劉 彬，劉青華＊，周志春，羅 檸，解懿妮，陳獻(xiàn)志

(1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311400；

2. 浙江省臨海市自然資源和規(guī)劃局，浙江 臨海 317000)

馬尾松（Pinus massonianaLamb.）為松科（Pinaceae）松屬（PinusL.）常綠喬木，速生、耐旱，廣泛分布于我國(guó)亞熱帶地區(qū)，是我國(guó)速生豐產(chǎn)用材林和脂用林的先鋒樹(shù)種[1]。然而，馬尾松也經(jīng)受著多種病蟲害的侵襲，以松材線蟲病最為嚴(yán)重。松材線蟲病是一種由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus（Steiner et Buhrer）Nickle; PWN）引起的毀滅性森林病害[2]，由于其致病力強(qiáng)，傳播速度快，導(dǎo)致全國(guó)馬尾松出現(xiàn)大面積死亡，截止到2018年，松材線蟲病已蔓延至18個(gè)省，超過(guò)500萬(wàn)m3馬尾松林被松材線蟲侵襲[3]，生態(tài)系統(tǒng)遭到嚴(yán)重破壞，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[4]。

萜類化合物是植物主要的次生代謝物質(zhì)，釋放萜烯類化合物是植物應(yīng)對(duì)多種生物與非生物脅迫最重要的防御措施之一[5]。松脂作為針葉樹(shù)種的主要防御物質(zhì)，包含100多種單萜、倍半萜和二萜[6-8]，是針葉樹(shù)種抵御植食性昆蟲和病原體的重要屏障[9]。昆蟲脅迫或機(jī)械損傷會(huì)激活植物合成大量的烯萜類化合物，阻止病原體入侵或趨避入侵的昆蟲，從而起到物理防御以及化學(xué)防御作用[10-12]。已有研究表明，當(dāng)云杉大墨天牛（Monochamus urussovi）入侵魚鱗云杉（Picea jezoensisCarr）時(shí)，導(dǎo)致其烯萜類化合物如α-蒎烯、3-蒈烯、β-蒎烯、異檸檬烯等含量顯著上升[13]。華山松（P. armandiiFranch.）的β-蒎烯含量較高，受到華山松大小蠹（Dendroctonus armandi）入侵后，β-蒎烯的含量明顯上升[14]，表明β-蒎烯可能參與華山松抵御大小蠹的脅迫過(guò)程。當(dāng)大冷杉（Abies grandisCraib）遭遇樹(shù)皮甲蟲侵食時(shí)，可誘導(dǎo)萜類化合物特別是β-蒎烯積累量增加[15]。此外，在油松（P. tabulaeformisCarr.）、白皮松（P. bungeanaZucc. et Endi）、雪松（Cedrus deodara(Roxburgh) G. Don）、金邊龍柏（Sabina chinensis(L.) Ant. cv. Aurea）、紅皮云杉（P. koraiensisNakai）的揮發(fā)性物質(zhì)中，β-蒎烯為主要成分，具有明顯的抑菌作用[16]。

馬尾松為重要的脂用樹(shù)種，富含大量松脂。其中單萜化合物為松脂的主要成分，可以作為植保素對(duì)松材線蟲的入侵起到直接防御作用。作為馬尾松松脂的重要組成部分，α-蒎烯與β-蒎烯含量變化可直接影響松材線蟲的種群數(shù)量，受損傷的松樹(shù)體內(nèi)α-蒎烯與β-蒎烯含量均高于健康株系[17-19]。也有相關(guān)研究表明，α-蒎烯濃度與松材線蟲死亡率呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)[20]；而β-蒎烯的抑菌作用高于α-蒎烯，β-蒎烯可通過(guò)影響受傷樹(shù)體的真菌藍(lán)變使松材線蟲種群密度減小[21]。賈洪敏等認(rèn)為，馬尾松松脂中單萜類物質(zhì)β-蒎烯、香葉烯、檸檬烯等可能與寄主抗性存在相關(guān)性[22]。在松材線蟲入侵后，高抗馬尾松中的β-蒎烯含量顯著高于易感馬尾松[23]。此外，α-蒎烯與β-蒎烯的比例可影響松材線蟲及其伴生菌的繁殖能力。Niu等[24]發(fā)現(xiàn)，α-蒎烯和β-蒎烯的濃度比例可以影響松材線蟲的繁殖力，且較低濃度的單萜化合物可能抑制松材線蟲繁殖力。

