呂一品，唐 雪，李博文，葛月婷，楊紹軍，張 凱，馬淑華

（江南大學(xué)食品學(xué)院，食品營(yíng)養(yǎng)與功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇 無(wú)錫 214122）

酪蛋白廣泛存在于食品加工體系中，加工過(guò)程中極易氧化生成雙酪氨酸（dityrosine，DT）、3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）和3-氯酪氨酸等酪氨酸氧化產(chǎn)物（tyrosine oxidation product，OTP）[1]，其中DT常被作為判斷食品蛋白質(zhì)氧化程度的標(biāo)準(zhǔn)[2]。在市售牛奶[3]、噴霧干燥奶粉[4]以及肉類模型系統(tǒng)[5]中均可檢測(cè)到OTP和DT存在。食源性O(shè)TP會(huì)造成食品品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低[6]，且OTP化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對(duì)酸解和蛋白酶水解過(guò)程具有抵抗性，可完整地被腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)，在組織細(xì)胞中蓄積。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠長(zhǎng)期飼喂含OTP和DT日糧均可造成血液、肝、腎DT累積，自由基含量升高，引起脂代謝紊亂和脂質(zhì)積累，導(dǎo)致肝腎功能損傷及纖維化病變[7]。Ding Yinyi等結(jié)合動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)OTP、DT導(dǎo)致胰島素分泌顯著降低，引起糖代謝異常和胰腺細(xì)胞凋亡，具有較強(qiáng)的促氧化能力，對(duì)人體健康具有潛在危害[8]。然而攝入的食源性O(shè)TP如何影響機(jī)體能量代謝，導(dǎo)致組織器官氧化損傷和功能紊亂，其相關(guān)作用機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步研究。

心臟作為機(jī)體最重要的器官之一，為血液流動(dòng)提供動(dòng)力，對(duì)能量和氧的需求量極高。線粒體作為ATP產(chǎn)生和自由基生成的主要細(xì)胞器，其結(jié)構(gòu)改變、數(shù)量減少及ATP生成不足是導(dǎo)致心室功能障礙、心臟衰竭等疾病發(fā)生的基礎(chǔ)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)氧化后不僅影響了心臟對(duì)氨基酸的利用，且血液氧化蛋白產(chǎn)物累積與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，可作為判斷缺血性心臟病的特異性指標(biāo)[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)OTP可引起大鼠心肌纖維斷裂溶解，線粒體腫大、形成空泡、嵴數(shù)量減少，出現(xiàn)心肌纖維和線粒體損傷[11]。然而，食品OTP攝入引起心肌損傷及線粒體功能異常的相關(guān)機(jī)制尚未明確，DT作為OTP的重要組分其氧化損傷機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。因此，本研究以生長(zhǎng)期小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探究食源性O(shè)TP和DT對(duì)小鼠心肌氧化還原穩(wěn)態(tài)、線粒體功能及能量代謝的影響，進(jìn)一步明確食源氧化蛋白作用機(jī)制，為完善食物蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)理論、減少現(xiàn)代食品加工對(duì)健康的危害提供有價(jià)值的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

3 周 齡S P F 級(jí) 雄 性C 5 7 B L/6 小 鼠3 0 只 ， 使 用許可證號(hào)：S Y X K（蘇）2 0 1 6-0 0 4 5，動(dòng)物合格證編號(hào)：20170005006323，實(shí)驗(yàn)倫理審核編號(hào)：JN.No20190330c0900820，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，晝夜循環(huán)光照12 h/12 h，自由進(jìn)食飲水，每周稱量并記錄體質(zhì)量。

酪氨酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；酪氨酸氧化產(chǎn)物根據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法制得；雙酪氨酸（dityrosine，DT）香港銳東生物科技公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、錳-超氧化物歧化酶（MnSOD）、總蛋白試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和ATP酶（ATPase）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；乙酰輔酶A、NADH、NAD+、C反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、DT酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)試劑盒 廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司；RNA提取試劑盒和引物 上海生工生物工程有限公司；OligdT、dNTP、RNase抑制劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶美國(guó)Thermo Fisher公司；Quantitect SYBR Green PCR Kits南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nano Drop分光光度計(jì)、M5酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Bio-Rad公司；5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司；微量移液器 德國(guó)Eppendorf公司；MPI-B型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀 西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司；電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；ETC811 PCR擴(kuò)增儀 東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及預(yù)處理

