亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        胡柚黃酮對高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

        2020-11-27 10:47:28王方杰吳祖芳翁佩芳
        食品科學 2020年21期
        關(guān)鍵詞:黃酮小鼠實驗

        王方杰,吳祖芳,翁佩芳,張 鑫,田 園

        (寧波大學食品與藥學學院,浙江省動物蛋白精深加工技術(shù)重點實驗室,浙江 寧波 315832)

        肥胖是一種慢性代謝紊亂,能夠大幅增加罹患2型糖尿病、脂肪肝、高血壓、心肌梗塞和癌癥等疾病的風險,從而導致患者生活質(zhì)量下降和預(yù)期壽命縮短,故預(yù)防和治療肥胖已成為現(xiàn)代社會面臨的主要健康挑戰(zhàn)[1-2]。近年來,眾多的研究表明腸道微生物對人體健康起著至關(guān)重要的作用,能夠改善免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)宿主代謝、平衡營養(yǎng)素的吸收,菌群的多樣性與機體健康息息相關(guān)[3]。與正常個體相比,肥胖宿主的腸道菌群顯示出較低的基因豐度[4-5],適當?shù)娘嬍掣深A(yù)可以增強腸道菌群的基因豐度并促進體質(zhì)量減輕[6]。腸道菌群與肥胖的關(guān)系已成為研究的熱點,且是治療肥胖的潛在有效靶點。

        許多研究表明,植物活性物質(zhì)具有預(yù)防肥胖的作用,并可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群來減輕體質(zhì)量[7-9]。胡柚為蕓香科植物柚與甜橙的雜交品種,是浙江省常山縣原產(chǎn)的地方柑橘品種,具有鎮(zhèn)咳化痰、消食舒胃等功效[10]。黃酮類化合物(flavonoids,F(xiàn)LS)是胡柚中重要的生物活性物質(zhì),胡柚黃酮的主要成分為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等[11]。研究表明,F(xiàn)LS能夠利用其抗氧化和抗炎特性在超重胰島素抵抗大鼠中發(fā)揮潛在的肥胖治療作用[12],并降低血漿脂質(zhì)濃度,改善高碳水化合物、高脂肪飲食誘導的大鼠心血管功能障礙和肥胖[13]。在FLS發(fā)揮作用的機制中,腸道菌群被認為起到核心作用,這不僅是因為一些FLS具有抑菌作用,而且也特異性地促進了部分細菌的增殖[14-15]。然而,胡柚黃酮與肥胖宿主腸道菌群間的相互作用并不清楚。本研究擬采用高脂肪飲食(high fat diet,HFD)誘導建立高脂肥胖小鼠模型,應(yīng)用16S rDNA測序技術(shù),探究胡柚黃酮對HFD小鼠腸道菌群的影響及對肥胖的調(diào)控作用,為胡柚資源的深度開發(fā)和黃酮類化合物作為功能性成分的應(yīng)用提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 動物、材料與試劑

        實驗動物采用SPF級C57BL/6J小鼠(6 周齡,雄性,平均體質(zhì)量(20±2)g),實驗動物使用許可證號:SYXK(浙)2013-0191,購于上海斯萊克實驗動物有限公司。

        胡柚黃酮為常山胡柚干燥粉末采用乙醇浸提法得到的粗提物,經(jīng)D101型大孔樹脂進一步純化,所得提取物的總黃酮質(zhì)量分數(shù)為95%;標準飼料由寧波大學實驗動物中心提供;高脂飼料購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