單萜合酶可以通過(guò)催化底物牻牛兒基焦磷酸（GPP）合成單萜類物質(zhì)，可直接或間接決定萜類化合物的含量以及多樣性。在受到食草動(dòng)物取食后的陸地棉（Gossypium hirsutumLinn.）中，β/α蒎烯合酶GhTPS2表達(dá)量顯著上調(diào)，可參與植物的抗病過(guò)程[25]。病蟲害取食或機(jī)械損傷阿拉斯加云杉（P. sitchensis(Bong.) Carrière）可誘導(dǎo)創(chuàng)傷型樹(shù)脂道發(fā)育，促進(jìn)單萜合酶基因PsTPS2表達(dá)量上調(diào)，PsTPS2可催化α蒎烯和β-蒎烯合成[11]。單萜合酶基因在針葉樹(shù)種的防御過(guò)程中極為重要[26]，而在馬尾松中萜類相關(guān)基因的研究較少，目前僅有馬尾松α-蒎烯合酶基因被克隆。本課題組前期高抗與易感馬尾松二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，β-蒎烯合酶基因?yàn)楦呖柜R尾松差異表達(dá)基因[27]，然而，由于缺乏基因的全長(zhǎng)序列，限制了對(duì)β-蒎烯合酶基因的進(jìn)一步研究。

本研究基于前期研究基礎(chǔ)，結(jié)合馬尾松三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，首次克隆獲得PmPinScDNA全長(zhǎng)序列，分析該基因的理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育以及接種松材線蟲后在高抗和易感馬尾松中的表達(dá)特征，并探究其產(chǎn)物對(duì)松材線蟲的抑制作用，為解析馬尾松抗病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)自安徽省林業(yè)科學(xué)研究院馬尾松無(wú)性系試驗(yàn)林。根據(jù)前期該院對(duì)試驗(yàn)林內(nèi)無(wú)性系測(cè)定的松材線蟲病抗性指數(shù)，選擇高抗無(wú)性系‘休寧-5′（抗性指數(shù)4級(jí)）、易感無(wú)性系‘黃山-1’（抗性指數(shù)1級(jí)）各6株，各無(wú)性系均為4年生植株，生長(zhǎng)狀況良好。松材線蟲試驗(yàn)林設(shè)在安徽省林業(yè)科學(xué)研究院苗圃，位于安徽省合肥市（31°51′ N，117°10′ E），屬于亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，年平均氣溫15.7℃，年平均日照時(shí)數(shù)2 100 h，年平均降水量1 000 mm，全年無(wú)霜期228 d，四季分明，自然條件優(yōu)越。供試松材線蟲為高致病性株系‘廣株3B’ 和‘全4’混合株系，于灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）菌落上純培養(yǎng)，保存于4°C冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 松材線蟲培養(yǎng) 將灰葡萄孢接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中，于28℃霉菌培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)5 d。待白色菌落生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿上蓋處，將純化好的高致病性松材線蟲接種到灰葡萄孢菌落內(nèi)，于28℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)約9 d，使菌落被松材線蟲完全取食。進(jìn)一步用貝爾曼漏斗法分離松材線蟲，12 h后收集于10 mL離心管中，300 r·min-1離心5 min，去除上清液。將各離心管中的松材線蟲匯集并混勻，最終制備成每微升含50條松材線蟲的懸濁液[17]。

