李 卓，田迎櫻，李雪靜，于 朋，王靜鳳,*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東 青島 266000）

骨折是由外力作用、骨骼疾病等引起的骨或骨小梁的連續(xù)性中斷，容易造成骨折延遲愈合或不愈合的現(xiàn)象。有統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，長骨開放性骨折后，17%的患者出現(xiàn)骨不連現(xiàn)象，另有8%患者的骨骼出現(xiàn)延遲愈合，嚴(yán)重影響患者健康及日常生活[1]。骨折延遲愈合引起的高致殘率與I型糖尿病、中風(fēng)或獲得性免疫缺陷征對患者產(chǎn)生的影響相當(dāng)[2]。目前還沒有被批準(zhǔn)的藥物用于加速骨折愈合或治療骨不連[3]。臨床上常采用物理和基因治療的方法治療骨折，但是這些方法價格昂貴，也有可能出現(xiàn)副作用，所以人們期望采取膳食治療的方法輔助臨床治療，加快患者骨折愈合速度；因此，通過膳食治療來加快骨折愈合逐漸成為研究熱點(diǎn)。

南極磷蝦資源開發(fā)應(yīng)用前景廣闊，除蘊(yùn)藏量豐富之外，南極磷蝦還具有高營養(yǎng)價值，被譽(yù)為巨大的蛋白質(zhì)庫[4]。有研究表明，相比陸生生物體內(nèi)提取難度大且含量極低的生物活性肽，南極磷蝦蛋白是一類生物價優(yōu)于肉類蛋白和牛奶蛋白的優(yōu)質(zhì)蛋白[5]。隨著生物活性肽的高效利用在營養(yǎng)和食品科學(xué)領(lǐng)域中逐漸受到關(guān)注，通過酶解手段制備具有生物活性的南極磷蝦多肽，可進(jìn)一步擴(kuò)展南極磷蝦資源的開發(fā)利用空間[6]。有文獻(xiàn)表明南極磷蝦肽（peptides from Antarctic krill，AKP）具有抗疲勞[7]、抗氧化[8]、降血壓[9]等活性，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)酶解產(chǎn)生的低氟AKP[10]和磷酸化磷蝦肽[11]可以有效調(diào)節(jié)去卵巢大鼠體內(nèi)的骨穩(wěn)態(tài)，且能通過激活BMP2/Smads和Wnt/β-catenin分子途徑促進(jìn)骨形成[12]，改善老年性骨質(zhì)疏松癥，而骨形成對橋接愈傷組織的穩(wěn)定性至關(guān)重要，但有關(guān)AKP調(diào)節(jié)骨折愈合及其機(jī)制的研究尚鮮見報道。本實(shí)驗(yàn)以AKP為研究對象，研究其對小鼠骨折愈合過程的促進(jìn)作用及相關(guān)機(jī)制，以期為南極磷蝦蛋白的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雌 性C 5 7 B L / 6 小 鼠 （ S P F 級 別 ， 體 質(zhì) 量（20.00±2.50）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0001。

脫脂南極磷蝦粉購于遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)。

蛋白聚糖Aggrecan、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、I型膠原蛋白（collagen type I，Col1α）、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 美國R&D公司；UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒、隨機(jī)引物 上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 美國Promega公司；dNTP Mixture 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；成軟骨分化轉(zhuǎn)錄因子（SRY-related HMG-box，SOX9）、X型膠原蛋白（collagen type X，Col10α）、TGF-β等檢測基因引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-20M高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司；1200型液相色譜儀、10/300 GL色譜柱 美國Agilent Technologies公司；HZ-TQG-10L低溫噴霧干燥機(jī) 上海雅程儀器公司；Model 680型酶標(biāo)儀美國Bio-Rad公司；微型電子計算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）系統(tǒng) 瑞士Scanco Medical AG公司；WGP-300型隔水式恒溫培育箱 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；BH-2型顯微鏡 日本Olympus公司；Ultra Trurrax T18 basic型高速勻漿機(jī) 德國IKA公司；Light Cycler 96 Instrument實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 AKP的制備

