黃 穎，譚書明,*，陳 萍，陳小敏，宋長(zhǎng)軍

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

酒精性肝損傷（alcoholic liver disease，ALD）是由于過量攝入酒精引起的，對(duì)全球肝病發(fā)病率和死亡率有重大影響，已成為世界關(guān)注的主要健康問題之一[1]。一次性過量飲酒容易引起急性ALD，進(jìn)而發(fā)展為脂肪肝、肝纖維化以及肝硬化[2]。目前，我國(guó)預(yù)防和治療急性ALD大多采用藥物進(jìn)行干預(yù)，但長(zhǎng)期使用藥物會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生較大的毒副作用，越來越受到人們的排斥。因此，尋找具有護(hù)肝功效的天然來源化合物已成為國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究熱點(diǎn)之一[3]。

蜂蜜，又名石蜜，是蜜蜂將采集得到的花蜜與自身分泌物結(jié)合后制成的天然物質(zhì)[4]。研究表明，蜂蜜中含有180多種物質(zhì)，包括糖、多酚、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸等[5]，具有解酒、抗氧化、抑菌以及抗癌等功效[6-8]。因此，蜂蜜被廣泛應(yīng)用于食品和藥品領(lǐng)域。多酚作為蜂蜜中的主要活性成分之一[9]，已有文獻(xiàn)報(bào)道其不僅能清除自由基，還能抑制促炎基因的表達(dá)，具有很強(qiáng)的體外抗氧化和抗炎特性[10]。Pan等[11]證實(shí)天然物質(zhì)的抗氧化和抗炎功效可改善酒精引起的肝臟損傷。然而，目前國(guó)內(nèi)還沒有蜂蜜多酚提取物能干預(yù)酒精誘導(dǎo)肝損傷的報(bào)道。因此，本研究通過建立急性ALD大鼠模型，初步探討蜂蜜多酚提取物對(duì)ALD的保護(hù)作用，為進(jìn)一步開發(fā)護(hù)肝功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量180～200 g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014。將所有大鼠圈養(yǎng)在12 h光暗循環(huán)中，溫度保持在（22±2）℃，室內(nèi)相對(duì)濕度為（55±5）%，飼料充足，飲水不限。

冬蜂蜜 貴州涼都蜂業(yè)有限公司提供；體積分?jǐn)?shù)56%二鍋頭 北京紅星股份有限公司；牡蠣粉 深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、蘇木精-伊紅染色液南京建成生物工程研究所；Amberlite XAD-2樹脂 美國(guó)西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；TRIzol試劑盒 武漢賽維爾生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒 美國(guó)Thermo公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax190連續(xù)波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；H1-16KR高速冷凍離心機(jī)湖南可成儀器設(shè)備有限公司；DY89-II電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；YD-202組織切片機(jī)浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠；D M 3 0 0 0 熒光顯微鏡徠卡儀器（德國(guó)）有限公司；CTFD-12S真空冷凍干燥機(jī)青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；Stepone plus型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂蜜多酚提取物的制備

參考梁馨文等[10]的方法并略有修改。稱取一定量的蜂蜜，以1∶9（m/V）的比例加入醋酸溶液，攪拌溶解后超聲提取40 min，離心過濾，收集濾液待用。將純化后的Amberlite XAD-2大孔樹脂填充到玻璃柱中，以1 mL/min的流速加入濾液，并用蒸餾水和醋酸溶液洗滌，以保留濾液中的多酚物質(zhì)并除去蜂蜜中的糖和其他極性化合物，再用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液洗脫多酚并收集洗脫液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇后，于-50 ℃真空冷凍干燥，得到蜂蜜多酚提取物（honey polyphenol extract，HPE）。采用Folin-Ciocalteu法[12]測(cè)得HPE中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.45%。