1.2.2 松材線蟲接種 于2017年7月，天氣較晴好，氣溫維持在30℃以上，選擇3株高抗和易感植株接種松材線蟲，每株選擇不同方向的5個(gè)枝條，每個(gè)枝條至少包含3個(gè)當(dāng)年生嫩枝，在枝條的底端采用剝皮接種法：在選出的枝條底端一側(cè)割開(kāi)長(zhǎng)約5 cm的切口，剝皮時(shí)注意不能剝得太深，輕輕割入木質(zhì)部即可，也不要使樹(shù)皮脫落，且用小鋸在切口上刮齒痕，以模擬天牛的咬食痕，同時(shí)防止松材線蟲溶液流出切面。將線蟲懸浮液均勻注入切口處，接種量為含有10 000頭線蟲的200 μL松材線蟲混濁液，對(duì)另外3株高抗和易感植株注入等量的蒸餾水作為對(duì)照。為保證線蟲成活，將切開(kāi)的樹(shù)皮小心覆在傷口處。

1.2.3 樣品采集 所取樣品包括高抗馬尾松和易感馬尾松2種基因型，接種松材線蟲和接種蒸餾水2種處理，接種后1、15、30 d和2 a 4個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取樣部位為高抗與易感馬尾松接種點(diǎn)上部5 cm處側(cè)枝和接種2 a后可檢測(cè)出松材線蟲且生長(zhǎng)狀況良好的高抗馬尾松根、莖、葉。取樣后迅速用錫箔紙包好，做好標(biāo)記后立即放入液氮中，實(shí)驗(yàn)室保存于-80℃冰箱用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 PmPinS基因的克隆

取馬尾松高抗和易感無(wú)性系莖部組織立即放入液氮中速凍，研磨后利用RN38 EASY spin plus植物RNA快速提取試劑盒提取RNA。經(jīng)SuperScript? III First-Strand Synthesis System反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。根據(jù)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中的PmPinS序列設(shè)計(jì)引物PmPinS-F（5′-AT GGATTTAATATCTGTCTTACCG-3′）和PmPinS-R（5′-TTATAAAGGCACAGGTTCAAG-3′），分別以高抗和易感馬尾松cDNA為模板利用MCLAB高保真酶（Tsingke）擴(kuò)增PmPinS的全長(zhǎng)編碼區(qū)序列。PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：25 μL I-5? 2×High-Fidelity Master Mix，2 μLPmPinS-F (10 μmol·L-1)，2 μLPmPinS-R (10 μmol·L-1)，1 μL cDNA模板，20 μL ddH2O，反應(yīng)程序?yàn)?8℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收，與pClone007 Blunt Vector（Tsingke）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株，獲得陽(yáng)性克隆后測(cè)序。

1.4 PmPinS基因的生物信息學(xué)分析

利用ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析目的基因cDNA序列的開(kāi)放閱讀框，并在blastx（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上對(duì)預(yù)測(cè)到的ORF序列和氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析和序列鑒定。用ClustalX對(duì)高抗和易感馬尾松PmPinS的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)[28]。利用ExPASyProtParam（http://expasy.org/tools/pi_tool.html）預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)；SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，ITASSER v4.3對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)[29]；用ChloroP（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）預(yù)測(cè)葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。

利用ClustalX軟件對(duì)PmPinS及其它物種的萜類合酶蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)。用MEGA 5軟件[30]以最大似然法中的JTT模型進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，bootstrap值設(shè)為1 000。

1.5 PmPinS對(duì)松材線蟲侵染的響應(yīng)分析

分別提取高抗和易感馬尾松在松材線蟲侵染后1、15、30 d的莖部組織RNA，合成cDNA第一鏈。利用Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0)設(shè)計(jì)PmPinS實(shí)時(shí)定量PCR引物PmPinSRT-F（5′-ACCGTTGCATCTGATGATGA-3′）和PmPinS-RT-R（5′-ACGTTCACGGTAAGCGAGTT-3′）。以馬尾松Actin（transcription elongation factor 1）基因?yàn)閮?nèi)參[31]，利用SYBR Premix Ex Taq（Takara）和QuantStudio 7熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。利用2-ΔΔCT方法計(jì)算PmPinS基因的相對(duì)表達(dá)量。用單因素方差分析計(jì)算不同組織中基因表達(dá)量的顯著性差異，P ＜ 0.05用*標(biāo)記，P ＜ 0.01用**標(biāo)記。