參照薛長湖等[13]的方法制備AKP。將脫脂南極磷蝦粉與水按1∶10（m/V）配成均勻溶液（pH 7.5），按1∶50（m/V）加入中性蛋白酶，50 ℃酶解6 h，100 ℃水浴使酶失活，酶解反應(yīng)終止，4 500 r/min離心20 min取上清液。0.3 mol/L鹽酸清洗脫氟，靜置后4 500 r/min離心20 min取上清液，經(jīng)噴霧干燥即得AKP。凝膠排阻色譜法測得AKP分子質(zhì)量主要分布在400～2 000 Da，凝膠色譜條件：流動相為體積分?jǐn)?shù)30%乙腈（0.1%三氟乙酸），樣品質(zhì)量濃度為5 g/L，進(jìn)樣量為50 μL，流速為0.5 mL/min，紫外檢測波長為220 nm；參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定 凱氏定氮法》測定AKP中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.4%；參照李紅艷[14]的方法采用氟離子選擇電極法測得AKP中氟含量為1.66 mg/kg。

1.3.2 動物分組及骨折模型建立

70 只健康小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，體積分?jǐn)?shù)4%水合氯醛麻醉，于右脛中上1/3處進(jìn)行脛骨開放性骨折手術(shù)。術(shù)后存活小鼠隨機(jī)分為：骨折模型組（Model，生理鹽水）、AKP低劑量組（AKP-L，200 mg/kg mb）、AKP高劑量組（AKP-H，400 mg/kg mb），每組21 只。骨折術(shù)后第一天立即灌胃受試動物，每天一次，灌胃量均為10 mL/kgmb。分別在術(shù)后5、10、21 d，每組取7 只小鼠禁食不禁水8 h后摘眼球取血，分離血清用于相關(guān)指標(biāo)的測定，取3 只右脛骨痂，快速剔除肌肉和筋膜組織用于組織形態(tài)學(xué)觀察，取剩余4 只右脛骨痂于-80 ℃保存，用于測定軟骨內(nèi)骨化過程關(guān)鍵基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

1.3.3 骨痂組織形態(tài)學(xué)觀察

取5、10、21 d小鼠右脛骨痂，置于體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛中固定24 h，于體積分?jǐn)?shù)8%乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH 7.3）中脫鈣3～4 周，每隔一周更換一次脫鈣液。脫鈣完成后，常規(guī)石蠟包埋切片（厚7 μm），進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，顯微鏡監(jiān)測骨痂組織形態(tài)變化過程。

1.3.4 CT分析

骨折術(shù)后21 d，取下髓內(nèi)針，用微型CT系統(tǒng)以70 kV的電壓和114 μA的電流掃描小鼠右脛骨，掃描區(qū)域?yàn)楣钦劬€近端3 mm和遠(yuǎn)端3 mm之間。使用匹配軟件中的骨骼分析庫功能計算形態(tài)參數(shù)（骨小梁數(shù)、骨體積/組織體積和骨小梁間距），用Image J軟件分析2D CT圖像獲得骨痂組織橫切面，直接測量最長直徑（a）和最短直徑（b）以評估愈傷組織的尺寸。

1.3.5 血清生化指標(biāo)測定

參照ELISA試劑盒說明書檢測不同時期小鼠血清Aggrecan、TGF-β、VEGF、Col1α的質(zhì)量濃度。

1.3.6 qPCR分析

取5、10、21 d小鼠右脛骨痂，按照總RNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取，每個樣本取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照qPCR Mastermix說明書添加各反應(yīng)物，在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。所用目的基因引物序列見表1，以β-actin作為內(nèi)參校正。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time polymerase chain reaction of different genes

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用最小顯著性差異法進(jìn)行組間比較，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AKP對軟骨性骨痂形成的影響

