馮夢婷，盛東萍，葉建仁，陳鳳毛，張曉陽，邱秀文1,＊

(1. 九江學(xué)院江西長江經(jīng)濟帶研究院，江西 九江 332005；2. 江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點實驗室，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037；3. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045)

松材線蟲病，即松樹枯萎?。╬ine wilt disease,PWD），是一種以松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）為病原的國際檢疫性林業(yè)病害[1-2]。松材線蟲病具有發(fā)病部位隱秘、發(fā)病速度快、傳播蔓延迅速、傳播途徑多、治理難度大等特點，因此該病害又被稱為松樹的“癌癥”[3]。我國于1982年在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲病[4]，隨后在我國逐漸蔓延，已經(jīng)造成了重大的經(jīng)濟損失并嚴重威脅著我國眾多名勝風(fēng)景區(qū)和松林生態(tài)系統(tǒng)安全。細胞色素P450（cytochrome p450, P450)，又稱單加氧酶，是一類由數(shù)量眾多、功能復(fù)雜的血紅素結(jié)合蛋白組成的同工酶，廣泛存在于細菌、真菌、動物和植物等生物體中[5]。細胞色素P450在內(nèi)源性化合物（脂肪酸、膽汁酸、類固醇、蛻皮激素和保幼激素等）和外源性化合物（農(nóng)藥、植物毒素和環(huán)境致癌物等）代謝過程中十分重要[6-8]。大量研究表明細胞色素P450基因參與代謝過程和抗性機制主要通過上調(diào)來實現(xiàn)。Maja等[9]研究發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲受到毒物質(zhì)侵害時，cyp-33D3基因表達量上調(diào)明顯。松材線蟲全基因組序列于2011年測序完成，為研究松材線蟲致病相關(guān)基因的功能奠定了良好的基礎(chǔ)[10]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲感染松樹后，cytochrome P450 33D3 (cyp-33D3) 基因表達量上調(diào)顯著，表明cyp-33D3基因在松材線蟲致病過程中發(fā)揮了重要作用[11]。目前關(guān)于cyp-33D3基因的研究主要集中在過量表達方面，而關(guān)于該基因的功能研究鮮見報道。

RNA干擾（RNA interference, RNAi）現(xiàn)象廣泛存在于真核生物細胞中，它通過小分子雙鏈RNA誘導(dǎo)同源mRNA降解從而阻斷體內(nèi)特定基因表達[12]。隨著RNA干擾機制被闡明，RNA干擾被認為是一種可以與基因敲除相媲美的技術(shù)，在基因功能、信號傳導(dǎo)通路和基因治療等研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[13-16]。本研究采用RNA干擾技術(shù)研究cyp-33D3基因沉默后對松材線蟲取食、繁殖和致病性的影響，闡明cyp-33D3基因在松材線蟲致病過程中的功能，為進一步明確松材線蟲分子致病機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試松材線蟲BxJJ01分離自江西省九江市的黑松疫木，并保存于九江學(xué)院植物基因資源重點實驗室。將松材線蟲接種至長滿灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar, PDA）平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)5 d，采用貝爾曼漏斗法分離線蟲，用無菌水清洗3次，1 500 r·min-1離心5 min。將離心得到的線蟲懸浮液儲存于1.5 mL離心管中，備用。

1.2 松材線蟲總RNA提取及cDNA的合成

根據(jù)RNA抽提試劑盒（天根生化科技有限公司）的使用說明書提取松材線蟲總RNA。利用紫外分光光度計（Nanodrop 2000）測定RNA濃度，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。根據(jù)TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime Script 1ststrand cDNA Synthesis Kit）使用說明書將松材線蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于后續(xù)PCR實驗。

1.3 松材線蟲cyp-33D3基因片段的克隆

依據(jù)GenBank上下載的cyp-33D3(GenBank:KM973212.2)基因序列設(shè)計上游引物cyp-33D3-F（5′-TCACCGACTACGAGGTCC-3′）和下游引物cyp-33D3-R（5′-ATGGGATGAACGACGAAC-3′），以合成的cDNA為模板進行PCR擴增。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 s，94℃變性30 s，60℃34 s，72℃1 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。根據(jù)Axygen公司的切膠回收試劑盒使用說明書對目標片段進行切膠回收，并克隆于PmdTM18-T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，委托華大基因公司進行測序。