1.6 單萜類化合物對(duì)松材線蟲的影響

從高抗馬尾松樹(shù)體內(nèi)分離出有活性的松材線蟲，接種于長(zhǎng)滿灰葡萄球菌的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過(guò)Bellman分離法[32]將分離出的松材線蟲分裝于2 mL離心管中，配制成1 mL含有200條松材線蟲的懸濁液。將α-蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品（純度為97%）和β-蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98%）及其混合溶液以一定的濃度梯度分別施加于松材線蟲（表1），25℃條件下培養(yǎng)24 h[33]。以施加TritonX-100作為對(duì)照，3次技術(shù)重復(fù)。選取以上萜類物質(zhì)處理后0.5、6、24 h為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，利用ZEISS Imager A2光學(xué)顯微鏡（蔡司公司）觀察其活性并計(jì)算數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PmPinS基因的克隆及理化性質(zhì)分析

以馬尾松莖部cDNA為模板，擴(kuò)增得到PmPinS基因序列（圖1）。PmPinS的全長(zhǎng)編碼區(qū)為1 878 bp，ORF Finder分析顯示其完整開(kāi)放閱讀框?yàn)? 878 bp，編碼625個(gè)氨基酸（Genbank登錄號(hào)：MT019965），PmPinS蛋白質(zhì)分子式為C3201H4977N865O957S33，分子量為71.95 kD，等電點(diǎn)（pI）為5.74。對(duì)PmPinS氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其含有單萜合酶典型的N末端保守結(jié)構(gòu)域和C末端保守結(jié)構(gòu)域。N末端保守結(jié)構(gòu)域中包括質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和RR(X)8W保守基序，其中，RR(X)8W主要負(fù)責(zé)催化異構(gòu)化-環(huán)化反應(yīng)[34]。C末端保守結(jié)構(gòu)域包括DDXXD和NSE/DTE保守基序，DDXXD參與二價(jià)金屬離子和水分子的結(jié)合，維持活性位點(diǎn)的穩(wěn)定[35]。對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，PmPinS中共有400個(gè)氨基酸（64.00%）參與形成α-螺旋，20個(gè)氨基酸（3.20%）參與形成延伸鏈，19個(gè)氨基酸（3.04%）參與形成β-轉(zhuǎn)角，186個(gè)氨基酸（29.76）參與形成無(wú)規(guī)則卷曲，表明PmPinS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲為主（圖2）。

表 1 體外施加松材線蟲萜類化合物濃度梯度 Table 1 Volatiles treated on the B. xylophilu in vitro

圖 1 馬尾松PmPinS基因擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification of PmPinS

圖 2 PmPinS氨基酸序列分析Fig. 2 The sequence analysis of PmPinS

2.2 PmPinS多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用ClustalX將馬尾松PmPinS與扭葉松（P.contortaDouglas ex Loudon）、北美云杉（P.pungensEngelm）、歐洲云杉（P. abies(Linn.) H.Karsten）的同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與PsPinS、PaPinS、PcPinS具有相似的保守結(jié)構(gòu)域，均包含RR(X)8W、DDXXD和NSE/DTE保守基序（圖3），與PcPinS序列相似性達(dá)93.16%。馬尾松PmPinS與已報(bào)道的馬尾松α-蒎烯合成酶（AGW25369）蛋白序列相似性為73.85%。推測(cè)PmPinS蛋白可能與β-蒎烯合酶功能相似，參與植物合成β-蒎烯的生物合成途徑。

為進(jìn)一步對(duì)PmPinS進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，選取北美云杉、挪威云杉（P. excelsa(Lam.) Link）、銀杏（Ginkgo bilobaLinn.）等裸子植物的TPS蛋白序列與PmPinS共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）。進(jìn)化分析結(jié)果表明：PmPinS位于馬尾松TPS-d1亞家族，負(fù)責(zé)裸子植物單萜生物合成，與北美云杉β-蒎烯合酶處于同一分支。據(jù)此可以推斷，PmPinS為單萜合酶，可能參與β-蒎烯的生物合成。

