郭 垚，符 萌，李雪靜，王 娜，常耀光，王靜鳳

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

肥胖是一種全身性代謝性疾病，體內(nèi)脂肪過多積累會導(dǎo)致壽命縮短以及罹患II型糖尿病、心血管疾病等一系列健康問題[1-3]。脂肪組織在肥胖的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，研究表明，脂肪組織中脂肪細胞數(shù)目過多和體積過大則會導(dǎo)致肥胖[4-5]。因此調(diào)控脂肪細胞分化對改善肥胖及其引起的代謝疾病至關(guān)重要。

多糖生物活性的發(fā)揮依賴于它們的結(jié)構(gòu)特征。近期研究發(fā)現(xiàn)，高級結(jié)構(gòu)特征中的分子質(zhì)量和鏈構(gòu)象與多糖的功能發(fā)揮密切相關(guān)。袁松[6]發(fā)現(xiàn)，低分子質(zhì)量海帶巖藻聚糖硫酸酯預(yù)防酒精性胃潰瘍的效果優(yōu)于高分子質(zhì)量海帶巖藻聚糖硫酸酯；Sun Liqin等[7]對不同分子質(zhì)量（6～1 000 kDa范圍）紫球藻多糖的抗腫瘤和免疫活性進行了研究，結(jié)果表明，最小分子質(zhì)量（6.53 kDa）的多糖具有最強的免疫增強活性。Kojima[8]和Falch[9]等發(fā)現(xiàn)裂褶多糖和香菇多糖抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的實現(xiàn)依賴于其三股螺旋結(jié)構(gòu)，當該螺旋被破壞時，相應(yīng)的生物活性也隨之降低或消失。

海參巖藻聚糖硫酸酯（sea cucumber fucoidan，SC-FUC）是海參體壁中的重要活性成分[10]。大量研究表明，SC-FUC具有抗炎[11]、抗凝血[12]、改善胰島素抵抗[13]、改善飲酒導(dǎo)致的肝損傷[14]、抗腫瘤[15]、免疫調(diào)節(jié)[16]等多種生理功能。目前已有研究證明海參硫酸多糖可以抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化過程[17]，但關(guān)于SC-FUC高級結(jié)構(gòu)與其抑脂活性相關(guān)性的研究鮮見報道，因此研究不同高級結(jié)構(gòu)SC-FUC對脂肪細胞分化的影響具有深遠意義。

本實驗以3T3-L1細胞為研究對象，在體外水平對不同高級結(jié)構(gòu)墨西哥海參巖藻聚糖硫酸酯（fucoidan from Holothuria mexicana，Hm-FUC）調(diào)控脂肪細胞分化的活性進行比較研究并探討其作用機制，以期為SC-FUC活性的高效利用及其在功能食品領(lǐng)域的深入開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Hm-FUC由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院常耀光教授提供。

D M E M 培養(yǎng)基 美國G i b c o 公司；胎牛血清以色列Biological Industries公司；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、地塞米松（dexamethasone，Dex）、胰島素、油紅O染料美國Sigma公司；乳酸脫氫酶試劑盒 南京建成生物工程研究所；RNeasy Mini Kit 德國Qiagen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 日本Takara公司；SYBR Green熒光染料瑞士Roche公司；基因引物序列 上海生工有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HF 90型CO2培養(yǎng)箱 香港Heal Force公司；DL-CJ-IN型超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；IX51型倒置顯微鏡 日本Olympus公司；680型酶標儀美國Bio-Rad公司；Nano 200型微量分光光度計 杭州奧神儀器有限公司；LightCycler 96 Instrument實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)儀 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 Hm-FUC結(jié)構(gòu)分析

參照續(xù)曉琪[18]的方法分析4 種Hm-FUC（Hm1、Hm2、Hm3、Hm4）的高級結(jié)構(gòu)。

1.3.2 3T3-L1前脂肪細胞增殖活性測定

將細胞按2×103個/孔接種于96 孔板中，細胞貼壁24 h后，在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度（0、20、40、80 μg/mL）的Hm1、Hm2、Hm3和Hm4，分別孵育24、48 h，采用MTT法測定細胞的增殖活性。細胞的相對增殖率按式（1）計算。

1.3.3 LDH活力測定

3)國家農(nóng)機補貼目錄中對于同樣用途的提水設(shè)備，不分成本大小給予同樣比例的補貼，可能不利于成熟機組的推廣應(yīng)用。

細胞接種及加樣方法同1.3.1節(jié)。3T3-L1細胞經(jīng)Hm1、Hm2、Hm3和Hm4作用48 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液，使用試劑盒測定上清液中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活力。