1.4 松材線蟲cyp-33D3基因dsRNA的合成

以PmdTM18-T和pCH-sGFP載體為模板，通過帶有T7啟動子的引物進行PCR擴增，采用MEGAscript RNAi Kit Protocol 試劑盒（Life Technologies 公司）分別合成松材線蟲cyp-33D3和gfp基因dsRNA。用無RNA酶H2O適當(dāng)稀釋合成的dsRNA，通過紫外分光光度計測定A260值，同時測定溶解dsRNA相應(yīng)H2O的A260值作為空白值，dsRNA濃度（μg·mL–1）為260 nm的吸光值減去空白值后乘以稀釋倍數(shù)再乘以系數(shù)40。經(jīng)測定合成的cyp-33D3和gfp基因dsRNA濃度分別為1.45 mg·mL–1和1.53 mg·mL–1，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA完整性，將合成好的dsRNA儲存于–80℃冰箱，備用。

dsRNA濃度（μg·mL–1）=（A260-空白值） ×稀釋倍數(shù) × 40

1.5 松材線蟲cyp-33D3基因的RNA干擾

將收集的松材線蟲混合蟲態(tài)浸泡于1 μg·μL–1的cyp-33D3 dsRNA中[17]，以gfp dsRNA 作為非靶標性dsRNA對照，以ddH2O作為空白對照，每個處理約8 000條線蟲，每次試驗3次重復(fù)，將各處理置于25℃搖床170 r·min-148 h后[15-16]，用ddH2O洗脫線蟲。

分別挑取30對（成熟雄蟲和雌蟲各30條）干擾后和對照組的松材線蟲，接種至長有灰葡萄孢的PDA平板上，25℃條件下培養(yǎng)5 d，用貝爾曼漏斗法進行分離。拍照觀察各處理松材線蟲取食情況，用光學(xué)顯微鏡統(tǒng)計其數(shù)量，每個處理3次重復(fù)。

分別挑取20對（成熟雄蟲20條，懷孕雌蟲20條）干擾后和對照組的松材線蟲，置于直徑為30 mm的小培養(yǎng)皿上，加入適量ddH2O，25℃黑暗培養(yǎng)12 h后，輕輕倒掉線蟲懸浮液，用無菌水將粘附在培養(yǎng)皿底部的線蟲蟲卵洗出，收集松材線蟲卵粒并統(tǒng)計其數(shù)量，每個處理重復(fù)3次。

分別挑取100顆線蟲蟲卵浸泡在等量的ddH2O、gfp dsRNA和cyp-33D3 dsRNA溶液中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗條件下孵化48 h。使用倒置顯微鏡對已孵化卵的數(shù)量進行計數(shù)，每個處理重復(fù)3次。

分別挑取20對（成熟雄蟲和雌蟲各20條）干擾后和對照組的松材線蟲，接種至長有灰葡萄孢的PDA平板上進行交配和繁殖，從而得到子一代（F1）的老熟成蟲。將獲得的成蟲轉(zhuǎn)移至孔板并用高溫殺死，在光學(xué)顯微鏡下測量其個體長度，每個處理重復(fù)3次。

采用人工皮接法分別將ddH2O浸泡和cyp-33D3dsRNA干擾后含有2 000條松材線蟲的懸液接種到生長情況一致的兩年生黑松上，同時將等體積的gfpdsRNA溶液接種至黑松，每個處理接種6株。接種后觀察松樹的發(fā)病情況，持續(xù)觀察40 d，統(tǒng)計發(fā)病率。

1.6 松材線蟲cyp-33D3基因干擾效率的測定

分別提取對照組和干擾后子一代（F1）松材線蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，以松材線蟲Actin基因為內(nèi)參基因，根據(jù)TransStart Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）試劑盒說明書進行熒光定量PCR，測定松材線蟲cyp-33D3基因的表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 松材線蟲cyp-33D3基因的克隆

以松材線蟲cDNA為模板，用特異性引物擴增獲得細胞色素cyp-33D3基因，結(jié)果顯示擴增片段長度介于1 000～1 500 bp之間（圖1A），與預(yù)期大小1 192 bp相符?；厥漳康臈l帶與pMDTM19-T載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆進行測序驗證。通過帶有T7啟動子的特異性引物進行PCR擴增，合成dsRNA。從圖1B中可以看出，瓊脂糖凝膠電泳條帶單一、明亮、完整，可用于后續(xù)的RNA干擾實驗。

圖 1 松材線蟲細胞色素cyp-33D3基因的克?。ˋ）及雙鏈RNA的合成（B）Fig. 1 Clone of cyp-33D3 gene from B. xylophilus (A) and synthesis of double-stranded RNA (B)

2.2 干擾后松材線蟲cyp-33D3基因表達量分析

如圖2所示，松材線蟲經(jīng)gfpdsRNA和cyp-33D3dsRNA浸泡后，cyp-33D3基因的表達量分別為0.974和0.036（將ddH2O處理對照組的細胞色素cyp-33D3基因表達量設(shè)為1），說明外源dsRNA對松材線蟲細胞色素cyp-33D3基因表達量無影響，而cyp-33D3dsRNA可以有效抑制靶基因的表達。

