣永生，張夢(mèng)佩，韓春嬋，黃立江

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬象山醫(yī)院，浙江 寧波 315700，1.科教管理中心；2.消化內(nèi)科）

外周神經(jīng)損傷（peripheral nerve injury，PNI）會(huì)導(dǎo)致支配區(qū)域出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)的喪失并誘發(fā)劇烈的神經(jīng)疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。臨床治療中，自體神經(jīng)移植仍然被視為修復(fù)缺損神經(jīng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]。但由于存在來(lái)源受限、獲取組織的個(gè)體差異及術(shù)后并發(fā)癥等原因，致其應(yīng)用受限[3-4]。 為解決這一難題，研究人員嘗試?yán)萌ゼ?xì)胞后的異種組織對(duì)PNI進(jìn)行修復(fù)。由于豬神經(jīng)和人神經(jīng)的基因序列和結(jié)構(gòu)形態(tài)極為相似，故將自體神經(jīng)及其制備的產(chǎn)品替換為去細(xì)胞后的豬神經(jīng)組織并運(yùn)用于PNI的修復(fù)成為目前研究的熱點(diǎn)[5]。本研究通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，對(duì)人神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)（human decellularized nerve matrix，hDNM）和豬神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)（porcine decellularized nerve matrix， pDNM）存在的差異蛋白進(jìn)行GO和Pathway分析，同時(shí)繪制2組脫細(xì)胞基質(zhì)相關(guān)蛋白的熱圖，為開(kāi)發(fā)豬神經(jīng)生物材料并運(yùn)用于PNI的臨床治療提供支撐。

1 材料和方法

1.1 材料 hDNM購(gòu)自廣州中大醫(yī)療器械有限公司[商品名：神橋；批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2012第3460641號(hào)]。pDNM委托廣州中大醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)提取：pDNM（3個(gè)樣）和hDMN（6個(gè)樣）共計(jì)9個(gè)樣品，4 ℃凍融并用預(yù)冷的PBS清洗2次，以去除樣本中殘留液體。將組織迅速置于-80 ℃ 預(yù)冷的研磨鋼管中，加入鋼珠，使用上海凈信全自動(dòng)樣品快速研磨儀（型號(hào)：JXFSTPRP-32），研磨 1 min。往研磨鋼管中加入1 mL的SDS裂解液（上海碧云天，P0013G），于冰上反應(yīng)30 min（每隔10 min渦旋1 min）。將研磨鋼管中的蛋白質(zhì)裂解液轉(zhuǎn)移至新的EP管，170 000×g，4 ℃離心30 min，取上清液至新的EP管中并運(yùn)用BCA法檢測(cè)各樣本蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2 蛋白質(zhì)酶解：將各個(gè)樣品50 μg的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到新試管中，加入DTT到樣品中使其終濃度為 20 mmol/L，在37 ℃中反應(yīng)1 h。隨后，加入 60 mmol/L的IAA，避光于室溫進(jìn)行烷基化反應(yīng) 30 min。反應(yīng)完成后加入6倍體積的冷丙酮， -20 ℃沉淀5 h。然后，于4 ℃中1 000×g離心收集蛋白沉淀，再用冷丙酮洗一次沉淀體。加入 20 ng/μL的胰酶25 μL，渦旋沉淀使其溶解，于 37 ℃反應(yīng)過(guò)夜，最后將酶切好的多肽用C18除鹽小柱除鹽。

1.2.3 TMT標(biāo)記肽段混合物：采用TMT-10Plex （Thermo Scientific，美國(guó)）標(biāo)記定量試劑盒，遵照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記肽段樣品混合后凍干。

1.2.4 高pH反相分離肽段：混合物重溶于Solvent A（Solvent A：20 mmol/L甲酸銨水溶液，氨水調(diào) 節(jié)至pH 10.0）后用Ultimate 3000系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）連接反向柱（XBridge C18 column，4.6 mm×250 mm，5 μm，Waters Corporation，美國(guó)）進(jìn)行高pH分離，分離使用線性梯度，40 min內(nèi)5% B至45% Solvent A（B：80% ACN中加入20 mmol/L甲酸銨，氨水調(diào)節(jié)至pH 10.0）。柱子在初始條件下平衡15 min，柱流速維持在0.8 mL/min， 柱溫維持在30 ℃。收集到12個(gè)fraction，各個(gè)fraction在真空濃縮儀中干燥待用。

