郝 帥，李 爽，王 靜，劉媛璞，趙 磊，張佳雯，王成濤

（北京市食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

食用藻藍(lán)色素蛋白是一種安全的天然功能性食品，除了作為添加劑用于多種食品著色以外[1]，近年來，越來越多的證據(jù)表明，藻藍(lán)蛋白還具有抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗炎等多種生物學(xué)功能[2-6]。深入研究藻藍(lán)蛋白的生物活性及其調(diào)控機(jī)制，能夠?yàn)槠渖疃乳_發(fā)和利用提供重要的理論參考。

肺癌是目前我國第一大腫瘤疾病。工業(yè)廢氣、汽車尾氣的大量排放所造成的環(huán)境問題日益嚴(yán)重，是我國肺癌發(fā)生率逐年提高的重要誘導(dǎo)因素[7]。同時(shí)，隨著我國人口老齡化程度的加劇，自1998年到2015年，我國的肺癌發(fā)病率和死亡率始終保持不斷上升的趨勢(shì)，肺癌已經(jīng)成為危害我國居民健康的最主要的惡性腫瘤[8-9]。肺癌的病理分型可以分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中小細(xì)胞肺癌主要以H446、H524、H20等細(xì)胞系為典型代表，發(fā)病比例較低；非小細(xì)胞肺癌則主要包括肺鱗癌（H226等）、肺腺癌（LTEP-a2、A549、H1299等）和大細(xì)胞肺癌（H460等）三大亞類[10-12]。在近年來被診斷的肺癌病例中，約85%屬于非小細(xì)胞肺癌[13-14]。已有研究表明，藻藍(lán)蛋白對(duì)多種非小細(xì)胞肺癌具有生長(zhǎng)抑制作用，并且能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡和體外遷移[15-18]。但是，目前大部分的研究?jī)H針對(duì)于藻藍(lán)蛋白與單一細(xì)胞蛋白或宏觀的信號(hào)通路之間的關(guān)系，與細(xì)胞內(nèi)小分子的調(diào)控作用尚不明確。因此，深入探究藻藍(lán)蛋白對(duì)非小細(xì)胞肺癌的調(diào)控機(jī)理，可為其預(yù)防、診斷甚至治療提供新的思路和依據(jù)。

非編碼小RNA（microRNA，miRNA）是非編碼RNA的一類，大約由20 個(gè)左右的堿基組成高保守調(diào)控型的內(nèi)源性RNA[19-20]，在動(dòng)植物細(xì)胞中參與基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控作用，能夠通過靶向結(jié)合到生物體mRNA的3’非翻譯區(qū)上引起mRNA的降解或者翻譯抑制作用[21]。研究表明miRNA能夠作為原癌因子或抑癌因子在多種腫瘤細(xì)胞中參與調(diào)控作用，例如，miR-137能夠通過下調(diào)PAK2蛋白的表達(dá)而抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖[22]，miR-494能夠靶向抑制CDC20的表達(dá)而誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡[23]；此外，miR-125b則能夠分別在惡性血液病腫瘤和實(shí)體瘤中發(fā)揮原癌因子和抑癌因子的作用[24-25]。因此，miRNA對(duì)于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和調(diào)控具有至關(guān)重要的作用。目前，雖然在肺癌中也發(fā)現(xiàn)存在許多諸如miRNA-148a[26]、miR-21[27]、miR-17-92[28]等miRNA的調(diào)節(jié)，但藻藍(lán)蛋白抑制非小細(xì)胞肺癌過程中所參與的miRNA尚不明確，相關(guān)文獻(xiàn)也鮮有報(bào)道。本研究以典型的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系為模型，在藻藍(lán)蛋白處理后，采用高通量非編碼小RNA轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（miRNA-seq）分析潛在的差異miRNA，進(jìn)一步深入揭示藻藍(lán)蛋白對(duì)非小細(xì)胞肺癌的調(diào)控機(jī)制，為功能性藻藍(lán)蛋白的開發(fā)和利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人類非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，購于ATCC，由北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室保存。

藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 美國Envirologix公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基 美國Gibco公司；胎牛血清 天津康源生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒 北京天根生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱 德國Heraeus公司；漩渦振蕩儀德國IKA公司；超凈工作臺(tái) 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；數(shù)字型電子天平 德國Sartorius公司；CFX96Touch qPCR儀 美國Bio-Rad公司；Bioanalyzer2100核酸檢測(cè)儀 美國安捷倫公司；miRNA-seq高通量測(cè)序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、0.1 mg/mL鏈霉素以及100 units/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞每3～4 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 藻藍(lán)蛋白處理A549細(xì)胞

