曹佳欣，程琳妍，劉淑賢，譚峰

（溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035，1.眼視光學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院；2.第一臨床醫(yī)學(xué)院；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）是一種機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)，可寄生于人和哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、爬行類等動(dòng)物的有核細(xì)胞內(nèi)。據(jù)評(píng)估，全球約1/3人口血清弓形蟲(chóng)抗體呈陽(yáng)性[1]，所致的弓形蟲(chóng)病是一種重要的人畜共患疾病。當(dāng)宿主免疫力下降時(shí)，弓形蟲(chóng)?？梢鸸蜗x(chóng)腦炎、弓形蟲(chóng)眼病等，嚴(yán)重時(shí)可致死亡[2]。尋找合適的弓形蟲(chóng)防治藥物靶點(diǎn)對(duì)于弓形蟲(chóng)病的防治具有重要意義。

頂質(zhì)體是大多數(shù)頂復(fù)門(mén)寄生蟲(chóng)（包括弓形蟲(chóng)）中一個(gè)獨(dú)特的、葉綠體樣細(xì)胞器，對(duì)于蟲(chóng)體發(fā)育具有極其重要的作用，能夠?yàn)橄x(chóng)體脂肪酸、類異戊二烯和血紅素等生物合成提供重要場(chǎng)所[3]。由于頂質(zhì)體不存在于其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，因而被認(rèn)為是特異性抑制或殺滅弓形蟲(chóng)的理想靶點(diǎn)[4]。與其他質(zhì)體相似，絕大多數(shù)頂質(zhì)體蛋白為核編碼蛋白[5-6]，分別為包含有經(jīng)典的靶向肽序列蛋白和缺失經(jīng)典的靶向肽序列蛋白[7]。弓形蟲(chóng)頂質(zhì)體基質(zhì)蛋白Cpn60蛋白（TgCpn60）屬于前者。

Cpn60為第I類伴侶蛋白，因其大小為60 kDa，一般稱為Chaperonin60。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有兩類伴侶蛋白，第I類伴侶蛋白最常見(jiàn)，廣泛存在于原核和真核生物中的寡聚蛋白復(fù)合體，如存在于細(xì)菌（GroEL）、 質(zhì)體（Cpn60）和線粒體（Hsp60）。細(xì)菌伴侶蛋白[8-9]和線粒體伴侶蛋白[10-11]已有較深入的研究，在高等植物中，Cpn60被證實(shí)具有幫助蛋白完成折疊裝配的功能[12]。而在頂復(fù)門(mén)寄生蟲(chóng)中，Cpn60的生物學(xué)功能及作用機(jī)制尚未明確。據(jù)此，我們?cè)诠蜗x(chóng)數(shù)據(jù)庫(kù)ToxoDB中找到弓形蟲(chóng)伴侶蛋白TgCpn60的編碼基因，通過(guò)原核表達(dá)TgCpn60蛋白，制備其特異性多克隆抗體，為研究該蛋白生物學(xué)功能、觀察頂質(zhì)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)提供實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、蟲(chóng)株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：原核表達(dá)載體pGEX-4T-1、大腸埃希菌（E.coli）TOP10和BL21感受態(tài)細(xì)胞、人包皮成纖維細(xì)胞（human foreskin fibroblasts，HFF）、弓形蟲(chóng)RH株速殖子均為本實(shí)驗(yàn)室保存。pFNR-RFP質(zhì)粒為法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心Sébastien Besteiro教授饋贈(zèng)。BALB/c小鼠購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009。