1.3.4 油紅O染色及細胞分化率計算

將細胞按2×104個/孔接種于24 孔板中，待細胞融合后接觸抑制48 h，采用“傳統(tǒng)雞尾酒”法進行誘導(dǎo)分化。于第0天添加受試物（Hm1、Hm2、Hm3和Hm4質(zhì)量濃度均為60 μg/mL），每2 d更換培養(yǎng)基，分化至第8天進行油紅O染色，于顯微鏡下進行觀察拍照。

采用比色法對細胞中脂肪含量進行半定量檢測。每孔中加入800 μL異丙醇，充分吹打混勻，于490 nm波長處測定OD值。細胞分化率按式（2）計算。

1.3.5 mRNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

細胞接種、誘導(dǎo)分化及加樣方法同1.3.4節(jié)。采用RNeasy Mini Kit試劑盒提取RNA，取1 μg RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以所得cDNA為模板，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)法檢測脂肪細胞分化相關(guān)基因的mRNA表達。以β-actin作為內(nèi)參，基因相對表達量以目的基因表達量/β-actin表達量表示，引物序列見表1。

表1 脂肪細胞分化相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of genes related to adipocyte differentiation

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果以 ±s表示，使用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，以P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hm-FUC結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

Hm-FUC原糖及其低分子質(zhì)量多糖的重均分子質(zhì)量（Mw）、均方根旋轉(zhuǎn)半徑（Rg）、水合半徑（Rh）等分子特征和鏈構(gòu)象參數(shù)如表2所示。Hm1、Hm2和Hm3均為無規(guī)卷曲鏈構(gòu)象，且隨著重均分子質(zhì)量降低，多糖鏈逐漸變短變?nèi)犴?；Hm4為球形鏈構(gòu)象。

表2 不同高級結(jié)構(gòu)Hm-FUC的重均分子質(zhì)量、分子尺寸和鏈構(gòu)象參數(shù)Table 2 Molecular masses and chain conformational parameters of Hm-FUCs with different advanced structures

2.2 Hm-FUC對3T3-L1前脂肪細胞增殖活性的影響

圖1 Hm-FUC 對3T3-L1前脂肪細胞增殖活性的影響Fig. 1 Effect of Hm-FUCs on the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes

增殖是脂肪細胞分化必經(jīng)的一個重要階段[19]。為研究Hm-FUC對3T3-L1細胞增殖活性的影響，采用MTT法檢測細胞存活率。細胞增殖曲線結(jié)果如圖1所示，Hm-FUC可顯著抑制3T3-L1細胞的生長，且隨著時間延長和受試物劑量增加，抑制效果逐漸增強，呈現(xiàn)出明顯的時間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。當受試物質(zhì)量濃度為80 μg/mL時，經(jīng)Hm1、Hm2、Hm3和Hm4處理48 h，3T3-L1前脂肪細胞的存活率分別下降了14.88%、18.38%、18.46%和13.47%（P＜0.01）。結(jié)果表明，4 種Hm-FUC均可顯著抑制3T3-L1細胞的增殖活性，其中Hm2和Hm3效果較好。

圖2 Hm-FUC對3T3-L1前脂肪細胞LDH活力的影響Fig. 2 Effect of Hm-FUCs on LDH activity of 3T3-L1 preadipocytes

為進一步評估H m-F U C 的細胞毒性，檢測了3T3-L1細胞培養(yǎng)上清液中LDH的活力。如圖2所示，分別與Hm1、Hm2、Hm3和Hm4共孵育后細胞培養(yǎng)上清液中LDH的活力均無顯著變化，表明Hm-FUC可以顯著抑制3T3-L1細胞增殖活性，但不造成細胞損傷。綜合MTT實驗與LDH活力分析結(jié)果，本研究選取60 μg/mL作為受試物質(zhì)量濃度進行后續(xù)實驗。

2.3 Hm-FUC對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響

圖3 Hm-FUC對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響Fig. 3 Effect of Hm-FUCs on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes

油紅O可以特異性結(jié)合甘油三酯[20]。染色結(jié)果如圖3所示，經(jīng)誘導(dǎo)分化后，對照組中近90%脂肪細胞可與油紅O染料結(jié)合，表明3T3-L1細胞分化率高；而Hm-FUC對脂肪細胞的分化成熟有明顯的抑制作用，受試物組細胞內(nèi)甘油三酯含量減少，其中Hm3效果尤為顯著。油紅O半定量結(jié)果進一步證明了上述結(jié)果，經(jīng)Hm1、Hm2、Hm3和Hm4處理后，3T3-L1細胞的分化率分別下降了9.14%、20.05%、21.15%和8.73%（P＜0.05，P＜0.01）。上述結(jié)果表明，4 種Hm-FUC均可不同程度地抑制3T3-L1細胞分化，其中Hm3（210 kDa，無規(guī)卷曲短鏈構(gòu)象）活性最強。