提前一天將細(xì)胞進(jìn)行傳代處理，細(xì)胞密度大約50%。第2天細(xì)胞完全貼壁后采用藻藍(lán)蛋白處理A549細(xì)胞，做3 個(gè)平行藻藍(lán)蛋白處理組與對(duì)照組（磷酸鹽緩沖液處理細(xì)胞）。處理后48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果中1～3號(hào)樣品為對(duì)照組；4～6號(hào)樣品為藻藍(lán)蛋白處理組。

1.3.3 RNA文庫構(gòu)建

采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，使用NanoDrop 2000測(cè)定RNA濃度，隨后對(duì)RNA的完整性進(jìn)行分析。采用小RNA建庫試劑盒進(jìn)行miRNA文庫構(gòu)建。

1.3.4 miRNA測(cè)序與序列分析

采用Illumina Hiseq 2000進(jìn)行miRNA的測(cè)序。對(duì)所獲得的原始序列進(jìn)行過濾，去除低質(zhì)量的序列；隨后去除5’端和3’端接頭序列、污染序列，以及小于18 nt和大于30 nt的序列，得到純凈序列。統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)度在16～27 bp的RNA序列長(zhǎng)度的分布情況，然后選取GenBank數(shù)據(jù)庫和Rfam數(shù)據(jù)庫分別注釋序列，盡可能發(fā)現(xiàn)并去除樣本中的rRNA、snRNA、scRNA等。最后通過基因組比對(duì)除去重復(fù)序列和mRNA的降解片段。

1.3.5 miRNA的鑒定與差異分析

通過比對(duì)miRbase中已經(jīng)收錄的miRNA，鑒定到的為已知miRNA；結(jié)合參考序列進(jìn)行發(fā)卡結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，鑒定到的為新的miRNA。結(jié)合miRNA在各樣本中的表達(dá)情況，得到全部miRNA的表達(dá)譜。將表達(dá)量變化2 倍以上且P＜0.05的miRNA定義為差異表達(dá)的miRNA。

1.3.6 miRNA的靶基因預(yù)測(cè)和功能富集

使用Pathmatch軟件進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)，然后對(duì)靶基因進(jìn)行人類基因組和NCBI數(shù)據(jù)庫注釋，以及基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。

1.3.7 qPCR驗(yàn)證miRNA的表達(dá)

對(duì)每一個(gè)檢測(cè)樣品需要將待檢測(cè)的miRNA與其內(nèi)參U6分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。根據(jù)RNA濃度計(jì)算2 μg所需要的體積，與DEPC混合至9 μL，每管中再分別加入2 μL的RT引物工作液（500 nmol/L），其中逆轉(zhuǎn)錄miRNA組中加入miRNA逆轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄U6組中加入U(xiǎn)6逆轉(zhuǎn)錄引物。70 ℃、10 min后立即置于冰上。隨后將第一步反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min，預(yù)冷至4 ℃。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后即可進(jìn)行miRNA的擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)miRNA時(shí)加入miRNA正向通用引物與Bulge-Loop miR反向通用引物，檢測(cè)U6時(shí)加入U(xiǎn)6正向引物與反向引物。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，其中P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻藍(lán)蛋白對(duì)A549細(xì)胞體外增殖活性的影響

首先利用不同濃度的藻藍(lán)蛋白（0、0.6、1.2、2.4、4.8 μmol/L）處理體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的存活率。由圖1A可知，隨著藻藍(lán)蛋白濃度的增大，細(xì)胞的存活率顯著降低，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，采用效果極顯著的藻藍(lán)蛋白濃度（4.8 μmol/L）進(jìn)行細(xì)胞處理實(shí)驗(yàn)。由圖1B可以發(fā)現(xiàn)，采用4.8 μmol/L的藻藍(lán)蛋白處理細(xì)胞，能夠顯著抑制A549細(xì)胞的體外增殖能力。以上結(jié)果表明藻藍(lán)蛋白對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯抑制效果，隨后對(duì)其具體的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入的測(cè)序分析。

圖1 藻藍(lán)蛋白對(duì)A549細(xì)胞體外增殖活性的影響Fig. 1 Effect of phycocyanin on in vitro proliferation of A549 cells