1.1.2 PCR引物設(shè)計(jì)與合成：①巢式PCR引物：根據(jù)ToxoDB中TgCpn60基因編碼序列（TGGT1_ 240600）， 并針對(duì)編碼該蛋白C末端168個(gè)氨基酸殘基的507 bp 基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物：TgCpn60-P1：5’-TGATCGG TGCGTCGACAGAAAC-3’；TgCpn60-P2：5’-ACGGTAAGCGG CAAGTTAGGTAGAG-3’；TgCpn60-P3：5’-CGGGATCCCTCGA AACTGGCTACGTTCCCG-3’；TgCpn60-P4：5’-CCGCTCGAGT CATGCCATTGGCATGTCTGGTAC-3’（下劃線部分分別為限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI的酶切位點(diǎn)）。②重組質(zhì)粒鑒定PCR引物：根據(jù)載體pGEX-4T-1序列設(shè)計(jì)以下通用測(cè)序引物：TgCpn60-F：5’-GACCCAATGTGCCTGG AT-3’；TgCpn60-R：5’-CCGGCATCCGCTTACAGA-3’，引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.1.3 主要試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript?II 1st Srand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit購(gòu)自美國(guó)KAPA Biosystems公司；4×蛋白上樣緩沖液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA Bio-tek公司；限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI、T4DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；GoTaqTMGreen Master Mix購(gòu)自美國(guó)Promega公司；IPTG購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蛋白酶抑制劑購(gòu)自瑞士Roche生物公司；蛋白純化Glutathione-SepharoseTM4B購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；Protein A親和介質(zhì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自合肥Biosharp生物科技公司；Dlight 488山羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自美國(guó)EarthOx Life Science公司；0.22 μm PVDF轉(zhuǎn)移膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 巢式PCR擴(kuò)增目的片段：弓形蟲(chóng)RH株速殖子常規(guī)培養(yǎng)，待蟲(chóng)株完全出胞，將蟲(chóng)體懸液經(jīng)3 μm濾膜過(guò)濾后離心收集蟲(chóng)體。以TRIzol法提取蟲(chóng)體總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增編碼該TgCpn60蛋白C末端的507 bp編碼基因，第一輪PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板0.5 μL，TgCpn60-P1、TgCpn60-P2引物（10 μmol/L）各0.5 μL，10×Buffer for KOD Plus 2.5 μL，dNTPs（2 mmol/L each） 2 μL，MgSO4（25 mmol/L）1 μL，KOD Plus 0.5 μL， 加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min， 94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、68 ℃延伸75 s，共15個(gè)循環(huán)，68 ℃再延伸10 min；第二輪PCR反應(yīng)體系為：第一輪PCR產(chǎn)物1.5 μL，TgCpn60-P3、TgCpn60-P4引物（10 μmol/L）各1 μL，10×Buffer for KOD Plus 5 μL，dNTPs（2 mmol/L each） 4 μL，MgSO4（25 mmol/L）2 μL，KOD Plus 1 μL，加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min， 94 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s、68 ℃延伸1 min， 共3個(gè)循環(huán)，94 ℃變性30 s、66 ℃退火30 s、68 ℃ 延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，68 ℃再延伸10 min。

1.2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA的構(gòu)建和鑒定：限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI分別雙酶切TgCpn60C168AA的PCR產(chǎn)物和pGEX-4T-1質(zhì)粒，37 ℃酶切3 h。2%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，T4DNA連接酶將目的基因和載體酶切回收產(chǎn)物于16 ℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物利用熱激法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)TOP10，涂板氨芐抗性平板，37 ℃ 倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落利用引物TgCpn60-F和TgCpn60-R進(jìn)行菌液PCR鑒定，反應(yīng)體系為：GoTaqTMGreen Master Mix酶10 μL，TgCpn60-F、TgCpn60-R 引物（10 μmol/L）各1 μL，菌液2 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，共25個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸5 min。陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后送北京華大基因科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 重組蛋白GST-TgCpn60C168AA的誘導(dǎo)表達(dá)、純化和鑒定：將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA熱激法轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落，加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L，于37 ℃常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。將誘導(dǎo)后產(chǎn)物離心收集菌體，沉淀超聲裂解后4 ℃、12 000 r/min離心，Glutathione-SepharoseTM4B介質(zhì)純化上清液中的GST-TgCpn60C168AA重組蛋白，常規(guī)SDS-PAGE電泳分析TgCpn60蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 抗體制備：取純化后的GST-TgCpn60C168AA融合蛋白適量加入等體積的弗氏完全佐劑充分混勻后背部皮下多點(diǎn)注射免疫5只BALB/c小鼠，1 mg/只。之后每隔15 d，0.5 mg/只抗原加等體積的弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫1次，共3次。