圖1 術(shù)后5 d骨痂組織切片HE染色（10×、20×）Fig. 1 Hematoxylin-eosin (HE) staining of the callus on day 5 post-surgery (10 ×, 20 ×)

如圖1所示，骨折術(shù)后5 d，模型組骨折斷裂端間隙大，只有少許炎性細(xì)胞及未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，斷裂處尚未形成纖維骨痂。與模型組相比，灌胃AKP后，低劑量組骨折斷裂處的炎性細(xì)胞及間充質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，有利于纖維骨痂的形成；高劑量組能夠更快地度過炎癥期，血腫更快演變成纖維結(jié)締組織，使兩個斷裂端初步連接在一起，并已出現(xiàn)少許成熟的軟骨細(xì)胞，有利于軟骨性骨痂的形成，且效果明顯優(yōu)于低劑量組。

2.2 AKP對軟骨性骨痂向骨性骨痂轉(zhuǎn)變的影響

圖2 術(shù)后10 d骨痂組織切片HE染色（10×、20×）Fig. 2 HE staining of the callus on day 10 post-surgery (10 ×, 20 ×)

如圖2所示，骨折術(shù)后10 d，各組均處在軟骨痂期。模型組的軟骨細(xì)胞大多為未成熟且排列緊密的幼稚軟骨細(xì)胞，尚未出現(xiàn)成熟肥大、礦化的軟骨細(xì)胞。灌胃AKP后，低劑量組骨折周圍軟骨細(xì)胞多為成熟的肥大軟骨細(xì)胞，且出現(xiàn)少量礦化新骨；高劑量組軟骨細(xì)胞面積明顯減少，且有大量骨小梁及新生血管出現(xiàn)，礦化凋亡更明顯。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AKP的干預(yù)以劑量依賴性的方式促進(jìn)軟骨性骨痂向骨性骨痂轉(zhuǎn)變，在術(shù)后中期（10 d）能不同程度地促進(jìn)軟骨細(xì)胞的肥大礦化和骨折愈合。

2.3 AKP對板層骨的形成及硬骨痂重塑的影響

骨折術(shù)后21 d，各組均處在硬骨痂期，此時模型組的骨痂為松散的編織骨，排列不規(guī)則，骨細(xì)胞數(shù)量多、體積大、不成熟（圖3A1）；灌胃AKP后，低劑量組編織骨面積明顯增加，形成了更密集的骨組織（圖3A2）；高劑量組的骨細(xì)胞趨于成熟，體積小、數(shù)量少，能形成更致密、更厚實(shí)的骨組織，并已經(jīng)向板層骨轉(zhuǎn)化（圖3A3），AKP的干預(yù)可以在骨折后期（21 d）促進(jìn)新骨生成并由編織骨向板層骨轉(zhuǎn)化。

圖3 術(shù)后21 d骨痂組織切片HE染色（A）、骨痂3D微結(jié)構(gòu)（B）及骨骼形態(tài)參數(shù)（C）分析圖Fig. 3 HE staining (A), 3D micro-CT testing (B) and morphological parameter (C) analysis of the callus on day 21 post-surgery

為進(jìn)一步觀察硬骨痂骨量和微結(jié)構(gòu)的變化，對骨折術(shù)后21 d的骨痂進(jìn)行了三維掃描。結(jié)果如圖3B所示，模型組愈合緩慢，小梁骨骨質(zhì)稀疏，且皮質(zhì)骨尚未形成完整的結(jié)構(gòu)。低、高劑量組骨痂形態(tài)更好，皮質(zhì)骨更光滑。相比于模型組，低劑量組的骨體積/組織體積和骨小梁數(shù)分別極顯著增加了12.54%和18.00%（P＜0.01），骨小梁間距顯著減少了14.29%（P＜0.05）；高劑量組的骨體積/組織體積和骨小梁數(shù)分別極顯著增加了45.44%和22.10%（P＜0.01），骨小梁間距極顯著減少了17.31%（P＜0.01），高劑量AKP干預(yù)生成的骨體積/組織體積更大，骨小梁間距更低（圖3C），即AKP干預(yù)可顯著促進(jìn)骨痂重塑（P＜0.05）。