2.3 PmPinS對(duì)松材線蟲侵染的響應(yīng)

圖 3 PmPinS氨基酸序列比對(duì)分析Fig. 3 The sequence alignment of PmPinS

圖 4 PmPinS系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 4 Phylogentic analysis of PmPinS

圖 5 松材線蟲接種后高抗和易感馬尾松PmPinS表達(dá)模式Fig. 5 Relative expression levels of PmPinS in resistant and susceptible P. massoniana inoculated B. xylophilus

為解析高抗和易感馬尾松蒎烯合酶對(duì)松材線蟲侵染的響應(yīng)，對(duì)松材線蟲侵染1、15、30 d的高抗和易感馬尾松中的PmPinS表達(dá)模式進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析（圖5）。從表達(dá)趨勢(shì)上分析，相對(duì)于接種蒸餾水的陰性對(duì)照，高抗和易感馬尾松的PmPinS表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式。高抗馬尾松中，PmPinS在松材線蟲接種后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，接種后30 d時(shí)基因表達(dá)量為對(duì)照的3倍左右。截然相反的是，在易感馬尾松中，PmPinS只在接種松材線蟲1 d后檢測(cè)到表達(dá)量，且只為對(duì)照的0.4倍。從表達(dá)量上分析，在陰性對(duì)照中高抗和易感馬尾松PmPinS基因表達(dá)量相近，接種松材線蟲后，高抗馬尾松中的PmPinS顯著高于易感馬尾松PmPinS。

鑒于PmPinS在高抗馬尾松中的顯著高表達(dá)，作者延長(zhǎng)接種后采樣的時(shí)間節(jié)點(diǎn)。從接種松材線蟲2 a體內(nèi)攜帶松材線蟲且正常生長(zhǎng)發(fā)育的高抗馬尾松的根、莖、葉中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄之后進(jìn)行qRT-PCR，以接種蒸餾水的高抗馬尾松作為對(duì)照，探究PmPinS在高抗馬尾松不同組織中的表達(dá)模式。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，PmPinS在接種后的高抗馬尾松莖中的表達(dá)量特異性顯著上調(diào)（圖6）。由此可以初步得出：PmPinS在接種后的高抗馬尾松中的表達(dá)量顯著高于易感馬尾松，且在高抗馬尾松莖部組織特異性高表達(dá)，從而可進(jìn)一步驗(yàn)證PmPinS在馬尾松對(duì)松材線蟲的防御過(guò)程中起正向調(diào)控的作用。松材線蟲主要通過(guò)松墨天牛取食馬尾松莖入侵樹(shù)體，馬尾松莖部組織是合成富含萜類化合物的松脂的主要場(chǎng)所，而松脂是馬尾松重要的次生代謝物，同時(shí)也是重要防御物質(zhì)。因此，PmPinS編碼的蛋白為β-蒎烯合酶，其表達(dá)量在高抗馬尾松莖中顯著上調(diào)表明該基因可能參與萜類化合物的合成，從而使松脂中萜類含量增加，進(jìn)而有助于高抗馬尾松對(duì)松材線蟲的防御過(guò)程。

圖 6 接種2 a后高抗馬尾松不同組織PmPinS相對(duì)表達(dá)量分析Fig. 6 Analysis of relative expression of PmPinS in resistant P. massoniana after inoculated with PWN over 2 years