2.4 Hm-FUC對脂肪細胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子mRNA表達的影響

圖4 Hm-FUC對脂肪細胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達的影響Fig. 4 Effect of Hm-FUCs on mRNA expression of key genes related to adipocyte differentiation in 3T3-L1 preadipocytes

C/EBPα、PPARγ和SREBP1c是調(diào)控脂肪細胞分化過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[21-22]。由圖4可知，與對照組相比，Hm1、Hm2、Hm3和Hm4均能在轉(zhuǎn)錄水平上顯著下調(diào)C/EBPα、PPARγ和SREBP1c的表達，表明4 種Hm-FUC均可以抑制脂肪細胞分化關(guān)鍵基因的mRNA表達，且低分子質(zhì)量Hm-FUC優(yōu)于高分子質(zhì)量原糖，其中Hm3效果最優(yōu)。

2.5 Hm-FUC對經(jīng)典Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵基因mRNA表達的影響

圖5 Hm-FUC對Wnt/β-catenin通路上游關(guān)鍵基因mRNA表達的影響Fig. 5 Effect of Hm-FUCs on mRNA expression of key genes in Wnt/β-catenin signaling pathway in 3T3-L1 preadipocytes

Wnt/β-catenin信號通路是負調(diào)控脂肪細胞分化的經(jīng)典通路[23]。如圖5所示，Hm1、Hm2、Hm3和Hm4均可在轉(zhuǎn)錄水平上顯著上調(diào)膜受體Frz以及LRP5/6輔助受體的表達（P＜0.05，P＜0.01），并下調(diào)Wnt通路重要負調(diào)控因子GSK3β的表達（P＜0.05，P＜0.01），但對Wnt10b的表達無顯著性影響。

圖6 Hm-FUC對β-catenin及其靶基因cmyc和CCND1基因mRNA表達的影響Fig. 6 Effect of Hm-FUCs on mRNA expression of β-catenin and its target genes cmyc and CCND1 in 3T3-L1 preadipocytes

此外，由圖6可知，Hm1、Hm2、Hm3和Hm4均可顯著上調(diào)β-catenin及其靶基因cmyc和CCND1的mRNA表達（P＜0.05，P＜0.01）。上述結(jié)果提示，不同高級結(jié)構(gòu)的Hm-FUC均能顯著上調(diào)Wnt/β-catenin通路，其中Hm3（210 kDa，無規(guī)卷曲短鏈構(gòu)象）效果最優(yōu)。

3 討 論

本實驗在體外水平對不同高級結(jié)構(gòu)Hm-FUC調(diào)控脂肪細胞分化的活性及其機制進行了研究。結(jié)果表明，4 種Hm-FUC均可顯著抑制脂肪細胞分化，其中Hm3（210 kDa，無規(guī)卷曲短鏈構(gòu)象）活性最強。

脂肪細胞分化過程受一系列轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，主要包括PPARγ、SREBP1c和C/EBPα。Hwang等[24]證實秋葵葉提取物通過下調(diào)PPARγ和C/EBPα等關(guān)鍵脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子的表達來抑制脂肪形成。Jeong等[25]發(fā)現(xiàn)通過誘導(dǎo)SREBP-1c蛋白磷酸化，抑制其向核內(nèi)轉(zhuǎn)位并與靶基因結(jié)合，從而減少脂肪生成基因表達和細胞內(nèi)脂質(zhì)積累。本實驗中，Hm-FUC能顯著下調(diào)SREBP-1c、PPARγ、C/EBPα的mRNA表達，表明Hm-FUC通過抑制脂肪細胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達，下調(diào)下游脂肪特異性基因的表達，從而抑制脂肪細胞分化。

Wnt配體（如Wnt6、Wnt10a和Wnt10b）可與細胞膜上Frz受體及LRPs輔助受體結(jié)合激活Wnt/β-catenin通路[26]。當Wnt信號被激活時，β-catenin得以在細胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定積累，進而移至核內(nèi)，與TCF/LEF相互作用，調(diào)節(jié)下游靶基因CCND1和cmyc的表達。CCND1和cmyc通過合成組蛋白去乙?；负鸵种艭/EBPα活性進而抑制PPARγ功能，最終抑制脂肪生成[27-28]。本研究中，4 種Hm-FUC均可在轉(zhuǎn)錄水平上顯著上調(diào)Wnt通路關(guān)鍵基因表達，但對Wnt10b的mRNA表達無顯著影響。Wnt10b為一類分泌蛋白，而本研究尚未對Wnt10b的蛋白表達進行測定。此外，Lee等[29]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可以激活Wnt/β-catenin通路而Wnt10b表達無顯著變化。Hm-FUC通過激活Wnt/β-catenin通路，抑制脂肪細胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα表達，從而抑制脂肪分化。