2.3 松材線蟲cyp-33D3基因RNAi對線蟲取食的影響

從圖3可以看出，ddH2O和gfpdsRNA處理的線蟲取食速度明顯較快，在第5天已經(jīng)幾乎將灰葡萄孢菌絲取食殆盡，而cyp-33D3dsRNA處理松材線蟲取食灰葡萄孢的面積較小，說明細胞色素cyp-33D3基因表達沉默后對松材線蟲的取食有重要影響。

圖 2 RNAi后松材線蟲cyp-33D3基因表達分析Fig. 2 The analysis of expression of cyp-33D3 gene following RNAi of B. xylophilus

圖 3 RNAi對松材線蟲取食的影響Fig. 3 Effects of RNAi on feeding of B. xylophilus

2.4 松材線蟲cyp-33D3基因RNAi對線蟲個體體長的影響

經(jīng)測量，ddH2O處理雌、雄成蟲的體長分別為964.33 μm和777.12 μm；gfpdsRNA處理雌、雄成蟲的體長分別為951.66 μm和775.34 μm；cyp--33D3dsRNA處理雌、雄成蟲的體長分別為942.57 μm和761.33 μm（圖4）。RNA干擾后雌、雄成蟲的體長有所減短，但差異不顯著（P＞ 0.05）。因此，我們推測RNA干擾對松材線蟲體長無明顯影響。

2.5 松材線蟲cyp-33D3基因RNAi對線蟲產(chǎn)卵的影響

由圖5可知，ddH2O和gfpdsRNA處理的每條雌蟲平均產(chǎn)卵數(shù)量分別為24和23粒，而cyp-33D3dsRNA處理中每條雌蟲平均產(chǎn)卵數(shù)量為12粒。結(jié)果表明，cyp-33D3dsRNA干擾顯著（P＜0.01）減少了雌蟲的產(chǎn)卵數(shù)量，降低了松材線蟲的繁殖能力。

圖 4 RNAi對松材線蟲成蟲個體體長的影響Fig. 4 Effects of RNAi on individual body length of adult B. xylophilus

圖 5 RNAi對松材線蟲產(chǎn)卵的影響Fig. 5 Effects of RNAi on oviposition of B. xylophilus

2.6 松材線蟲cyp-33D3基因RNAi對線蟲孵化率的影響

不同處理的松材線蟲卵孵化率如圖6所示，cyp-33D3dsRNA處理的蟲卵孵化率為49.67%，與ddH2O處理相比差異顯著（P＜ 0.01）；而gfpdsRNA處理和ddH2O處理的蟲卵孵化率無明顯差異（P＞0.05）。由此可見，cyp-33D3dsRNA干擾對松材線蟲卵孵化具有一定的抑制作用，而非內(nèi)源雙鏈RNA干擾對其無影響。

2.7 松材線蟲cyp-33D3基因RNAi對線蟲致病力的影響

在接種40 d后，ddH2O處理的黑松針葉全部枯萎，發(fā)病率達到100%；cyp-33D3dsRNA處理的黑松發(fā)病率為43.1%；而gfpdsRNA處理的黑松在整個實驗過程中生長狀況良好，發(fā)病率為零（圖7）。據(jù)此推測，RNA干擾在一定程度上減弱了松材線蟲的致病能力，進而降低了黑松的發(fā)病率。

圖 6 RNAi對松材線蟲孵化率的影響Fig. 6 Effects of RNAi on percentage hatch of B. xylophilus

圖 7 不同接種處理后第40天黑松的發(fā)病狀況Fig. 7 Wilting symptoms of P. thunbergii after different inoculation treatments at 40 days

3 討論

由于松材線蟲的生活史和寄生環(huán)境與其他線蟲差別很大，致使其分子致病機制研究進展緩慢。Kikuchi等人于2011年完成了松材線蟲全基因組測序，這為進一步研究松材線蟲致病基因的功能奠定了良好的基礎(chǔ)。松材線蟲感染寄主后，寄主會分泌一系列的次級代謝產(chǎn)物抵御松材線蟲的入侵。有研究表明，CYP450基因產(chǎn)物是松材線蟲代謝寄主松樹次級代謝產(chǎn)物第一階段最重要的酶。我們的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在松材線蟲入侵寄主后cyp-33D3基因表達量上調(diào)顯著，說明該基因在松材線蟲致病過程中發(fā)揮了重要作用。