1.3.2 動(dòng)物分組與處理

適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將50 只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、藥物對(duì)照組、HPE低劑量組和HPE高劑量組，每組10 只。低、高劑量組分別按100、200 mg/（kg mb·d）的劑量灌胃，藥物對(duì)照組每天灌胃100 mg/（kg mb·d）的牡蠣粉，空白對(duì)照組和模型組給予同體積生理鹽水灌胃，連續(xù)30 d。于末次給藥30 min后，除空白對(duì)照組給予生理鹽水外，其他4 組均給予15 mL/kg mb體積分?jǐn)?shù)56%白酒。12 h后，各組大鼠摘眼球取血，4 ℃、3 000 r/min離心15 min后分離血清，待測(cè)。脫頸處死大鼠后，迅速解剖取出肝臟，剪下肝左葉用于組織病理學(xué)觀察，其余肝組織加入9 倍體積的生理鹽水并研磨成漿，離心后取上清液待測(cè)。

1.3.3 生化指標(biāo)測(cè)定

參照試劑盒說明書，分別檢測(cè)肝損傷指標(biāo)（ALT、AST活力）、抗氧化指標(biāo)（SOD、GSH-Px、CAT、GSH、MDA水平）、炎癥指標(biāo)（TNF-α質(zhì)量濃度）。

1.3.4 肝臟病理學(xué)檢查

將肝臟左葉樣品保存在體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林溶液中固定，經(jīng)過乙醇脫水和石蠟包埋后，每片肝組織制成5 μm的超薄切片，用蘇木精和伊紅染色樣品。最后，通過光學(xué)顯微鏡觀察肝臟中央的圖像。

1.3.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

采用TRIzol試劑提取各組大鼠肝組織的RNA，并檢測(cè)其濃度。按照cDNA試劑盒說明書操作合成cDNA后，PCR擴(kuò)增基因，具體反應(yīng)條件如下進(jìn)行：94 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸15 s，40 個(gè)循環(huán)。使用ΔΔCt方法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。檢測(cè)的目的基因及引物序列見表1。

表1 目的基因的引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR amplification of target genes

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析法，兩兩比較采用最小顯著性差異法檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPE對(duì)急性肝損傷大鼠血清ALT和AST活力的影響

表2 HPE對(duì)大鼠血清ALT和AST活力的影響（n＝ 10）Table 2 Effect of HPE on ALT and AST activities in serum of rats (n= 10)

由表2可知，模型組大鼠血清中ALT和AST活力均顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），表明一次過量飲酒會(huì)導(dǎo)致肝功能出現(xiàn)異常。而相比于模型組，HPE各劑量組和藥物對(duì)照組大鼠血清ALT及AST的活力均顯著下降（P＜0.05），其中，HPE高劑量組大鼠血清ALT和AST活力下降到藥物對(duì)照組水平，表明給予蜂蜜多酚可以有效減輕酒精對(duì)肝臟造成的損害。

2.2 HPE對(duì)急性肝損傷大鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH、MDA水平的影響

表3 HPE對(duì)大鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH、MDA含量的影響（n＝10）Table 3 Effect of HPE on SOD, GSH-Px and CAT activities, and GSH and MDA levels in liver tissues of rats (n= 10)

由表3可知，與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH含量均顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05），表明酒精暴露引起大鼠肝臟抗氧化能力下降，脂質(zhì)水平增加，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生。與模型組相比，HPE低、高劑量組SOD和GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）；此外，HPE各劑量組還增加了CAT活力和GSH含量，盡管僅在高劑量組中顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)果表明HPE能提高肝臟的抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化水平，有效預(yù)防氧化應(yīng)激的發(fā)生。

2.3 HPE對(duì)急性肝損傷大鼠肝臟TNF-α水平的影響

圖1 HPE對(duì)大鼠肝臟TNF-α質(zhì)量濃度的影響Fig. 1 Effect of HPE on TNF-α level in liver of rats

如圖1所示，與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟TNF-α水平顯著上升（P＜0.05），表明急性酒精攝入會(huì)引起肝臟發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。與模型組相比，HPE低、高劑量組以及藥物對(duì)照組TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05），且HPE高劑量組TNF-α水平低于藥物對(duì)照組，表明HPE能改善酒精引起的肝臟炎癥。