圖 7 單萜類化合物對(duì)松材線蟲的抑制作用Fig. 7 The inhibition of monoterpenes on PWN

2.4 萜類化合物對(duì)松材線蟲的抑制作用

經(jīng)多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定，PmPinS為β-蒎烯合酶，可能參與松脂中α-蒎烯或β-蒎烯等單萜類化合物的合成。為檢測(cè)松脂中主要萜類化合物對(duì)松材線蟲的抑制作用，以馬尾松松脂化學(xué)組分的主要單萜類化合物組成和含量為參考[36]，其中，馬尾松松脂中α-蒎烯的平均含量約為170～200 mg·g-1，β-蒎烯平均含量約為5.0～13 mg·g-1。因此，本研究設(shè)置不同濃度梯度的稀釋液外源施加于體外培養(yǎng)的松材線蟲（表1），以探究單萜類化合物對(duì)松材線蟲的抑制作用。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，在α-蒎烯和β-蒎烯的單一溶液中，隨著化合物濃度和處理時(shí)間的增加，松材線蟲的平均存活率顯著降低（圖7）。α-蒎烯處理：濃度為500 mg·g-1處理0.5 h和濃度為150 mg·g-1處理24 h，松材線蟲存活率幾乎為零；β-蒎烯處理：實(shí)驗(yàn)組任意濃度處理0.5 h和6 h時(shí)，松材線蟲平均存活率可被抑制50.00%，處理24 h時(shí)其抑制率可達(dá)90.00%（圖7）。萜類化合物混合溶液對(duì)松材線蟲的抑制作用顯著高于單一溶液。低濃度的混合溶液處理6 h后，松材線蟲存活率幾乎為零（圖7）。因此，初步得出結(jié)論：作為馬尾松松脂的主要成分，α-蒎烯和β蒎烯可抑制松材線蟲存活率。

3 討論

萜類化合物是生態(tài)系統(tǒng)中重要的次生代謝產(chǎn)物[37]，可介導(dǎo)植物與植物之間、植物與微生物之間以及植物與動(dòng)物之間的相互作用，協(xié)調(diào)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展[38]。此外，萜類化合物還可以作為植物防御劑來(lái)增強(qiáng)生態(tài)系統(tǒng)功能，協(xié)調(diào)相鄰植物、動(dòng)物和微生物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖[39]以及植物種群的形成和進(jìn)化[40]。

據(jù)報(bào)道，植物萜類化合物能夠抑制細(xì)菌、真菌和病毒的感染[41]，且植物萜類各組分在抗菌方面具有協(xié)同作用[42]。油松、紅皮云杉中萜類化合物對(duì)細(xì)菌、真菌和放線菌生長(zhǎng)影響的微生物實(shí)驗(yàn)表明，松脂、松果提取物為50 mg·mL-1時(shí)可抑制放線菌生長(zhǎng)，雪松提取物濃度為200 mg·mL-1時(shí)可抑制細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng)，表明針葉樹(shù)種萜類化合物對(duì)微生物具有抑制作用。油松、白皮松、金邊龍柏中含有較高濃度的β-蒎烯，被認(rèn)為是空氣微生物傳播的關(guān)鍵抑制劑，紅皮云杉和雪松中含有較少的β-蒎烯，對(duì)微生物的抑制作用較小[16]。因此，β-蒎烯在抑菌過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，也有研究表明，萜類化合物也可能作為植食性昆蟲的引誘劑，且可以影響其覓食、產(chǎn)卵、尋找寄主等行為[43]。單萜化合物是馬尾松松脂的重要化學(xué)組分，可以作為植保素對(duì)植食性昆蟲的入侵起到直接防御作用[44]。α-蒎烯與β-蒎烯含量變化可直接導(dǎo)致松材線蟲種群數(shù)量的增加，使其更容易進(jìn)入寄主體內(nèi)，且受損傷的松樹(shù)體內(nèi)α-蒎烯與β-蒎烯含量均高于健康株系[45-46]。也有相關(guān)研究表明，α-蒎烯濃度與松材線蟲死亡率呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)[47]；而β-蒎烯的抑菌作用高于α-蒎烯，β-蒎烯可通過(guò)影響受傷樹(shù)體的真菌藍(lán)變使松材線蟲種群密度減小[48]。因此，β-蒎烯在針葉樹(shù)種抵御病原體入侵過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