1.2.5 抗體效價(jià)及特異性鑒定：免疫結(jié)束后，采集鼠血清，將免疫鼠血清以起始濃度為1:1 000進(jìn)行3倍梯度稀釋，濃度分別為1:1 000、1:3 000、1:9 000、1:27 000、1:81 000、1:243 000，稀釋后的鼠血清作為一抗，以免疫前鼠血清（1:1 000）作為對(duì)照，以GST-TgCpn60C168AA蛋白包被酶標(biāo)板進(jìn)行間接ELISA評(píng)價(jià)免疫后小鼠血清抗體效價(jià)。將ELISA檢測(cè)效價(jià)最高的小鼠血清混合，用平衡緩沖液稀釋到2 mL，然后用0.5 mL的Protein A填料進(jìn)行親和純化。洗脫的目的蛋白用PBS（pH7.4）透析兩次后，使用截流量為10 kDa的超濾管濃縮后分裝保存于-80 ℃。分別取純化前蛋白、穿透液、洗雜液和洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳以評(píng)價(jià)純化效果。

1.2.6 多抗識(shí)別弓形蟲(chóng)內(nèi)源性TgCpn60：提取蟲(chóng)體總蛋白行SDS-PAGE電泳后，分別以免疫前鼠血清和制備的鼠抗TgCpn60C168AA多克隆抗體（1:1 000）作為一抗，羊抗鼠HRP-IgG（1:5 000）作為二抗，Western blot檢測(cè)抗體特異性。以重組GST-TgCpn60C168AA蛋白為陽(yáng)性對(duì)照，HFF細(xì)胞總蛋白為陰性對(duì)照。

1.2.7 間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IFA）檢測(cè)TgCpn60蛋白與 TgFNR蛋白共定位情況：將純化好的50 μg pFNRRFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入弓形蟲(chóng)RH株，電轉(zhuǎn)條件為：電壓1 700 V、脈沖時(shí)程176 μs、脈沖次數(shù)2次、脈沖間隔100 ms。電轉(zhuǎn)72 h后進(jìn)行IFA試驗(yàn)，常規(guī)固定、透化、封閉蟲(chóng)體，分別以免疫前鼠血清和制備的鼠抗TgCpn60C168AA多克隆抗體作為一抗、Dlight 488山羊抗鼠IgG抗體作為二抗。染色結(jié)束后進(jìn)行DAPI核染、封片。玻片置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 TgCpn60C168AA編碼基因的目的片段理論大小為507 bp，巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在約507 bp處可見(jiàn)一條清晰的特異性擴(kuò)增條帶，與理論大小一致（見(jiàn)圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA的鑒定 采用載體上的通用引物（包含靶基因在內(nèi)的全片段長(zhǎng)度為806 bp）對(duì)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA進(jìn)行PCR鑒定。電泳結(jié)果表明，所挑取的5個(gè)單克隆菌落的目的基因片段均約為806 bp（見(jiàn)圖2）。測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明：該質(zhì)粒含有一個(gè)507 bp、與TgCpn60C168AA編碼序列完全一致的片段序列，證實(shí)pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 弓形蟲(chóng)TgCpn60C168AA編碼基因PCR產(chǎn)物

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA鑒定結(jié)果

2.3 GST-TgCpn60C168AA融合蛋白的表達(dá)、純化和鑒定 TgCpn60C168AA蛋白預(yù)期大小約17 kDa，而GST標(biāo)簽蛋白約24 kDa，因此GST-TgCpn60C168AA融合蛋白的全長(zhǎng)約為41 kDa。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA轉(zhuǎn)化至BL21表達(dá)菌中，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)Glutathione-SepharoseTM4B介質(zhì)純化，SDS-PAGE檢測(cè)可見(jiàn)大量目的蛋白，其蛋白大小符合預(yù)期（見(jiàn)圖3），純化后蛋白濃度為16.8 mg/mL。