2.4 HPE對(duì)急性肝損傷大鼠ERK、JNK和p38 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

圖2 HPE對(duì)大鼠ERK、JNK和p38 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 2 Effect of HPE on mRNA expression of ERK, JNK and p38 in rats

如圖2 所示，與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟ERK、JNK、p38 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05），表明酒精激活了MAPK信號(hào)通路。與模型組相比，低劑量HPE能顯著下調(diào)JNK mRNA相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05），但對(duì)ERK、p38 mRNA表達(dá)無顯著影響（P＞0.05）；高劑量HPE處理后能顯著下調(diào)ERK、JNK、p38 mRNA相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05），表明HPE能抑制MAPK通路的激活，尤其以高劑量HPE效果最為顯著。

2.5 HPE對(duì)急性肝損傷大鼠肝臟的組織病理學(xué)影響

由圖3可知，空白對(duì)照組肝細(xì)胞排列整齊，胞漿內(nèi)無脂質(zhì)液泡分布，肝組織無異常改變；而模型組中觀察到肝細(xì)胞有明顯的結(jié)構(gòu)紊亂，并且胞漿內(nèi)有大量的脂質(zhì)液泡出現(xiàn)，表明急性酒精暴露對(duì)肝組織造成明顯的損傷；在藥物對(duì)照組中，觀察到肝細(xì)胞較完整，胞漿內(nèi)的脂質(zhì)液泡明顯減少；HPE低劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，胞漿內(nèi)有部分脂質(zhì)液泡出現(xiàn)，但明顯少于模型組；高劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列整齊，肝細(xì)胞內(nèi)僅有極少的脂質(zhì)液泡，肝損傷明顯減輕。

圖3 大鼠肝臟組織病理學(xué)變化（200×）Fig. 3 Histopathological changes of rat liver tissues (200 ×)

3 討 論

肝臟不僅是乙醇代謝的主要器官，也是乙醇毒性的目標(biāo)，短時(shí)間內(nèi)過量飲酒通常會(huì)導(dǎo)致急性ALD[13]。ALD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥等因素[14]，其中，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在ALD中的作用日益受到重視[15]。大量研究表明，乙醇代謝產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）及炎癥細(xì)胞因子能夠引起肝細(xì)胞的變性和壞死，進(jìn)而出現(xiàn)肝功能損害的臨床表現(xiàn)[16]。Qu Linlin等[17]研究發(fā)現(xiàn)，具有抗氧化和抗炎作用的生物活性物質(zhì)能夠降低ROS和炎癥細(xì)胞因子的水平，從而有效預(yù)防酒精所致肝損傷。因此，本研究以HPE為干預(yù)物，探討其對(duì)急性ALD的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)采用體積分?jǐn)?shù)56%白酒一次性灌胃建立大鼠急性ALD模型，通過測(cè)定血清生化指標(biāo)和觀察肝組織病理學(xué)變化研究HPE對(duì)肝損傷的保護(hù)作用。ALT和AST是存在于肝細(xì)胞內(nèi)的酶，當(dāng)肝臟受到酒精損害時(shí)，肝細(xì)胞被破壞，ALT和AST就會(huì)分散到血液中[18]。因此，血清ALT和AST的活性常作為判斷肝損傷的指標(biāo)[19]。肝臟組織病理學(xué)觀察是評(píng)價(jià)肝臟損傷程度的金標(biāo)準(zhǔn)，在各類動(dòng)物肝損傷模型中廣泛應(yīng)用[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠血清ALT和AST活力顯著升高，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，胞漿脂質(zhì)過度積累，表明急性酒精攝入引起大鼠肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，肝細(xì)胞膜通透性增加，提示ALD模型建立成功；相比于模型組，補(bǔ)充不同劑量的HPE能顯著降低大鼠ALT和AST活力，有效改善肝組織病變情況，表明HPE對(duì)急性ALD具有一定的保護(hù)作用。