CT掃描結(jié)果見圖4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了骨痂的成熟度（圖4A），即骨痂的白色越深表明骨痂的礦化越明顯，即AKP具有劑量依賴效應(yīng)地促進(jìn)骨痂礦化。此外，AKP干預(yù)能顯著減小骨痂尺寸（圖4B），與模型組相比，低、高劑量組骨痂截面的最長直徑分別極顯著減少了12.85%、37.56%，最短直徑分別極顯著減少了16.27%、38.28%（P＜0.01）。

圖4 術(shù)后21 d骨痂二維掃描分析（A）及骨痂尺寸（B）Fig. 4 Micro-CT testing (A) and size (B) of the callus on day 21 post-surgery

2.4 AKP對骨折愈合血清指標(biāo)的影響

Aggrecan標(biāo)志著軟骨基質(zhì)的形成；TGF-β是轉(zhuǎn)化生長因子超家族中的一員，在軟骨形成過程中具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化和成熟的作用[15]。骨折術(shù)后第10天，與模型組相比，AKP干預(yù)顯著降低了血清Aggrecan質(zhì)量濃度（P＜0.05），低、高劑量組分別降低了15.68%、16.22%（圖5A）；血清TGF-β的質(zhì)量濃度極顯著升高（P＜0.01），低、高劑量組分別升高了5.69%、10.45%（圖5B）。說明AKP的干預(yù)有促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成、軟骨細(xì)胞分化成熟的作用，使其提前度過軟骨基質(zhì)合成高峰期，向軟骨細(xì)胞成熟與礦化邁進(jìn)。

VEGF是血管生成誘導(dǎo)因子，Col1α是新骨生成的標(biāo)志[16]。各組VEGF質(zhì)量濃度均在術(shù)后第10天達(dá)到最高水平；術(shù)后第21天，高劑量組血清VEGF質(zhì)量濃度較模型組極顯著降低了21.45%（P＜0.01）（圖5C），同時高劑量組中Col1α質(zhì)量濃度較模型組極顯著增加了15.5%（P＜0.01）（圖5D），表明AKP在愈合中后期較模型組可更早地進(jìn)行血管重建從而促新骨生成，且高劑量AKP效果優(yōu)于低劑量AKP。

圖5 AKP對骨折愈合過程中血清生化指標(biāo)的影響Fig. 5 Effect of AKP on serum biochemical indicators

2.5 AKP對軟骨內(nèi)成骨過程關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響

SOX9是軟骨細(xì)胞形成早期重要的轉(zhuǎn)錄因子，Col10α是軟骨細(xì)胞肥大分化的標(biāo)志，二者轉(zhuǎn)錄水平的提高可刺激增殖或使預(yù)肥大的軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肥大軟骨細(xì)胞[17]。由圖6可知，與模型組相比，骨折術(shù)后第5天，高劑量組SOX9的mRNA相對表達(dá)水平極顯著提高了94.34%（P＜0.01）；骨折術(shù)后第10天，低、高劑量組SOX9的mRNA相對表達(dá)水平分別顯著提高了28.73%、142.62%（P＜0.05，P＜0.01），Col10α相對表達(dá)水平分別極顯著提高了84.37%、146.8%（P＜0.01）；骨折術(shù)后第21天，低、高劑量組SOX9的mRNA相對表達(dá)水平分別顯著降低了23.15%、45.37%（P＜0.05，P＜0.01），Col10α相對表達(dá)水平分別極顯著降低了83.3%、88.5%（P＜0.01），具有劑量依賴效應(yīng)。說明低、高劑量組的軟骨形成進(jìn)程均不同程度地領(lǐng)先于模型組，顯著加快了軟骨細(xì)胞的肥大和成熟，從而加快軟骨內(nèi)成骨進(jìn)程。