分子質(zhì)量變化對多糖生物活性有著重要影響。Bhadja等[30]證實了低分子質(zhì)量降解海藻多糖對受損HK-2細胞的修復(fù)活性優(yōu)于未降解多糖；王鳳舞等[31]在衰老模型小鼠上進行了研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過酶解的巖藻低聚糖相比于巖藻聚糖硫酸酯表現(xiàn)出更優(yōu)越的抗氧化活性，清除羥自由基效果更好。本研究結(jié)果表明，酶解后的低分子質(zhì)量Hm-FUC對脂肪生成的抑制效果優(yōu)于原糖，且隨著Mw降低，效果增強；但當分子質(zhì)量降到一定程度，抑制脂肪生成效果反而減弱，表明Hm-FUC的分子質(zhì)量與其抑制脂肪生成活性之間為非線性關(guān)系。Xu Zhou等[32]從油茶籽餅多糖中分離出分子質(zhì)量為7.9、36、83 kDa和225 kDa的低分子質(zhì)量多糖，其中分子質(zhì)量為36 kDa時清除自由基能力最強，優(yōu)于其他分子質(zhì)量多糖。這與本研究結(jié)果是一致的，分子質(zhì)量過大或過小都不利于多糖生物活性的發(fā)揮。

鏈構(gòu)象是不同分子質(zhì)量多糖表現(xiàn)出活性差異的一個重要因素，且目前相關(guān)研究主要集中在鏈形態(tài)和主鏈柔順性上。巖藻聚糖硫酸酯內(nèi)切酶CZ1127 Fucoidanase可以特異性切割α-L-Fucp2(OSO3-)-(1→3)-α-L-Fucp之間的α(1→3)-糖苷鍵[33]，在分子質(zhì)量降低過程中，Hm-FUC分子鏈不斷變短，同時分子的負電性降低，當分子質(zhì)量降到一定程度時，轉(zhuǎn)化為球形構(gòu)象。朱玉婕[34]研究了3 種SC-FUC分子質(zhì)量和鏈構(gòu)象與改善胰島素活性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與球形構(gòu)象相比，當SC-FUC為無規(guī)卷曲鏈構(gòu)象時改善胰島素抵抗的效果更好。Xu Xiaoqi等[35]的研究證明了梅花參巖藻聚糖硫酸酯球形構(gòu)象對胃黏膜的保護作用優(yōu)于無規(guī)卷曲構(gòu)象。在本研究中，當Hm-FUC多糖由無規(guī)卷曲鏈構(gòu)象轉(zhuǎn)化為球形鏈構(gòu)象時，抑制脂肪細胞分化活性減弱。通過酶切的作用，Hm-FUC的αs參數(shù)隨Mw的降低而下降，說明Hm-FUC原糖的半剛性鏈被打散，多糖鏈構(gòu)象趨于松散、柔順。本研究中，在無規(guī)卷曲鏈構(gòu)象范圍內(nèi)，隨著主鏈柔順性增加，Hm-FUC的抑制脂肪生成活性增強。上述研究表明，Hm-FUC分子質(zhì)量變化引起的鏈構(gòu)象變化是其活性改變的重要原因，可能是脂肪細胞對不同鏈形態(tài)的敏感度不同，因此鏈構(gòu)象的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致了其活性的變化；而當多糖鏈形態(tài)相同時，主鏈的柔順性在一定程度上影響其生理活性，但多糖鏈構(gòu)象差異影響其活性的內(nèi)在原因還需要通過進一步實驗深入探究。

綜上所述，Hm-FUC可以抑制脂肪細胞分化，該作用是通過Wnt/β-catenin通路實現(xiàn)的。在100～4 000 kDa分子質(zhì)量范圍內(nèi)，210 kDa、無規(guī)卷曲短鏈構(gòu)象的Hm-FUC抑脂活性最強。本實驗研究了Hm-FUC高級結(jié)構(gòu)與其抑制脂肪細胞分化活性之間的關(guān)系，為Hm-FUC的高效利用和深度開發(fā)提供了理論依據(jù)。