2.4 鼠抗GST-TgCpn60C168AA多克隆抗體純化 經(jīng)免疫后，以免疫前鼠血清為對(duì)照，ELISA法測(cè)定5只免疫鼠抗GST-TgCpn60C168AA血清效價(jià)，其中4只鼠血清抗體效價(jià)達(dá)到1:81 000。將這4只鼠血清收集后經(jīng)親和層析純化，SDS-PAGE檢測(cè)顯示，純化后的多克隆抗體純度在90%以上（見(jiàn)圖4）。

2.5 評(píng)價(jià)鼠抗GST-TgCpn60C168AA多抗識(shí)別弓形蟲(chóng)內(nèi)源性TgCpn60的能力 提取弓形蟲(chóng)全蟲(chóng)蛋白行Western blot檢測(cè)，以免疫前鼠血清作為一抗發(fā)現(xiàn)血清不能識(shí)別弓形蟲(chóng)內(nèi)源性TgCpn60，而鼠抗GST-TgCpn60C168AA多克隆抗體與弓形蟲(chóng)全蟲(chóng)蛋白在 40、60 kDa附近分別出現(xiàn)反應(yīng)帶，宿主細(xì)胞組作為陰性對(duì)照，與鼠抗TgCpn60無(wú)特異性結(jié)合（見(jiàn)圖5）。

圖3 GST-TgCpn60C168AA融合蛋白SDS-PAGE鑒定結(jié)果

圖4 SDS-PAGE鑒定純化后鼠抗GST-TgCpn60C168AA多克隆抗體

圖5 Western blot分別檢測(cè)免疫前鼠血清（左）和抗GST-TgCpn60C168AA多抗（右）與內(nèi)源性TgCpn60反應(yīng)

2.6 IFA檢測(cè)TgCpn60蛋白與TgFNR蛋白共定位情況 將pFNR-RFP質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染弓形蟲(chóng)后，分別以免疫前鼠血清和鼠抗GST-TgCpn60C168AA多克隆抗體為一抗進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果顯示，免疫前鼠血清不能識(shí)別蟲(chóng)體內(nèi)源性TgCpn60蛋白，而制備的多克隆抗體可以識(shí)別蟲(chóng)體內(nèi)兩種形式的TgCpn60蛋白，并且TgCpn60成熟蛋白與TgFNR（頂質(zhì)體外腔膜標(biāo)志物）存在共定位情況（見(jiàn)圖6）。

圖6 TgCpn60與TgFNR共定位IFA實(shí)驗(yàn)結(jié)果（箭頭所指為共定位位置）

3 討論

弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體在分裂過(guò)程中，親代蟲(chóng)體的頂質(zhì)體會(huì)附著在中心體上，隨著細(xì)胞核分裂而分離，使得每個(gè)子代蟲(chóng)體都含有一個(gè)頂質(zhì)體[13]，若干擾此過(guò)程，蟲(chóng)體會(huì)出現(xiàn)遲發(fā)型死亡表型[14]。雖然頂質(zhì)體具有獨(dú)立、可自主復(fù)制的基因組[15]，但絕大多數(shù)頂質(zhì)體蛋白仍由核基因編碼，核編碼蛋白如何定位于頂質(zhì)體以及如何輸入至頂質(zhì)體四層膜結(jié)構(gòu)尚未明確。TgCpn60蛋白已經(jīng)被證實(shí)是定位于頂質(zhì)體基質(zhì)腔的核編碼蛋白[16]，是研究核編碼蛋白如何輸入至頂質(zhì)體的理想靶標(biāo)。