C57BL/6小鼠普通飼料適應(yīng)性預(yù)飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)組別為3 組，每組10 只：對(duì)照組（Con）、酪氨酸氧化產(chǎn)物組（OTP）和雙酪氨酸組（DT），各組每天分別灌胃420 μg/kgmb的酪氨酸溶液、1 909 μg/kgmb的OTP和420 μg/kgmb的DT溶液，連續(xù)35 d。本研究采用生長(zhǎng)期小鼠，在其3 周可離乳獨(dú)立生長(zhǎng)時(shí)開(kāi)始適應(yīng)性培養(yǎng)，之后灌胃35 d至其體成熟。較之前研究[8]縮短了灌胃周期，故提升DT灌胃劑量至420 μg/kgmb，實(shí)驗(yàn)所用的OTP中DT質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為22%，為保持兩組DT質(zhì)量分?jǐn)?shù)一致，將OTP灌胃劑量設(shè)為1 909 μg/kgmb。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后摘眼球取血至抗凝管內(nèi)，3 500 r/min、4 ℃離心10 min，取上層血漿，-80 ℃保存。小鼠斷頸處死后，在冰浴上迅速摘取心臟，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗后稱質(zhì)量，按下式計(jì)算心臟指數(shù)。

取0.05 g左右心肌組織加入生理鹽水勻漿制得體積分?jǐn)?shù)10%組織勻漿，3 500 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，-80 ℃保存。取0.05 g左右心肌組織置于TRIzol試劑中，-80 ℃保存用于總RNA的提取。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 ROS水平測(cè)定

新鮮取到的小鼠全血，采用luminol化學(xué)發(fā)光法測(cè)定[13]，用Origin 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)峰面積進(jìn)行積分，以單位體積下相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度表示活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。

1.3.2.2 氧化還原及心肌損傷指標(biāo)測(cè)定

T-AOC、CAT、GSH-Px、MDA、SOD、ATPase、DT、CRP、TNF-α水平的測(cè)定均按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.2.3 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

利用T R I z o l 法提取心肌組織中的總R N A，用Nano Drop分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度，對(duì)于A260nm/A280nm在1.8～2.0的合格樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定抗氧化，線粒體合成及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量，引物序列如表1所示。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)得各模板的Ct值，用2－ΔΔCt法計(jì)算，以β-actin為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行相對(duì)定量[14]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Sequences of primers used for real-time quantitative PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，運(yùn)用方差分析、Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行組間顯著性差異分析，P＜0.05表示組間有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸氧化產(chǎn)物對(duì)小鼠體質(zhì)量、心臟指數(shù)及心肌損傷相關(guān)指標(biāo)的影響

圖1 酪氨酸氧化產(chǎn)物對(duì)小鼠體質(zhì)量（A）和心臟指數(shù)（B）的影響（n＝ 10）Fig. 1 Effects of tyrosine oxidation products on body mass (A) and cardiac index (B) in mice (n = 10)

如圖1A所示，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，3 組體質(zhì)量在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但灌胃DT和OTP 35 d可顯著提高小鼠心臟指數(shù)（P＜0.05）。CRP是冠心病和全身炎癥的生物標(biāo)志物之一[15-16]，其水平在組織損傷、感染和其他炎癥刺激下升高[17]。TNF-α是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子，在抑制心肌收縮性、促進(jìn)心肌重構(gòu)、引起內(nèi)皮心肌細(xì)胞凋亡中起重要作用[18]。CK和LDH是心肌能量代謝過(guò)程中的重要酶，病理狀態(tài)下血漿CK和LDH活性的升高[19]。

表2 酪氨酸氧化產(chǎn)物對(duì)小鼠血漿心肌損傷指標(biāo)的影響（n＝ 10）Table 2 Effects of tyrosine oxidation products on myocardial injury index in plasma of mice (n= 10)

表3 酪氨酸氧化產(chǎn)物對(duì)小鼠心肌ROS及氧化產(chǎn)物的影響（n＝ 10）Table 3 Effects of tyrosine oxidation products on ROS and oxidation products in myocardia of mice (n= 10)