2.2 RNA樣品的質(zhì)量檢測(cè)

首先對(duì)藻藍(lán)蛋白處理后的細(xì)胞進(jìn)行了總RNA的提取，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序前的質(zhì)量檢測(cè)。圖2分別顯示了對(duì)照組（圖2A）和藻藍(lán)蛋白處理組（圖2B）的RNA完整性分析結(jié)果。結(jié)果顯示，RNA的18S和28S亞基均出現(xiàn)了完整的峰，且集中程度較高，初步提示了RNA結(jié)構(gòu)的完整性。此外，表1顯示了RNA質(zhì)量檢測(cè)的基本參數(shù)，結(jié)果表明，6 個(gè)樣品的RNA總量均超過了20 μg，OD260nm/280nm均大于1.8，RNA完整性參數(shù)（RNA integrity number，RIN）值均大于9，表明提取的RNA樣本結(jié)構(gòu)完整，沒有發(fā)生明顯降解，滿足miRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 RNA完整性檢測(cè)結(jié)果Fig. 2 Analysis of the integrity of RNA

表1 不同樣本RNA的質(zhì)量檢測(cè)數(shù)據(jù)Table 1 Quality evaluation of different RNA samples

2.3 sRNA的測(cè)序分析結(jié)果

表2 不同樣本中sRNA的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Statistical data of sRNA in different samples

miRNA-seq的測(cè)序結(jié)果不僅能提供miRNA的讀長(zhǎng)，還能提供其他類型RNA的相關(guān)信息。表2顯示了包括miRNA在內(nèi)的不同類型RNA的測(cè)序讀長(zhǎng)。結(jié)果顯示，除了已知miRNA（known miRNA）和未知的新預(yù)測(cè)miRNA（novel miRNA）以外，核糖體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、核仁小分子（snoRNA）、小核RNA（snRNA）、重復(fù)序列（repbase）、外顯子（exon）、內(nèi)含子（intron）以及未知的sRNA序列（unknown）都被測(cè)序出來。在對(duì)照組中，已知m i R N A 占所有sRNA測(cè)序讀長(zhǎng)的（42.53±6.56）%，新預(yù)測(cè)的miRNA則占（6.51±0.66）%；在藻藍(lán)蛋白處理組中，已知miRNA和新預(yù)測(cè)miRNA則分別占所有sRNA測(cè)序讀長(zhǎng)的（12.59±0.82）%和（3.06±0.09）%。雖然在測(cè)序讀長(zhǎng)信息上，對(duì)照組和藻藍(lán)蛋白處理組存在較大的差異，但二者在miRNA成熟體上均測(cè)序出了相近的數(shù)量（表3）。結(jié)果顯示，對(duì)照組和藻藍(lán)蛋白處理后，miRNA成熟體（包含已知miRNA和新預(yù)測(cè)的miRNA）數(shù)量均達(dá)到了1 000 條以上。以上研究結(jié)果表明，miRNA-seq成功地篩選出了一批潛在的miRNA，構(gòu)建了miRNA分析文庫，是進(jìn)一步尋找藻藍(lán)蛋白調(diào)控差異miRNA的基礎(chǔ)。

表3 不同樣本中miRNA成熟體數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of mature miRNAs in different samples

2.4 miRNA在不同樣本中的表達(dá)量分析結(jié)果

不同類型的miRNA在細(xì)胞中發(fā)揮著不同的生理功能，所占的比例也大不相同[29]。本研究分析了對(duì)照組和藻藍(lán)蛋白處理組中的miRNA豐度，篩選出了各樣本中表達(dá)量前10 位的miRNAs。圖3結(jié)果顯示，高豐度的新預(yù)測(cè)miRNA在不同樣本中的表達(dá)模式基本一致，其中豐度前5 位分別為：18_34113、20_36370、14_27440、22_37559以及16_30535，表明這些新預(yù)測(cè)的miRNA在藻藍(lán)蛋白處理前后較穩(wěn)定，可能不是藻藍(lán)蛋白主要的調(diào)控因子；相反，一些其他新預(yù)測(cè)的miRNA（例如17_31507）在藻藍(lán)蛋白處理組均有一定量的表達(dá)，但并沒有出現(xiàn)在對(duì)照組中，提示這一類新預(yù)測(cè)的miRNA可能受到了藻藍(lán)蛋白的影響，出現(xiàn)表達(dá)量的差異性變化。新的miRNA僅僅是測(cè)序信息的預(yù)測(cè)結(jié)果，具體是否可靠還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。此外，對(duì)于已知的miRNA，圖3結(jié)果顯示，6 個(gè)研究樣本中，高豐度的已知miRNA（例如miR-21-5p、miR-27b-3p等）均出現(xiàn)較一致的表達(dá)模式。并且有研究表明，miR-21-5p能夠通過靶向調(diào)控TGFBI和SMAD7抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[30-31]，miR-27b-3p也被報(bào)道在肺癌的發(fā)生過程中起到調(diào)控作用[32]。以上結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白在A549細(xì)胞中的調(diào)控很可能是作用于一些低豐度的特異性miRNA，因此，對(duì)不同處理的樣本進(jìn)行了差異miRNA的篩選分析，進(jìn)一步篩查藻藍(lán)蛋白可能調(diào)控的miRNA。