萜類合酶是萜類化合物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，植物的萜類合酶可劃分為7個(gè)家族，即TPS-a-g?；诎被嵝蛄械南到y(tǒng)發(fā)育分析，TPS-d家族為裸子植物萜類合酶所特有，其中，單萜合酶（mono-TPS）、倍半萜合酶（sesqui-TPS）、二萜合酶（di-TPS）各聚為一個(gè)亞家族，分別為TPS-d1、TPS-d2、TPS-d3[49]。本研究克隆得到的β-蒎烯合酶基因，通過(guò)多序列以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，鑒定為TPS-d1亞家族成員，符合單萜合酶的典型結(jié)構(gòu)特征。在針葉樹(shù)種中，單萜合酶最適反應(yīng)條件為堿性, 且其酶活性催化需要金屬離子輔助[44]。裸子植物中的單萜合酶包含α和β結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)以及I類活性位點(diǎn)，在金屬離子的輔助下, 從而將GPP轉(zhuǎn)換成環(huán)狀或非環(huán)狀單萜[17,50]。裸子植物中不同的TPS基因序列的保守性高約為70%[51]，本研究獲得的β-蒎烯合酶基因，與馬尾松α-蒎烯合酶基因同源性為73.85%，與扭葉松β-蒎烯合酶基因同源性高達(dá)93.16%。

目前，已有20多種單萜合酶基因在針葉樹(shù)中報(bào)道[52]，而萜類合酶基因在參與各種生物與非生物脅迫方面的研究仍然較少。在被子植物中，也只有較少的研究表明食草性昆蟲可誘導(dǎo)與防御相關(guān)的TPS基因表達(dá)[53]。玉米（Zea maysL.）中倍半萜烯合酶基因的表達(dá)受甜菜夜蛾幼蟲（Spodoptera exiguaHuebner.）的攝食所誘導(dǎo)[54]。擬南芥中的白菜蝶（Pieris rapaeLinne.）幼蟲的取食導(dǎo)致AtTPS10基因的轉(zhuǎn)錄水平升高[55]，在玉米和花生的2個(gè)植物系統(tǒng)中，誘導(dǎo)的TPS基因表達(dá)均導(dǎo)致胡萜類化合物大量累積，間接參與防御過(guò)程[56-57]。在受蟲害侵食的大陸棉中，GhTPS1與GhTPS2表達(dá)量上調(diào)[25]。在針葉樹(shù)種中，有關(guān)TPS基因在針葉樹(shù)中表達(dá)以應(yīng)對(duì)昆蟲襲擊的報(bào)道甚少。Hall等鑒定了扭葉松和樟子松（P. sylvestrisLinn.）中的α-蒎烯合酶以及β-蒎烯合酶基因及其功能[54]。大冷杉、挪威云杉和北美云杉受到機(jī)械損傷、MeJA處理或生物脅迫時(shí)，單萜合酶基因明顯上調(diào)[58]。在受到象鼻蟲（Pissodes strobePeck.）入侵的北美云杉中，單萜合酶基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)[11]。海岸松（P.pinasterAiton）及意大利松（P. pineaL.）受到松材線蟲侵染時(shí)，（-）-蒎烯合酶基因顯著上調(diào)[35]。阿拉斯加云杉受到昆蟲取食后，其（-）-蒎烯合酶基因PsTPS2表達(dá)量顯著上調(diào)。通過(guò)對(duì)PsTPS2進(jìn)行功能研究發(fā)現(xiàn)，PsTPS2可催化合成α-蒎烯與β-蒎烯，二者含量比例為35∶10，與在大冷杉中（-）-蒎烯合酶基因酶活產(chǎn)物（主要產(chǎn)物為α-蒎烯與β-蒎烯）相似，但比例（40∶60）略有差異[18]。α-蒎烯與β-蒎烯為阿拉斯加云杉松脂主要成分，在受到象鼻蟲取食2 a后，木質(zhì)部中的α-蒎烯含量增加了3倍，β-蒎烯含量增加了2.3～6.3倍[11]。經(jīng)MeJA處理的挪威云杉和鉆傷的白云杉（P. glauca(Moench)Voss）中，α-蒎烯與β-蒎烯也可在莖中大量積累，與莖中的單萜合酶基因表達(dá)量上調(diào)相呼應(yīng)[59]。