        總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)試劑盒 南京建成生物工程研究所;蘇木精-伊紅染液 武漢谷歌生物科技有限公司;DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Stool DNA Kit) 美國Omega Bio-Tek公司;DL2000 DNA Marker 日本寶生物工程(大連)有限公司;瓊脂糖(RA1011-Agarose LE-100G) 上海捷瑞生物工程有限公司;氯化鈉、異丙醇、無水乙醇、多聚甲醛 國藥集團化學試劑有限公司;其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        AY-120型電子精密天平 日本Shimadzu公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器、無菌硬質(zhì)糞便收集袋 上海申安醫(yī)療器械廠;Spectramax190全波長酶標儀 美國Molecular Devices有限公司;5418R小型高速冷凍離心機、5804R高速冷凍離心機德國Eppendorf 公司;MX-S/M X-F 型漩渦混合器 大龍興創(chuàng)實驗儀器北京有限公司;Cryotome E冰凍切片機 賽默飛世爾科技中國有限公司;ECLIPSE CI正置光學顯微鏡 日本尼康公司;L96G梯度型聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 杭州朗基科學儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 動物分組和處理

        小鼠購得后經(jīng)外包裝滅菌處理立即轉(zhuǎn)入寧波大學實驗動物中心,SPF級屏障系統(tǒng)內(nèi)進行飼養(yǎng),溫度和相對濕度分別控制在(22±2)℃和(50±10)%,12 h光照和12 h黑暗交替循環(huán),小鼠自由飲食飲水。在整個實驗期間,所有涉及動物的程序均嚴格按照中國有關(guān)實驗動物的相關(guān)飼養(yǎng)規(guī)范和法律規(guī)定進行。

        小鼠經(jīng)過1 周的適應(yīng)性飼養(yǎng),每組6 只,隨機分為3 組:正常對照組(CONT組)、高脂肥胖組(HFD組)、胡柚黃酮組(FLS組),實驗動物具體分組情況見表1。稱取一定量的胡柚黃酮溶解于無菌水中,避光保存,采用灌胃的方式按100 mg/(kgmb·d)的劑量對FLS組小鼠進行干預(yù),每日1 次,CONT組和HFD組灌胃等體積無菌水(在此劑量下小鼠精神正常,無任何異常現(xiàn)象,無一例死亡)。實驗以第一天灌胃為第0周,共持續(xù)8 周,每周3 次記錄小鼠的體質(zhì)量和攝食量并計算平均值,同時在第0、2、4、8周(分別為FLS 0、FLS 2、FLS 4、FLS 8組)收集每組小鼠的新鮮糞便樣本,液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存,用于腸道菌群分析。第8周末,所有小鼠禁食過夜,通過頸椎脫臼處死小鼠,立即收集血液樣本,并在4 ℃下3 500×g離心10 min,取上層血清用于生化測定。迅速解剖小鼠,分離肝臟組織用于病理學檢測。

        表1 實驗動物分組Table 1 Animal grouping

        1.3.2 血清生化指標測定

        小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的測試盒進行檢測,測定方法嚴格按照測試盒說明進行。

        1.3.3 肝臟組織病理學檢測

        將新鮮肝臟組織在4%多聚甲醛溶液中固定24 h后,用OTC包埋劑進行包埋。快速冷凍后切下組織切片(8~10 μm),并用油紅O染色,在光學顯微鏡200×放大倍數(shù)下觀察肝臟脂肪變性程度。

        1.3.4 糞便細菌DNA提取和16S rDNA測序分析

        參考文獻[16]報道的方法,采用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit提取小鼠糞便中細菌的總DNA,并對提取的DNA樣本進行質(zhì)檢,檢驗合格的樣本用于后續(xù)分析。以16S rDNA高變區(qū)中的V3+V4區(qū)為目標測序片段,采用帶Barcode的特異引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對目標片段進行PCR擴增,每個樣品進行3 次重復(fù)。PCR擴增產(chǎn)物通過質(zhì)量分數(shù)2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,并對目標片段進行回收、純化。對純化后的PCR產(chǎn)物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA檢測試劑盒在Qbit熒光定量系統(tǒng)上對文庫進行定量,將合格的文庫在Illumina MiSeq平臺上對樣品進行測序。