研究表明氧化應(yīng)激是導(dǎo)致ALD的主要機(jī)制之一[21]。酒精在肝臟中代謝會(huì)產(chǎn)生ROS并消耗抗氧化劑，破壞機(jī)體氧化-抗氧化平衡，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激，促進(jìn)ALD的發(fā)生[22]。GSH作為體內(nèi)重要的抗氧化劑，可以清除大量自由基，對(duì)肝臟抗氧化系統(tǒng)具有重要意義[23]。除GSH外，抗氧化物酶如SOD、GSH-Px和CAT在肝臟抗氧化系統(tǒng)中也起著重要作用。SOD通過催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化為氧和過氧化氫來清除ROS[24]。GSH-Px可以在GSH存在下減少脂肪酸氫過氧化物和過氧化氫[25]。CAT可催化過氧化氫分解為水和氧[26]。這些抗氧化劑均能保護(hù)肝臟免受氧化應(yīng)激的損害，但很容易被脂質(zhì)過氧化物清除[27]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，肝臟中MDA水平升高可干擾抗氧化防御并引起肝細(xì)胞損傷，使血液中ALT和AST活力升高[28]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酒精攝入會(huì)造成肝臟抗氧化劑水平降低，脂質(zhì)過氧化物含量升高，引起肝細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，進(jìn)一步提示本實(shí)驗(yàn)建模成功，這與Mir[29]和Kim[30]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。給藥HPE后，肝臟中SOD、GSH-Px、CAT和GSH水平較模型組均升高，MDA含量顯著降低，表明蜂蜜多酚具有抗氧化活性，可通過抑制氧化應(yīng)激改善酒精對(duì)肝臟造成的損傷。

除氧化應(yīng)激外，炎癥反應(yīng)也是引起ALD的重要原因[31]。酒精攝入會(huì)損傷腸道黏膜，導(dǎo)致腸道內(nèi)大量有毒物質(zhì)進(jìn)入肝臟后激活MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞活化并釋放炎癥因子，引起肝臟炎癥[32]。TNF-α是機(jī)體內(nèi)主要的炎癥因子，它的過量產(chǎn)生能夠刺激肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致ALD[33]。有研究顯示，巨噬細(xì)胞是產(chǎn)生TNF-α最主要的細(xì)胞，而MAPK通路影響著巨噬細(xì)胞的激活[34]。MAPK信號(hào)通路是近年來新發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和防治ALD的重要通路，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、壞死等多種生理病理過程[35]。MAPK家族主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK），c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38激酶（p38 kinase，p38），它們均能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化并產(chǎn)生TNF-α，促進(jìn)肝臟炎癥的發(fā)生[17]。Wang Xiaodong等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在酒精干預(yù)期間，抑制MAPK途徑可以降低TNF-α活性，有效保護(hù)ALD。本研究結(jié)果顯示，酒精處理顯著上調(diào)ERK、JNK和p38 mRNA的表達(dá)量，并增加TNF-α水平，促使肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)；而給予不同劑量的HPE可不同程度地下調(diào)ERK、p38和JNK mRNA的表達(dá)，并明顯減少肝臟TNF-α的含量，說明HPE可通過抑制MAPK通路而降低TNF-α的水平，從而緩解肝臟炎癥反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)表明蜂蜜多酚具有很強(qiáng)的抗炎活性，可通過抑制肝臟發(fā)炎從而降低酒精對(duì)肝造成的損傷。

綜上所述，一次過量攝入酒精會(huì)導(dǎo)致大鼠肝臟受損，而補(bǔ)充HPE能明顯降低大鼠血清ALT和AST活力，改善肝組織病變情況，通過提高肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH水平并降低MDA含量緩解酒精所致氧化應(yīng)激損傷，并通過抑制MAPK信號(hào)通路的激活降低TNF-α水平調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，最終改善酒精誘導(dǎo)的急性ALD。因此，HPE可以作為功能保健食品在急性ALD的治療中具有重要的意義。