由表2、3可知，小鼠灌胃DT和OTP可顯著提高小鼠心肌蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物DT、AOPP和3-NT以及脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的蓄積，引起血漿TNF-α水平和CK、LDH活力顯著提高（P＜0.05），表明OTP和DT灌胃引發(fā)小鼠心肌組織損傷和炎癥反應(yīng)。

2.2 酪氨酸氧化產(chǎn)物對(duì)小鼠心肌氧化還原穩(wěn)態(tài)的影響

ROS是人體能量代謝的副產(chǎn)物，在健康機(jī)體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[20]。當(dāng)機(jī)體受到有害因素刺激時(shí)，細(xì)胞抗氧化能力下降導(dǎo)致ROS的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，從而引起機(jī)體氧化應(yīng)激[21]。

表4 酪氨酸氧化產(chǎn)物對(duì)小鼠血漿氧化還原指標(biāo)的影響Table 4 Effects of tyrosine oxidation products on plasma redox index in mice

如表4和圖2所示，與Con組相比，DT和OTP灌胃顯著提高了小鼠血漿ROS水平，降低了血漿CAT活力以及心肌組織T-AOC和CAT、SOD活力（P＜0.05），OTP組血漿T-AOC、SOD活力亦顯著降低，表明DT和OTP可降低血漿、組織抗氧化能力，引起氧化損傷。Nrf2通路是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化調(diào)節(jié)通路，Pi3k和Gsk3β是Nrf2的上游調(diào)控因子，其中Gsk3β抑制Nrf2，而Nqo1是Nrf2下游調(diào)控表達(dá)的抗氧化酶[14]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，DT和OTP灌胃顯著下調(diào)小鼠心肌抗氧化相關(guān)基因（Pi3k、Ampk、Nrf2、Nqo1）mRNA表達(dá)水平，而顯著上調(diào)Gsk-3β表達(dá)水平（P＜0.05），表明DT和OTP引起心肌組織氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡與抑制抗氧化通路關(guān)鍵因子表達(dá)有關(guān)。

圖2 酪氨酸氧化產(chǎn)物對(duì)小鼠心肌氧化還原狀態(tài)的影響Fig. 2 Effects of tyrosine oxidation products on myocardial redox state in mice

2.3 酪氨酸氧化產(chǎn)物對(duì)小鼠心肌組織線粒體功能和能量代謝的影響

表5 酪氨酸氧化產(chǎn)物對(duì)小鼠心肌能量代謝的影響Table 5 Effects of tyrosine oxidation products on myocardial energy metabolism in mice

FFA是心肌細(xì)胞最主要的供能物質(zhì)，F(xiàn)FA在心肌積聚能增加細(xì)胞耗氧量，影響能量代謝，降低心肌收縮力，促進(jìn)心肌梗死時(shí)酶的釋放，嚴(yán)重時(shí)可引起心律失常[22]。如表5所示，與Con組相比，DT組和OTP組小鼠心肌FFA含量顯著提高，而NADH/NAD+比值、乙酰輔酶A含量以及ATPase、LDH活力顯著降低。乙酰輔酶A含量、NADH/NAD+比值與線粒體ATP生成密切相關(guān)。ATPase作為一種離子泵，是維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡的重要物質(zhì)，其活性的降低會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)離子超載，產(chǎn)生毒害作用，加重心肌損傷[23]。上述結(jié)果表明，DT和OTP抑制了線粒體氧化磷酸化進(jìn)程，破壞了胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，引起脂質(zhì)在胞內(nèi)的累積。

圖3 酪氨酸氧化產(chǎn)物對(duì)小鼠心肌線粒體生物合成相關(guān)基因的影響Fig. 3 Effects of tyrosine oxidation products on mRNA expression levels of myocardial mitochondrial biosynthesis-related genes in mice

此外，如圖3所示，DT和OTP灌胃顯著下調(diào)了小鼠心肌線粒體合成相關(guān)基因Pgc1α、Tfam和Pparα的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），表明DT和OTP引起心肌組織損傷及氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡與影響線粒體生物合成有關(guān)。