1.2.5 nano-HPLC-MS/MS分析：各fraction重溶于30 μL solvent C（C：0.1%甲酸水溶液）后由配備在線納噴離子源的LC-MS/MS進(jìn)行分析。整套系統(tǒng)為串聯(lián)EASY-nano-LC的Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀 （Thermo Scientific，美國(guó)）。5 μL（1 μg）肽段樣品以4 μL/min流量上樣到捕集柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap C18，100 μm×2 cm），隨后在分析柱（Acclaim PepMap C18，75 μm×15 cm）中以 90 min梯度分離：由7% D升至32% D，3～79 min，梯度時(shí)間76 min（D：0.1%甲酸ACN溶液）。柱流量控制在300 nL/min，電噴霧電壓2.1 kV。Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)依賴(lài)采集模式下運(yùn)行，自動(dòng)在MS和MS/MS采集間切換，3 s一個(gè)周期。在60 K質(zhì)量分辨率下獲得全掃描譜圖（m/z 350-1550），隨后在50 K分辨率下進(jìn)行后續(xù)HCD MS/MS掃描，AGC target 為8e4，最大注入時(shí)間120 ms。設(shè)置為n=1后實(shí)施動(dòng)態(tài)排除，時(shí)間為45 s。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理：Protein Discoverer 2.1 SP1進(jìn)行搜庫(kù)分析，使用的數(shù)據(jù)庫(kù)為人類(lèi)及豬的同源肽段數(shù)據(jù)庫(kù)并構(gòu)建同源肽段數(shù)據(jù)庫(kù)，其原則為：數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行胰酶理論酶解，過(guò)濾所有非同源肽段，對(duì)篩選到兩個(gè)物種中100%序列匹配的特異肽段（unique peptide）進(jìn)行合并得到同源肽段庫(kù)。搜庫(kù)參數(shù)如下：MS1的容差值為0.001%，二級(jí)碎片的容差值為 0.02 Da，允許的最大漏切數(shù)為2，半胱氨酸 Carbamidomethyl為固定修飾，甲硫氨酸氧化，N端乙?；癁榭勺冃揎?，蛋白鑒定控制FDR＜0.01，特異肽至少大于1。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控 本研究使用pDNM組的6個(gè)樣品組和hDNM的3個(gè)樣本定量蛋白的強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，由圖1A的結(jié)果可知，2組樣本分布在二位空間不同的區(qū)域區(qū)分明顯，說(shuō)明2組樣本間存在差異。層次聚類(lèi)進(jìn)行樣本間的Pearson相關(guān)性系數(shù)分析（見(jiàn)圖1B），得出組內(nèi)、組間樣本間的相關(guān)性絕大多數(shù)都達(dá)到了0.75以上，表明2組組樣本的生物學(xué)均一性較好，組內(nèi)相關(guān)性很高。

圖1 試驗(yàn)樣本的數(shù)據(jù)控質(zhì)

2.2 差異表達(dá)蛋白鑒定結(jié)果 LC-MS/MS檢測(cè)分析了2組樣品可信蛋白1 448個(gè)，其相對(duì)含量繪制成熱圖（見(jiàn)圖2A），結(jié)果表明：2組蛋白都能明顯區(qū)分，組內(nèi)重復(fù)性良好，表達(dá)模式存在差異，且相較于hDNM組，pDNM組整體上調(diào)。對(duì)組間差異表達(dá)蛋白進(jìn)行篩選，篩選條件為：組內(nèi)重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05的蛋白被認(rèn)為差異顯著，且蛋白豐度差異倍數(shù)達(dá)到2倍以上或者0.5倍以下。篩選結(jié)果表明，相比hDNM組，pDNM組表達(dá)上調(diào)蛋白456個(gè)，表達(dá)下調(diào)蛋白170個(gè)（見(jiàn)圖2B）。

圖2 pDNM和hDNM不同蛋白的定量差異

2.3 差異蛋白生物信息功能分析 對(duì)pDNM上調(diào)的456個(gè)蛋白進(jìn)行GO分析，結(jié)果顯示，上調(diào)蛋白主要集中在細(xì)胞遷移、細(xì)胞骨架組織、軸突發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)節(jié)等生物過(guò)程；主要涉及生長(zhǎng)錐、軸突、神經(jīng)元胞體和突觸部分等細(xì)胞組分；參與的生物過(guò)程主要與生物功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)組成、肌動(dòng)活性和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）結(jié)構(gòu)協(xié)同等方面相關(guān)。KEGG通路分析顯示，2組間的差異蛋白主要介入的功能包括肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、軸突的引導(dǎo)、ECM受體相互作用和營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路等。這些富集通路中上調(diào)和下調(diào)的蛋白數(shù)目分別為24、26、25、19和13、9、14、10。見(jiàn)圖3。