圖6 AKP對軟骨形成及肥大相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of AKP on mRNA transcription of cartilage formation-related factors

圖7 AKP對基質(zhì)降解及血管生成標(biāo)志物mRNA轉(zhuǎn)錄的影響Fig. 7 Effect of AKP on mRNA transcription of cartilage degradation and angiogenesis biomarkers

基質(zhì)降解與血管入侵是軟骨內(nèi)骨化過程的關(guān)鍵步驟?；|(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP13）是軟骨基質(zhì)降解的標(biāo)志性酶，促血管生成素1（angiopoietin 1，Ang1）是近年來發(fā)現(xiàn)的血管再生誘導(dǎo)因子，VEGF能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，是強(qiáng)有力的血管再生因子[18-19]。由圖7可知，模型組MMP13、VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄水平均在骨折術(shù)后第21天達(dá)到高峰，提示模型組基質(zhì)降解及血管生成速率較慢，骨折愈合進(jìn)程滯后。而經(jīng)AKP的干預(yù)在第10天可提高M(jìn)MP13、Ang1、VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄水平，其中高劑量組效果更顯著，較模型組分別極顯著提高了57.71%、34.69%和57.46%（P＜0.01），而在第21天MMP13、Ang1、VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。說明AKP干預(yù)后較模型組顯著加快了軟骨基質(zhì)的降解及新血管的生成，從而加速軟骨內(nèi)骨化進(jìn)程。

TGF-β能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，刺激成骨細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)（II型膠原、骨橋蛋白、I型膠原）的合成，Col1α和OCN是新骨生成的標(biāo)志基因[20]。由圖8可知，骨折術(shù)后第10天，AKP的干預(yù)可以提高TGF-β、Col1α和OCNmRNA的轉(zhuǎn)錄水平，且總體上高劑量組效果優(yōu)于低劑量組。提示模型組新骨生成進(jìn)程滯后，而AKP的攝入可以劑量依賴性地加快新骨生成速率，促進(jìn)骨折愈合。

圖8 AKP對骨形成相關(guān)因子mRNA轉(zhuǎn)錄的影響Fig. 8 Effect of AKP on mRNA transcription of bone formation-related factors

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用右脛開放性骨折模型，評估不同劑量AKP干預(yù)對小鼠骨折愈合過程的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，灌胃AKP可顯著加快骨折愈合早、中期成軟骨分化、軟骨增殖和肥大以及愈合后期的血管入侵、新骨形成，即AKP通過加速軟骨內(nèi)骨化過程，促進(jìn)小鼠骨折愈合。

骨折的愈合是骨的再生長過程，成骨過程包括膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨兩種方式[21]，其中軟骨內(nèi)成骨在長骨骨折愈合中起著重要作用[22]。軟骨內(nèi)成骨修復(fù)過程中，早期形成的軟骨細(xì)胞需經(jīng)歷增殖、分化、肥大凋亡過程，隨后無血管的軟骨組織通過軟骨基質(zhì)降解和血管侵襲轉(zhuǎn)變?yōu)檠茇S富的骨組織[23-24]，實(shí)現(xiàn)由軟骨性骨痂向硬骨性骨痂的轉(zhuǎn)變，重建骨折間隙，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)骨折愈合。

SOX9屬于成軟骨細(xì)胞分化因子，是促進(jìn)軟骨細(xì)胞發(fā)生和分化的重要轉(zhuǎn)錄因子[25]。Kostenuik等[26]證明在骨折愈傷組織中，與單純刺激成骨相比，較好的軟骨組織的形成對促進(jìn)骨折愈合十分有效。Murao等[27]發(fā)現(xiàn)，骨折誘導(dǎo)的SOX9陽性軟骨祖細(xì)胞能夠在骨折修復(fù)過程中分化為成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，從而直接進(jìn)行骨折修復(fù)，加快骨折愈合。有研究表明，在軟骨形成過程中，TGF-β可以誘導(dǎo)纖維連接蛋白和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的形成[28]，不僅可以活化骨祖細(xì)胞、刺激其增殖并向成骨細(xì)胞分化，還能誘導(dǎo)軟骨的形成及分化[29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AKP的干預(yù)可以劑量依賴性地上調(diào)愈合早、中期SOX9與TGF-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，組織學(xué)染色結(jié)果也表明其能促進(jìn)骨折早期軟骨組織的形成從而加快骨折愈合。