        采用FLASH(v1.2.8)軟件將序列拼接成高質(zhì)量Tags,并將序列建庫引入的Barcode和引物序列去除,然后采用Vsearch(v2.3.4)軟件過濾嵌合體。將序列相似度大于97%的clean tags聚類為操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)。使用QIIME(v1.8.0)軟件計算樣本的Alpha多樣性,對樣本進行物種多樣性分析。通過主坐標分析計算Beta多樣性,用于評估樣本在物種多樣性中的差異。使用BLAST進行序列比對,將OTU代表序列與核糖體數(shù)據(jù)庫以及NCBI-16S數(shù)據(jù)庫對比,對每個代表性序列進行物種注釋,獲得分類學信息,在門、科、屬水平上統(tǒng)計樣本的群落結(jié)構(gòu)組成并進行分析。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

        所有實驗均進行3 次平行實驗,數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標準差。運用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行單因素方差分析,數(shù)據(jù)采用Duncan’s多重比較檢驗,當P<0.05則認為具有統(tǒng)計學顯著差異。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 FLS對高脂肥胖小鼠攝食量和體質(zhì)量的影響

        圖1 FLS灌胃期間小鼠日攝食量變化Fig. 1 Changes in daily food intake of mice during administration of FLS

        各組小鼠的日均攝食量在實驗周期內(nèi)基本穩(wěn)定,由圖1可看出,CONT組、HFD組和FLS組小鼠的攝食量無顯著性差異(P>0.05),表明對高脂肥胖小鼠喂食FLS不會引起小鼠的食欲下降。

        圖2 FLS灌胃期間小鼠體質(zhì)量變化Fig. 2 Changes in body mass of mice during administration of FLS

        對8 周實驗過程中各組小鼠的平均體質(zhì)量進行比較。第0周時,3 組小鼠具有相似的初始體質(zhì)量。從圖2 A 中可以看出,經(jīng)過8 周的高脂飲食誘導,HFD組小鼠體質(zhì)量與CONT組相比具有顯著性差異(P<0.05);隨著胡柚黃酮樣品的灌胃處理,從第4周起,F(xiàn)LS組的平均體質(zhì)量顯著低于HFD組(P<0.05),第7周起具有極顯著差異(P<0.01)。第8周實驗結(jié)束時(圖2B),F(xiàn)LS組的平均體質(zhì)量為(28.20±0.85)g,與食物攝入量相同的HFD組平均體質(zhì)量((31.23±0.80)g)相比極顯著降低(P<0.01)。表明FLS顯著緩解了高脂飲食誘導的肥胖小鼠的體質(zhì)量增加。

        2.2 FLS對高脂肥胖小鼠血清生化指標的影響

        圖3 FLS灌胃對小鼠血清生化指標的影響Fig. 3 Effect of FLS on serum biochemical parameters in mice

        由圖3可知,與CONT組相比,HFD小鼠的TC、TG和LDL-C濃度顯著升高,HDL-C濃度顯著下降(P<0.05),出現(xiàn)高血脂癥狀,證明高脂肥胖小鼠模型誘導成功。經(jīng)過胡柚黃酮干預(yù)后,同樣喂食高脂飼料的FLS組與HFD組相比較TC、TG和LDL-C濃度則顯著降低,HDL-C濃度顯著升高(P<0.05),其中LDL-C濃度基本恢復(fù)至正常水平。

        2.3 FLS對高脂肥胖小鼠肝臟病理的影響

        圖4 小鼠肝臟組織學觀察(×200)Fig. 4 Histological observation of liver tissue (× 200)

        由圖4可知,CONT組小鼠肝臟組織油紅O染色面積較小,脂滴也很小,肝細胞形態(tài)正常;而HFD組肝臟組織中出現(xiàn)肝細胞脂肪變性,脂滴數(shù)目明顯增多且呈堆積狀,融合為大塊的紅色脂滴;相比之下,F(xiàn)LS組肝臟切片紅色脂滴體積明顯減小,較為稀疏,呈小顆粒狀不均勻分布,肝細胞脂肪輕度變性。