圖3 各樣本中表達(dá)量前10 位的miRNAsFig. 3 Top 10 most expressed miRNAs in each sample

2.5 差異miRNA的篩選分析結(jié)果

圖4 藻藍(lán)蛋白處理A549細(xì)胞后差異miRNA的火山分布圖Fig. 4 Volcano map of differentially expressed miRNAs in A549 cells after undergoing phycocyanin treatment

采用miRNA-seq高通量測(cè)序，對(duì)藻藍(lán)蛋白處理后的差異miRNA進(jìn)行了篩選分析。圖4結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白處理后，均有miRNA出現(xiàn)了上調(diào)或下調(diào)的表達(dá)。通過統(tǒng)計(jì)分析，共有136 個(gè)差異miRNA被篩選出來，其中藻藍(lán)蛋白處理后顯著上調(diào)的miRNA有74 個(gè)，顯著下調(diào)的miRNA有62 個(gè)。表4顯示了樣本間差異程度最高的19 個(gè)已知miRNA。由分析結(jié)果可以看出，miR-4521、miR-27b-5p、miR-7974、miR-574-5p等在藻藍(lán)蛋白處理A549細(xì)胞后表達(dá)量出現(xiàn)顯著下調(diào)；而miR-4485-3p、miR-146a-5p、miR-27a-5p、miR-93-5p等的表達(dá)量則在藻藍(lán)蛋白處理后出現(xiàn)了明顯上調(diào)。有研究表明，miR-4521對(duì)人類慢性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)生和發(fā)展有調(diào)控作用[33]，但對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)還沒有明確的報(bào)道；而miR-27a-5p、miR-93-5p等則被發(fā)現(xiàn)對(duì)肺癌細(xì)胞有一定的抑制作用[34-35]。Zhou Rui等報(bào)道m(xù)iR-574-5p能夠通過PTPRU促進(jìn)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[36]，而本研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白處理肺癌細(xì)胞后miR-573-5p出現(xiàn)了明顯的下調(diào)表達(dá)，這與已知的文獻(xiàn)報(bào)道一致。

表4 不同樣本間差異程度最高的19 個(gè)已知miRNATable 4 Top 19 most differentially expressed known miRNAs in different samples

隨后對(duì)這些差異miRNA進(jìn)行了子聚類分析，圖5顯示，根據(jù)各樣本中差異miRNA表達(dá)模式的不同，這些miRNA可以聚類為4 類：與對(duì)照組相比，顯著下調(diào)表達(dá)的miRNA（A類）、極顯著下調(diào)表達(dá)的miRNA（B類）、顯著上調(diào)表達(dá)的miRNA（C類）以及極顯著上調(diào)表達(dá)的miRNA（D類）。本研究通過miRNA-seq篩選出了一批藻藍(lán)蛋白處理后差異性表達(dá)的miRNA，這些差異miRNA的發(fā)現(xiàn)為研究藻藍(lán)蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的調(diào)控機(jī)制提供了重要的理論參考。

圖5 差異miRNA的不同表達(dá)模式分析Fig. 5 Expression pattern analysis of differentially expressed miRNAs in different samples