圖3 差異蛋白生物信息功能分析

2.4 ECM相關(guān)蛋白含量組間差異 ECM由多種蛋白質(zhì)和多糖及可溶性因子組成，其中，層粘連蛋白、膠原蛋白和纖維粘連蛋白可以為細(xì)胞的生長(zhǎng)創(chuàng)造良好的微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)纖維的再生和神經(jīng)功能的修復(fù)[6]。糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）和肝素帶有大量負(fù)電荷，易與各類(lèi)生長(zhǎng)因子相結(jié)合進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)行為和特定的生物學(xué)過(guò)程[7]。由蛋白質(zhì)組學(xué)定量的結(jié)果可知，上述ECM相關(guān)蛋白在組內(nèi)含量較為一致，組間差異較為顯著。與hDNM組相比，pDNM含有更多的粘連蛋白、膠原蛋白和纖維粘連蛋白，但GAGs和肝素的含量較少（見(jiàn)圖4）。

圖4 組間ECM相關(guān)蛋白表達(dá)差異熱圖

3 討論

在臨床實(shí)踐中，將捐獻(xiàn)者的神經(jīng)脫細(xì)胞后，再與患者斷裂的神經(jīng)進(jìn)行橋接被認(rèn)為是修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損的策略之一，將該去細(xì)胞同種異體神經(jīng)開(kāi)發(fā)成臨床治療PNI的產(chǎn)品包括神橋和Avance?[8-9]。然而，人的脫細(xì)胞神經(jīng)不能廣泛運(yùn)用于PNI的修復(fù)，受限的原因主要包括[10]：①來(lái)源有限。獲取的途徑主要通過(guò)志愿者的捐贈(zèng)，數(shù)量較少。②質(zhì)量層次不齊。捐贈(zèng)的神經(jīng)來(lái)源于不同年齡、不同健康程度的人群，且存放時(shí)間不同，導(dǎo)致供體神經(jīng)的質(zhì)量無(wú)法保證。③術(shù)后并發(fā)癥。存在移植后供體神經(jīng)與配體神經(jīng)大小不匹配、手術(shù)過(guò)程中的技術(shù)差異等原因?qū)е碌男g(shù)后神經(jīng)疼痛、神經(jīng)腫瘤甚至無(wú)顯著功能恢復(fù)的情況。

為解決上述問(wèn)題，科研人員已經(jīng)將研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到豬組織材料產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)上。因?yàn)樨i和人的基因序列極為相似，利用豬的心臟器官制備的水凝膠（臨床批準(zhǔn)號(hào)：NCT 0230562）可通過(guò)重塑缺血心臟內(nèi)部的微環(huán)境進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞的浸潤(rùn)與生存，達(dá)到預(yù)防和（或）治療心肌梗死的目的[11]。另外，在解剖學(xué)中，豬神經(jīng)的構(gòu)造和形態(tài)與人神經(jīng)較為類(lèi)似，且在農(nóng)業(yè)高度發(fā)達(dá)的今天，家豬的飼養(yǎng)已成規(guī)?；蜕虡I(yè)化，故豬神經(jīng)的來(lái)源較為廣泛且價(jià)格適 宜[5]。因此，豬神經(jīng)組織產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)為人類(lèi)PNI的修復(fù)提供了一條有吸引力的可替代途徑[12-13]。已有研究報(bào)道，可成功制備豬的脫細(xì)胞神經(jīng)，并檢測(cè)出內(nèi)部DNA的含量較低且保留主要的ECM相關(guān)蛋白（包括膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白）[14]。KVIST等[15]利用豬神經(jīng)（異種）和鼠神經(jīng)（異體）分別移植入大鼠10 mm缺損坐骨神經(jīng)的兩端并進(jìn)行10 d 的修復(fù)，發(fā)現(xiàn)二者均可有效地促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)和髓鞘相關(guān)蛋白的表達(dá)。