同時(shí)表明，單一酶可同時(shí)形成2種或多種產(chǎn)物。鑒于針葉樹(shù)種單萜TPS合酶基因家族各成員之間的高度序列相關(guān)性，作者推斷馬尾松PmPinS或?yàn)槎喈a(chǎn)物酶，可能催化α-蒎烯、β-蒎烯等萜類化合物。α-蒎烯和β-蒎烯為馬尾松松脂中主要的單萜化合物，其含量變化可能受到松材線蟲侵染所誘導(dǎo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，以馬尾松松脂中α-蒎烯與β-蒎烯的濃度為參考，外源施加不同濃度的α-蒎烯、β-蒎烯及其混合溶液于松材線蟲，可明顯降低松材線蟲存活率，且混合溶液的抑制作用顯著高于單一溶液。Wang等[60]研究發(fā)現(xiàn)，利用熏蒸法對(duì)松材線蟲進(jìn)行α-蒎烯處理，結(jié)果表明，隨著α-蒎烯濃度增加松材線蟲的死亡率增加。也有研究表明，對(duì)松材線蟲施加蒎烯等多種單萜化合物可降低松材線蟲活性[61]。β-蒎烯相對(duì)于α-蒎烯而言對(duì)藍(lán)變真菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。藍(lán)變真菌為松材線蟲的主要食物來(lái)源，因此，β-蒎烯可間接抑制松材線蟲繁殖[61]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。然而，對(duì)于蒎烯類化合物對(duì)松材線蟲的影響也有不同觀點(diǎn)。Niu等[24]前期研究表明，α-蒎烯和β-蒎烯的濃度比例可以影響松材線蟲及其伴生藍(lán)變真菌的繁殖力。較低濃度的單萜化合物可能抑制松材線蟲繁殖力，而高濃度的單萜化合物可能提高松材線蟲的繁殖力。松材線蟲的繁殖力在α-蒎烯和β-蒎烯的濃度比例為1∶0.8時(shí)較高，在α-蒎烯和β-蒎烯的濃度比為1∶0.1時(shí)較低。由此推斷，萜類化合物對(duì)松材線蟲的影響可能因各組分所占比例而有所差異。單萜合酶在不同植物、不同器官和組織部位中具有不同的功能[62-65]，許多基因具有組織特異性以及抵御逆境特異性的表達(dá)模式，有助于提高植物對(duì)于食草性動(dòng)物或病原體防御能力[66]。本研究中，馬尾松β-蒎烯合酶PmPinS在接種后的高抗和易感馬尾松中表達(dá)量差異顯著，高抗馬尾松中該基因的表達(dá)量明顯高于易感馬尾松，且隨著接種時(shí)間增加而顯著上調(diào)，且在接種2 a后長(zhǎng)勢(shì)良好但攜帶松材線蟲的高抗馬尾松莖部組織特異性高表達(dá)。由此說(shuō)明，PmPinS基因可能參與了馬尾松對(duì)松材線蟲的防御過(guò)程，且具有正向調(diào)控作用。

4 結(jié)論

本研究首次從馬尾松中克隆獲得PmPinS基因，且對(duì)PmPinS基因的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、響應(yīng)松材線蟲侵染的表達(dá)模式以及α/β-蒎烯對(duì)松材線蟲的抑制作用進(jìn)行了分析。PmPinS基因?yàn)閱屋坪厦讣易宓某蓡T，可能參與β-蒎烯等單萜化合物的生物合成。接種松材線蟲后，PmPinS基因在高抗馬尾松中的表達(dá)量隨接種時(shí)間上調(diào)并顯著高于易感馬尾松，且在高抗馬尾松莖部組織特異性顯著高表達(dá)，初步表明該基因可能參與馬尾松對(duì)松材線蟲的防御過(guò)程。對(duì)松材線蟲外源施加PmPinS基因酶活產(chǎn)物α-蒎烯和β-蒎烯可顯著抑制松材線蟲存活率，證實(shí)PmPinS基因參與馬尾松對(duì)松材線蟲的防御過(guò)程，且對(duì)松材線蟲的活性具有抑制作用。該結(jié)果將有助于馬尾松抗松材線蟲機(jī)制的解析，并為馬尾松抗性品種的早期選擇和松材線蟲的有效防治奠定理論基礎(chǔ)。