        2.4 FLS對高脂肥胖小鼠腸道菌群多樣性的影響

        為了評價高脂飲食和FLS處理對腸道菌群多樣性的影響,利用Illumina MiSeq測序平臺對第0、2、4、8周小鼠糞便樣本進行16S rDNA測序。利用顯示組間重疊部分的Venn圖可以直觀地理解各組之間共有和獨有的OTU。由圖5A可見,所有樣品中共享1 284 個OTU總豐富度中的219 個,灌胃FLS后觀察到的OTU>17%,與實驗初始時相同。

        圖5 FLS對肥胖小鼠腸道菌群多樣性的影響Fig. 5 Effect of FLS on the diversity of gut microbiota in obese mice

        表2 FLS對肥胖小鼠腸道菌群多樣性的影響Table 2 Effect of FLS on the diversity of gut microbiota in obese mice

        Alpha多樣性主要反映物種豐富度和均勻度。由表2可知,隨著FLS的灌胃,與實驗第0周相比,第8周FLS組的Observed species和Chao1指數(shù)顯著升高,表明第8周小鼠腸道菌群的物種數(shù)目顯著高于實驗初期(P<0.05)。Shannon和Simpson指數(shù)也隨著FLS處理時間的延長分別發(fā)生了顯著升高和降低(P<0.05),腸道菌群多樣性逐漸增加并在第8周達到最大值。結(jié)果表明,F(xiàn)LS能夠增加高脂飲食誘導的肥胖小鼠腸道菌群的多樣性。

        為了比較微生物群落之間的相似性程度,通過未加權(quán)的UniFrac計算Beta多樣性并進行主坐標分析。由圖5B可看出,雖然存在個體間差異,但經(jīng)過FLS干預(yù)的肥胖小鼠腸道菌群在不同時間點彼此分開聚集,表明在8 周時間內(nèi)FLS干預(yù)對腸道菌群組成有明顯影響。

        2.5 FLS對高脂肥胖小鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的影響

        圖6 FLS對肥胖小鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的影響Fig. 6 Effect of FLS on the composition of gut microbiota in obese mice

        表3 擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度變化Table 3 Changes in relative abundance of Bacteroidetes and Firmicutes

        為了進一步分析FLS對腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的影響,對不同分類水平上優(yōu)勢菌的相對豐度進行統(tǒng)計分析。門水平的聚類柱狀圖(圖6A)顯示,小鼠腸道中的優(yōu)勢菌群為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)。隨著FLS的干預(yù),從第0周(FLS 0)到第8周(FLS 8),小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)逐漸改變,Bacteroidetes的相對豐度增加,F(xiàn)irmicutes的相對豐度減少。據(jù)文獻報道,F(xiàn)irmicutes/Bacteroidetes(F/B)的比值可能反映腸道微生態(tài)的平衡狀態(tài),被視為生物體健康狀況的典型參數(shù)[4]。對3 組小鼠腸道菌群第0周和第8周Bacteroidetes和Firmicutes的相對豐度變化進行統(tǒng)計(表3)發(fā)現(xiàn),HFD組小鼠的Bacteroidetes顯著降低,F(xiàn)irmicutes顯著增加,F(xiàn)/B比值相應(yīng)增加(P<0.05),反映出肥胖小鼠腸道微生態(tài)的失調(diào)。而隨著FLS處理時間的延長,F(xiàn)LS組的F/B比值從0.81逐漸下降到0.48。表明FLS能夠調(diào)節(jié)高脂飲食誘導的肥胖小鼠腸道菌群在門水平上的組成。

        科水平上小鼠腸道菌群相對豐度的前2 0 名如圖6 B 所示,可以看出,擬桿菌門的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)以及厚壁菌門的毛螺菌科(Lachnospiraceae)等為主要優(yōu)勢菌科。灌胃FLS后,與實驗初期(FLS 0)相比,Prevotellaceae、Bacteroidaceae、Porphyromonadaceae的相對豐度增加,Lachnospiraceae、Ruminococcaceae的相對豐度逐漸減少。表明FLS能夠調(diào)節(jié)肥胖小鼠腸道菌群在科水平上的組成結(jié)構(gòu)。