盡管豬神經(jīng)組織運(yùn)用于PNI的修復(fù)存在一定的前景，但該組織的直接運(yùn)用可能無(wú)法達(dá)到修復(fù)損傷神經(jīng)的目的，因?yàn)樨i神經(jīng)含有引起免疫排斥反應(yīng)的生物大分子，包括a（1，3）-半乳糖[α（1，3）-galactose，α-gal]和主要組織相容性復(fù)合物I （majorhistocompatibility complex class I，MHC I），以及一些內(nèi)毒素[16]。這些物質(zhì)必須盡量地去除以保證移植體內(nèi)后的生物安全。脫細(xì)胞技術(shù)可通過(guò)化學(xué)和物理的方法去除神經(jīng)組織中的細(xì)胞，形成無(wú)免疫原性或低免疫原性的神經(jīng)材料。因此，在修復(fù)PNI的臨床運(yùn)用中，需要對(duì)豬神經(jīng)組織的原材料進(jìn)行脫細(xì)胞化。已有研究報(bào)道稱(chēng)，將pDNM制備成生物水凝膠涂抹在納米纖維的表面可促進(jìn)施旺細(xì)胞（Schwann cells，SCs）的遷移和軸突的再髓鞘化[17]。也有研究證實(shí)，將該生物水凝膠灌注于神經(jīng)導(dǎo)管的表面可顯著提高外周神經(jīng)缺損動(dòng)物神經(jīng)纖維的再生和功能的恢復(fù)[18]。這些研究結(jié)果表明，利用豬神經(jīng)制備的生物材料對(duì)外周神經(jīng)的保護(hù)和再生療效顯著。但是在脫細(xì)胞的過(guò)程中，除去免疫原性物質(zhì)的同時(shí)，一些神經(jīng)組織內(nèi)部含有的ECM蛋白，比如層粘連蛋白、膠原蛋白和纖維粘連蛋白，也不可避免地被去除[7]，而這類(lèi)物質(zhì)可營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞并為神經(jīng)的再生創(chuàng)造良好的微環(huán)境。因此，對(duì)脫細(xì)胞后的基質(zhì)內(nèi)部各類(lèi)蛋白的有無(wú)和含量進(jìn)行檢測(cè)對(duì)評(píng)價(jià)該類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量和有效性至關(guān)重要。

本研究采用TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)pDNM和hDNM含有的各類(lèi)蛋白進(jìn)行定量并進(jìn)行差異化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pDNM選取的3個(gè)樣本和hDNM選取的6個(gè)樣本均呈現(xiàn)組內(nèi)均一性和重復(fù)性良好、組間差異性顯著的特征，且pDNM內(nèi)部含有的各類(lèi)蛋白的量整體多于hDNM。造成這種結(jié)果的原因包括：①豬神經(jīng)本身具有的蛋白含量高于人神經(jīng)；②由于在脫細(xì)胞過(guò)程中，人神經(jīng)比豬神經(jīng)更加容易除去自身的各類(lèi)蛋白，導(dǎo)致pDNM含有的各類(lèi)蛋白含量高于hDNM。故選擇適宜的脫細(xì)胞方法和試劑，盡可能地除去組織器官內(nèi)的免疫原性大分子，并盡量保留能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和組織發(fā)育的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，對(duì)脫細(xì)胞產(chǎn)品的醫(yī)學(xué)運(yùn)用至關(guān)重要。

本研究利用生物信息學(xué)對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO富集化和KEGG通路分析，結(jié)果顯示，上調(diào)的pDNM蛋白主要富集于生長(zhǎng)錐、軸突、神經(jīng)元胞體和突觸部分，并調(diào)控細(xì)胞遷移、神經(jīng)系統(tǒng)和軸突的發(fā)育等生物功能，說(shuō)明pDNM富含的相關(guān)蛋白可能對(duì)損傷神經(jīng)的再生和修復(fù)具有重要的影響。KEGG通路分析顯示，差異蛋白主要介入的功能包括肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)和軸突引導(dǎo)等方面，且pDNM上調(diào)的蛋白數(shù)更多，進(jìn)一步驗(yàn)證上述推論。本研究對(duì)為細(xì)胞生長(zhǎng)提供良好微環(huán)境并營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)和促進(jìn)其發(fā)育的一類(lèi)ECM相關(guān)蛋白在pDNM和hDNM的表達(dá)進(jìn)行了整理并繪制熱圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然pDNM含有的GAGs和肝素含量不及hDNM，但對(duì)于粘連蛋白、膠原蛋白和纖維粘連蛋白這些主要的ECM蛋白在pDNM的含量更高，可能這些ECM蛋白的豐富存留是豬神經(jīng)去細(xì)胞材料具有優(yōu)越修復(fù)PNI的重要緣由。

綜上，pDNM含有的各類(lèi)蛋白的量總體高于hDNM， 且具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和組織發(fā)育的ECM相關(guān)蛋白在pDNM富含更多?；诖耍覀兊难芯靠梢詾樨i神經(jīng)去細(xì)胞材料替代人神經(jīng)去細(xì)胞產(chǎn)品提供更多地?cái)?shù)據(jù)支持。