RNA干擾是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA引發(fā)的廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后沉默的過程。RNA干擾具有特異、有效的基因沉默效應(yīng)，克服了建立基因敲除動物模型費時費力的缺點，已成為研究基因功能非常有效的手段。Wang等[18]通過RNA干擾技術(shù)研究松材線蟲精氨酸激酶（BxAK1）基因的功能，發(fā)現(xiàn)該基因表達量下調(diào)增加了線蟲的死亡率，同時減弱了線蟲的繁殖能力。Kang等[19]通過該方法對松材線蟲毒液過敏原樣蛋白（BxVap-1）基因進行RNA干擾，結(jié)果表明毒液過敏原樣蛋白基因與線蟲的遷移能力有密切聯(lián)系。魏麗莎子等[20]利用RNA干擾技術(shù)對象耳豆根結(jié)線蟲二齡幼蟲Me-mapk1基因進行沉默，線蟲誘導(dǎo)番茄根結(jié)形成的數(shù)量顯著減少，推測Memapk1基因的下調(diào)表達有可能與象耳豆根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）的生長發(fā)育相關(guān)。以上研究表明，RNA干擾是一種研究基因功能的有效技術(shù)。細胞色素P450作為線蟲體內(nèi)三大與代謝抗性相關(guān)的超基因家族之一，對松材線蟲生長發(fā)育和致病性起到至關(guān)重要的作用。Benenati 等[21]通過RNA干擾技術(shù)研究了秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）cyp-31A2和cyp-31A3基因的功能，發(fā)現(xiàn)這兩個基因表達量下調(diào)導(dǎo)致線蟲胚胎細胞不能正確執(zhí)行減數(shù)分裂以及卵殼形成所需的脂質(zhì)物質(zhì)合成受阻。Verma等[22]研究表明，cyp5122A1基因表達量下降增加了杜氏利什曼蟲（Leishmania donovani）的死亡率，降低了利什曼蟲對藥物的敏感性和減少了麥角固醇的合成。本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默了松材線蟲cyp-33D3基因，發(fā)現(xiàn)cyp-33D3基因下調(diào)表達后，松材線蟲取食速率降低，繁殖能力下降。這可能是由于cyp-33D3基因沉默后影響了松材線蟲胚胎細胞減數(shù)分裂的正確執(zhí)行，抑制了卵殼形成所需脂質(zhì)物質(zhì)的合成以及增加了線蟲的死亡率，導(dǎo)致線蟲繁殖數(shù)量下降，進而影響了松材線蟲的取食速度。

植物寄生線蟲致病的前提是能夠在寄主體內(nèi)存活和進行繁殖。我們將cyp-33D3 dsRNA干擾后的松材線蟲接種至黑松苗上，發(fā)現(xiàn)線蟲的致病能力明顯下降，推測原因可能是：（1）cyp-33D3基因表達沉默后，松材線蟲在松樹體內(nèi)的取食和產(chǎn)卵受到影響，進而降低了線蟲的繁殖數(shù)量，導(dǎo)致其致病力下降；（2）松材線蟲入侵寄主后，松樹會分泌出大量的次生代謝產(chǎn)物抵御松材線蟲的入侵，松材線蟲為了應(yīng)對這些次生代謝產(chǎn)物的毒害作用，必須通過解毒基因?qū)υ擃愇镔|(zhì)進行代謝轉(zhuǎn)化，由于CYP450基因在松材線蟲解毒過程中具有重要作用，因此cyp-33D3基因被表達被沉默后，可能致使松材線蟲不能有效降解寄主分泌的有毒次生代謝產(chǎn)物，大量線蟲被殺死，最終導(dǎo)致松材線蟲的致病力下降。我們的研究結(jié)果表明cyp-33D3基因與松材線蟲的取食、繁殖和致病力密切相關(guān)，為揭示松材線蟲cyp-33D3基因的功能提供了理論依據(jù)，對科學(xué)指導(dǎo)松材線蟲病生物防治具有重要的理論和實踐意義。然而，關(guān)于cyp-33D3基因?qū)λ刹木€蟲卵殼形成和致病力的具體調(diào)控機理還不清楚，還有待于進一步深入研究。

4 結(jié)論

通過RNA干擾技術(shù)對松材線蟲cyp-33D3基因功能進行了研究，發(fā)現(xiàn)cyp-33D3dsRNA 干擾可以有效抑制cyp-33D3基因的表達，cyp-33D3基因干擾后降低了松材線蟲的取食速度，每條線蟲的產(chǎn)卵數(shù)量以及蟲卵的孵化率都下降顯著（P ＜ 0.01）。然而，cyp-33D3基因干擾對松材線蟲個體體長影響較小。cyp-33D3基因干擾減弱了松材線蟲的致病能力，降低了黑松的發(fā)病率。本研究不僅為闡明松材線蟲cyp-33D3基因的功能提供了數(shù)據(jù)支撐，而且為研究松材線蟲其他基因的功能提供了參考。