軟骨細(xì)胞肥大后，一般會伴隨著軟骨基質(zhì)的降解和血管的侵入，進(jìn)而為骨組織的形成釋放更大的空間[30]。血管生成是骨折愈合的重要組成部分，骨折部位血管生成不良常會導(dǎo)致骨折愈合延遲，其中Ang1屬于血管再生誘導(dǎo)因子，缺氧誘導(dǎo)因子-1α介導(dǎo)的VEGF表達(dá)是血管生成的關(guān)鍵因素。有研究表明，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體（uMSC-Exos）是通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)骨再生的作用[31]，這也側(cè)面印證了血管生成對骨折修復(fù)的重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高劑量AKP的干預(yù)對骨折中期血清VEGF質(zhì)量濃度及mRNA的轉(zhuǎn)錄均有顯著的促進(jìn)作用，血清VEGF的質(zhì)量濃度與mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨時間的延長而變化，均在骨折術(shù)后11 d達(dá)到頂峰隨后下降，提示AKP干預(yù)較模型組能夠促進(jìn)血管入侵，充足的血液供給能為骨折愈合提供多種細(xì)胞因子。

OCN與Col1α水平可以直觀反映骨形成的速率，通常臨床上認(rèn)為，當(dāng)骨痂不斷鈣化并加強(qiáng)，形成能夠抵抗肌肉收縮及旋轉(zhuǎn)力的橋接骨痂時則視為臨床愈合，而這個過程中新骨的形成扮演著重要角色[32]。AKP的干預(yù)不同程度地提高血清Col1α質(zhì)量濃度及mRNA轉(zhuǎn)錄水平，同時OCN的mRNA轉(zhuǎn)錄水平也顯著提高，這與組織學(xué)染色結(jié)果中的硬骨痂形成及愈合程度相對應(yīng)。CT結(jié)果也表明AKP的攝入可以劑量依賴性地改善骨微結(jié)構(gòu)，顯著提高骨體積/組織體積、骨小梁數(shù)目，降低骨小梁間距。提示AKP的干預(yù)能夠促進(jìn)骨痂礦化及骨重塑過程。

蛋白質(zhì)對正常骨生長至關(guān)重要，已有研究表明高蛋白飲食可以增加胰島素樣生長因子-1的分泌[33]，同時胰島素樣生長因子-1已被證實(shí)是軟骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[34]。牛乳蛋白中篩選出的具有骨保護(hù)作用的生物活性肽[35]和酪蛋白磷酸肽，在體外和體內(nèi)水平上都被證實(shí)具有促進(jìn)腸道鈣吸收的作用[36-37]。鮭魚皮明膠水解物也被證明能夠促進(jìn)hFOB 1.19（人SV40轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞）的增殖[38]。Hou Tao等[39]研究表明，攝入脫鹽的鴨蛋清肽后，可在體內(nèi)與鈣結(jié)合形成可溶的螯合物，被腸細(xì)胞吸收為小肽，同時與瞬時受體電位類香草酸6鈣通道的相互作用來調(diào)節(jié)腸細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)腸鈣的吸收從而調(diào)節(jié)骨代謝。

綜上，AKP能通過促進(jìn)軟骨形成及其肥大、促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解、血管入侵以及后期新骨生成來促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨進(jìn)程，從而加速正常生長的開放性骨折模型小鼠的骨折愈合。