        用熱圖來比較屬水平上各個菌屬的相對豐度變化,由圖6C可知,隨著FLS干預(yù)時間延長,普雷沃菌屬(Prevotella)、擬桿菌屬(Bacteroides)、布勞特氏菌屬(Blautia)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、艾克曼菌屬(Akkermansia)等相對豐度明顯增加,而瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、毛螺菌屬(Lachnoclostridium)、嗜膽菌屬(Bilophila)等相對豐度逐漸下降,這與科水平上的菌群變化趨勢一致。

        3 討 論

        與肥胖相關(guān)的血脂水平異常,尤其是較高水平的TC、TG和LDL-C是心血管疾病的主要決定因素[17]。本研究表明,高脂肥胖小鼠經(jīng)胡柚黃酮灌胃后,與HFD組相比FLS組小鼠體質(zhì)量增長呈下降趨勢,血清TC、TG和LDL-C的含量顯著降低,HDL-C的含量顯著升高,肝臟組織的脂質(zhì)積累程度也得到了緩解。胡柚黃酮體現(xiàn)的這些效果與相關(guān)文獻所報道血脂水平TC、TG和LDL-C指標相關(guān)結(jié)果一致[18-20]。此外,血清中的HDL-C水平可作為判斷動脈硬化性心血管疾病發(fā)展程度的指標[21]。胡柚黃酮能降低血清TC、TG和LDL-C水平,使血脂組成向高密度脂蛋白轉(zhuǎn)變,在一定程度上調(diào)節(jié)高脂肥胖小鼠的體內(nèi)血脂水平,降低肥胖和動脈粥樣硬化等疾病的風險。肝臟是機體內(nèi)脂類代謝的主要器官,攝入脂肪過多時,肝細胞會大量積累脂肪,甚至可能發(fā)生病變,形成脂肪肝[22-23]。實驗表明,HFD組小鼠肝臟細胞脂質(zhì)沉積嚴重,而胡柚黃酮能夠明顯地抑制高脂飲食導致的肝臟組織脂質(zhì)積累,改善肝臟脂肪變性程度,防止脂肪肝等肝臟病變的發(fā)生。

        腸道菌群可能是肥胖發(fā)展過程中最重要的可變因素[24-25],其中的幾個特定種屬可以在宿主代謝和肥胖發(fā)展中發(fā)揮重要作用[26-27]。從FLS的干預(yù)對肥胖小鼠腸道菌群變化的影響結(jié)果可以看出,胡柚黃酮的干預(yù)顯著提高了肥胖小鼠腸道菌群的多樣性,對腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)發(fā)揮了積極的調(diào)節(jié)作用,且具有一定的時間效應(yīng)。由2.5節(jié)結(jié)果可知,F(xiàn)LS能夠促進Bifidobacterium、Blautia、Akkermansia等有益菌屬的增殖。Bifidobacterium能夠改善腸道環(huán)境、抑制腸道有害細菌的生長、提高肌體免疫力、預(yù)防便秘等,對人體健康有重要作用[28];另有研究報道,Bifidobacterium可通過調(diào)節(jié)腸道屏障、緩解炎癥等降低體質(zhì)量[27],近幾年作為益生菌被廣泛用于針對肥胖、糖尿病等代謝疾病[29]。Blautia的相對豐度與機體腸道內(nèi)短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)的含量呈正相關(guān)[30],菌群代謝產(chǎn)物SCFAs對腸道屏障、菌群組成和肥胖控制有益[31]。研究證明,結(jié)腸中高濃度的丙酸和丁酸對于防止低膽固醇血癥和腫瘤的發(fā)生具有良好的效果[32]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),F(xiàn)LS能夠顯著降低肥胖小鼠血清中LDL-C的含量,可能是通過提高腸道中Blautia等SCFAs產(chǎn)生菌屬的相對豐度來實現(xiàn)的。黏蛋白降解菌屬Akkermansia有助于改善肝功能異常和機體炎癥[27],通過補充益生元增加肥胖小鼠體內(nèi)Akkermansia的豐度可以改善相關(guān)代謝特征,逆轉(zhuǎn)高脂飲食帶來的代謝紊亂[33]。FLS的干預(yù)使Akkermansia屬豐度提高,從而改善肥胖小鼠的代謝指標。實驗結(jié)果表明FLS對肥胖小鼠腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)具有積極的調(diào)節(jié)作用,能夠增加有益菌群的相對豐度,從而對肥胖宿主的代謝產(chǎn)生積極的影響。