TgCpn60蛋白屬于含有經(jīng)典的靶向肽序列蛋白，該類蛋白的N端含有一個(gè)由信號(hào)肽和轉(zhuǎn)運(yùn)肽組成的靶向肽。在胞漿合成前體蛋白后，信號(hào)肽驅(qū)動(dòng)前體蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工，導(dǎo)致信號(hào)肽被切除，從而暴露轉(zhuǎn)運(yùn)肽，后者即可將前體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至頂質(zhì) 體[17-18]，轉(zhuǎn)運(yùn)肽被切除，前體蛋白成為成熟蛋白發(fā)揮功能[19]。由于TgCpn60蛋白N端具有靶向肽，其N(xiāo)端表達(dá)的蛋白不適于作為免疫原，因此本研究誘導(dǎo)表達(dá)了TgCpn60蛋白C末端的168個(gè)氨基酸殘基，以此作為免疫原免疫BALB/c小鼠，獲得了相應(yīng)的鼠多克隆抗體，說(shuō)明該片段具有強(qiáng)抗原性。再利用純化后的多克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其可識(shí)別內(nèi)源性TgCpn60蛋白且具有兩條明顯的反應(yīng)條帶，表明我們制備的多克隆抗體能夠特異性識(shí)別TgCpn60蛋白的前體蛋白和成熟蛋白兩種形式。

NADP+鐵氧化還原蛋白還原酶（ferredoxin-NADP+reductase，F(xiàn)NR）廣泛存在于三大類生命形式：真核生物、細(xì)菌和古生菌。Fd/FNR電子傳遞系統(tǒng)參與了多種關(guān)鍵的代謝過(guò)程，從光合作用和能量代謝到各種生物合成反應(yīng)[20]。含有頂質(zhì)體的頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)同樣擁有Fd和FNR兩種蛋白，兩者均定位于頂質(zhì)體中[21-23]。與TgCpn60相同，核編碼的TgFNR蛋白因其N(xiāo)端具有一個(gè)頂質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，這段轉(zhuǎn)導(dǎo)肽可介導(dǎo)TgFNR轉(zhuǎn)運(yùn)入頂質(zhì)體外腔膜，因而被認(rèn)為是頂質(zhì)體的標(biāo)志蛋白[24-25]。該蛋白雖然可以指示頂質(zhì)體的位置，由于定位于頂質(zhì)體外腔膜，無(wú)法反映頂質(zhì)體基質(zhì)的形態(tài)及大小變化，因此，為更精確地觀察頂質(zhì)體基質(zhì)動(dòng)態(tài)變化，本研究制備了TgCpn60抗體。為了進(jìn)一步明確本研究制備的多克隆抗體可以識(shí)別蟲(chóng)體內(nèi)的天然TgCpn60，我們以TgFNR蛋白為參照，通過(guò)瞬時(shí)電轉(zhuǎn)pFNR-RFP質(zhì)粒至蟲(chóng)體內(nèi)，并利用IFA技術(shù)檢測(cè)TgCpn60蛋白與TgFNR蛋白共定位情況，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白存在共定位現(xiàn)象，且與TgFNR蛋白發(fā)生共定位的為轉(zhuǎn)運(yùn)至頂質(zhì)體的TgCpn60蛋白，即TgCpn60成熟蛋白，而TgCpn60前體蛋白未進(jìn)入頂質(zhì)體，因此與TgFNR蛋白無(wú)共定位現(xiàn)象，兩種形式的TgCpn60蛋白都能夠被TgCpn60抗體所識(shí)別，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)本研究成功制備了鼠抗TgCpn60多克隆抗體。

質(zhì)體Cpn60同源物在多物種中的作用舉足輕重，具有多種生物學(xué)功能[8-11]。TgCpn60蛋白定位于頂質(zhì)體基質(zhì)腔，推測(cè)其在頂質(zhì)體穩(wěn)態(tài)中可能具有重要功能，該蛋白的其他生物學(xué)功能有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)獲得的可識(shí)別弓形蟲(chóng)內(nèi)源性TgCpn60蛋白的多克隆抗體，可作為頂質(zhì)體基質(zhì)的指示劑，用于評(píng)價(jià)、觀察頂質(zhì)體在世代遺傳過(guò)程中的形態(tài)變化，同時(shí)該抗體的獲得可為進(jìn)一步研究TgCpn60生物學(xué)功能提供必要的實(shí)驗(yàn)材料，也將有助于完善核編碼蛋白輸入頂質(zhì)體途徑。