2.6 差異miRNA的驗(yàn)證

對(duì)篩選得到的幾個(gè)代表性的差異miRNA進(jìn)行了qPCR的生物學(xué)驗(yàn)證。圖6結(jié)果顯示，藻藍(lán)蛋白處理A549細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，miR-4521、miR-27b、miR-7974、miR-574的表達(dá)量均出現(xiàn)顯著下調(diào)；miR-4485、miR-146、miR-27a以及miR-93的表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào)，此結(jié)果與miRNA-seq的測(cè)序結(jié)果是一致的，進(jìn)一步證實(shí)了這些差異miRNA確實(shí)受到了藻藍(lán)蛋白的影響，可能在藻藍(lán)蛋白抑制非小細(xì)胞肺癌過程中起到調(diào)控作用。

圖6 部分差異miRNA的qPCR驗(yàn)證Fig. 6 qPCR analysis of some differentially expressed miRNAs

2.7 miRNA的靶基因功能分析結(jié)果

圖7 miRNA靶基因的GO功能注釋分析Fig. 7 GO annotations analysis of target genes for miRNAs

使用miRanda軟件對(duì)篩選出的miRNA進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)分析，共預(yù)測(cè)得到了5 186 個(gè)潛在的靶基因。首先對(duì)這些靶基因進(jìn)行了GO注釋分析，結(jié)果如圖7所示。GO注釋可將基因分為三大類：生物過程、細(xì)胞組分和分子功能。在生物過程中，靶基因功能主要集中在代謝調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等；在細(xì)胞組分和分子功能中，主要集中在分子相互作用以及酶催化活性等。GO功能注釋提供了靶基因的功能分類，但缺乏具體的功能信息，因此，為全面分析受到藻藍(lán)蛋白調(diào)控miRNA靶基因的功能，又對(duì)這些基因進(jìn)行了GO富集分析（圖8）。結(jié)果顯示，細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的許多生物學(xué)過程都在GO富集分析中出現(xiàn)顯著性差異，主要包括細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的調(diào)控過程、細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控過程、細(xì)胞骨架系統(tǒng)形態(tài)發(fā)生過程等。藻藍(lán)蛋白對(duì)A549細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，而GO富集分析中細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程與本研究相一致，進(jìn)一步表明了測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在預(yù)測(cè)的靶基因中，p21激活磷酸激酶4（p21 activated kinase 4，PAK4）在細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖過程中參與重要的調(diào)控作用，是miR-6721-5p的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)；分裂原激活的蛋白激酶13（mitogen-activated protein kinase 13，MAPK 13）參與了細(xì)胞有絲分裂過程信號(hào)調(diào)控的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，是miR-5008-5p的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)；Ras作為一種重要的GTP結(jié)合蛋白，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞骨架和蛋白運(yùn)輸都有重要的影響，研究篩選得到的Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族10蛋白（Ras association domain family member 10，RASSF10）被預(yù)測(cè)為miR-4769-3p的靶基因，也是藻藍(lán)蛋白抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)可能的一條重要途徑。

圖8 miRNA靶基因的GO富集分析Fig. 8 GO enrichment analysis of target genes for miRNAs

3 結(jié) 論

本研究以高通量miRNA轉(zhuǎn)錄組技術(shù)為研究手段，對(duì)藻藍(lán)蛋白處理后的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序分析。結(jié)果表明，已知和新預(yù)測(cè)的大量miRNA都被測(cè)序出，并且在不同的處理樣本中具有不同的表達(dá)模式；通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析篩選得到了136 個(gè)表達(dá)差異的miRNA，其中藻藍(lán)蛋白處理后顯著上調(diào)的miRNA有74 個(gè)，顯著下調(diào)的miRNA有62 個(gè)。根據(jù)這些差異miRNA在不同樣本中的表達(dá)情況，可以聚類為4 類不同的表達(dá)模式；qPCR對(duì)這些miRNA進(jìn)行表達(dá)量的驗(yàn)證，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相吻合；此外，miRNA潛在靶基因的GO注釋和功能富集分析結(jié)果顯示，與細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控過程相關(guān)的靶基因例如Pak4、Mapk13、Rassf10等均被預(yù)測(cè)為差異miRNA的全新靶點(diǎn)，可能在藻藍(lán)蛋白抑制非小細(xì)胞肺癌增殖過程中起到重要的調(diào)控作用。不同于傳統(tǒng)的mRNA測(cè)序，本研究采用小分子miRNA測(cè)序技術(shù)探究了藻藍(lán)蛋白抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制，為抗腫瘤類功能食品因子的利用提供了理論依據(jù)，同時(shí)為非小細(xì)胞肺癌的靶向治療提供了重要的理論參考。