        4 結(jié) 論

        通過研究胡柚黃酮對高脂飲食誘導的肥胖小鼠血清和肝臟病理學及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用,結(jié)果表明,攝入胡柚黃酮能夠明顯抑制體質(zhì)量增加,使肥胖小鼠的血脂水平和肝臟脂質(zhì)積累程度向正?;謴?fù),降低肥胖和脂肪肝等疾病的風險;能夠顯著提高肥胖小鼠腸道菌群的多樣性,在門水平上增加了Bacteroidetes的相對豐度,降低了Firmicutes的相對豐度,逆轉(zhuǎn)了菌群失調(diào)的肥胖小鼠F/B比值的升高,并通過增加特定的有益菌屬(如Bifidobacterium、Blautia、Akkermansia等)的相對豐度使肥胖小鼠的腸道菌群發(fā)生有利改變,促進細菌生成SCFAs,調(diào)節(jié)腸道屏障,改善肥胖引起的代謝紊亂。因此,胡柚黃酮在腸道菌群的調(diào)節(jié)中呈現(xiàn)良好的益生作用,可作為功能性食品成分預(yù)防腸道微生態(tài)的失調(diào),通過調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)實現(xiàn)降脂減肥的目的。

        猜你喜歡
        黃酮小鼠實驗
        記一次有趣的實驗
        小鼠大腦中的“冬眠開關(guān)”
        做個怪怪長實驗
        HPLC法同時測定固本補腎口服液中3種黃酮
        中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:40
        MIPs-HPLC法同時測定覆盆子中4種黃酮
        中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:13
        米小鼠和它的伙伴們
        DAD-HPLC法同時測定龍須藤總黃酮中5種多甲氧基黃酮
        中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:50
        NO與NO2相互轉(zhuǎn)化實驗的改進
        實踐十號上的19項實驗
        太空探索(2016年5期)2016-07-12 15:17:55
        瓜馥木中一種黃酮的NMR表征
        丰满人妻被两个按摩师| 亚洲日本人妻中文字幕| 色综合久久人妻精品日韩| 国产精品一区二区三区在线免费| 波多野结衣的av一区二区三区| av人摸人人人澡人人超碰小说| mm在线精品视频| 懂色av一区二区三区网久久| 国产极品视觉盛宴| 久久发布国产伦子伦精品| 甲状腺囊实性结节三级| 精品国产av一区二区三四区| 久久久久99人妻一区二区三区 | 老熟女高潮一区二区三区| 人妻无码AⅤ不卡中文字幕| 亚洲精品中文字幕码专区| 亚洲国产精品无码一线岛国| 黑人巨大av在线播放无码| 亚洲色大成在线观看| 青青草视频网站免费看| 揄拍成人国产精品视频| 中文字幕一区二区人妻| 日本香蕉久久一区二区视频| 亚洲啪啪色婷婷一区二区| 99无码熟妇丰满人妻啪啪| 97人人超碰国产精品最新o| 日本精品一区二区在线看| 久久综合九色综合97婷婷 | 国产又黄又大又粗的视频| 最新亚洲无码网站| 新久久国产色av免费看| 久久久精品国产老熟女| 午夜精品久久久久久久久| 亚洲国产精品久久亚洲精品| 欧美破处在线观看| 亚洲中文字幕高清av| 丁字裤少妇露黑毛| 国产97色在线 | 免| 亚洲人妻御姐中文字幕| 国产精品爽爽ⅴa在线观看 | 又色又爽又黄高潮的免费视频|