3 討 論

食源性O(shè)TP化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，已被證實(shí)可抵抗酸解和蛋白酶水解，攝入后可經(jīng)腸道完整吸收進(jìn)入血液循環(huán)，在肝、腎[24]、胰腺[8]、腦組織[7]中蓄積。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠長(zhǎng)期攝食OTP日糧極易促發(fā)胰腺氧化應(yīng)激反應(yīng)[8]，誘導(dǎo)肝腎纖維化[25]和大腦學(xué)習(xí)記憶功能減退[7,26]。代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示灌胃320 μg/kgmbDT溶液6 周顯著降低了小鼠血漿3-羥基丁酸和白蛋白水平，增加血漿、尿液中氧化三甲胺含量，抑制脂肪酸代謝和蛋白質(zhì)合成，大幅增加了患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[27-28]，提示食源性O(shè)TP對(duì)心臟及其功能具有潛在危害。

本研究發(fā)現(xiàn)小鼠分別灌胃1 909 μg/kgmbOTP和420 μg/kgmbDT溶液35 d，可引起心臟指數(shù)增加，心肌組織DT、AOPP和3-NT大量蓄積，血漿CRP、TNF-α水平和CK、LDH活力顯著提高。上述結(jié)果表明OTP和DT灌胃可引發(fā)小鼠心肌組織損傷及炎癥反應(yīng)，這與張會(huì)等報(bào)道DT灌胃造成小鼠血漿炎性因子顯著提高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[29]一致。心肌梗死患者心臟存在大量DT蓄積，可作為心肌梗死早期診斷的指標(biāo)[30]?；加行募〔〉奶悄虿⌒∈笾鲃?dòng)脈中3-NT含量顯著高于正常小鼠[31]。研究證實(shí)，酪氨酸氧化產(chǎn)物在組織中大量蓄積會(huì)影響正常氨基酸和蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)及生理功能，導(dǎo)致酶活性的降低及細(xì)胞凋亡[32]。

為了進(jìn)一步探究OTP和DT損傷心肌組織的可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了氧化還原相關(guān)指標(biāo)及基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與Con組相比，OTP和DT灌胃顯著提高了小鼠心肌ROS水平，降低了T-AOC水平及抗氧化酶（CAT、SOD和GSH-Px）活力，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA過(guò)量累積，引起心肌氧化應(yīng)激和抗氧化能力降低，這與趙琪等研究結(jié)果[33]一致。體內(nèi)過(guò)量的ROS參與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子氧化，可引起氧化產(chǎn)物蓄積，刺激產(chǎn)生更多ROS，進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激不僅引起心肌炎癥反應(yīng)和組織損傷，而且進(jìn)一步導(dǎo)致心肌纖維化[34-36]，與心肌缺血再灌注損傷、急性心肌缺血和糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[37]。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示抗氧化相關(guān)基因Pi3k、Ampk、Nrf2、Nqo1mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，而抑制因子Gsk-3β表達(dá)顯著上調(diào)。Nrf2/ARE通路受損是糖尿病的主要特征之一[38]，心力衰竭導(dǎo)致大鼠心肌組織中Pi3k/Akt/Gsk-3β通路上各關(guān)鍵因子顯著下調(diào)[39]，表明OTP和DT引起心肌組織氧化能力降低及氧化損傷與抑制抗氧化信號(hào)通路關(guān)鍵因子表達(dá)有關(guān)。

線粒體是能量代謝的主要部位，也是ROS產(chǎn)生和攻擊的主要靶點(diǎn)。氧化應(yīng)激引起線粒體功能異常主要表現(xiàn)在線粒體DNA及內(nèi)含物減少，ATP合成減少[40-41]。氧化應(yīng)激引起的線粒體能量代謝障礙被認(rèn)為是心功能障礙的主要因素之一[42-43]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DT和OTP灌胃導(dǎo)致小鼠心肌組織乙酰輔酶A水平、NADH/NAD+比值顯著降低，抑制了ATPase和LDH活性，提示心肌糖酵解途徑和線粒體氧化磷酸化過(guò)程受阻。同時(shí)，心肌脂肪酸利用率下降，導(dǎo)致FFA進(jìn)一步積累。此外，DT和OTP顯著下調(diào)了心肌Pgc1α、Pparα、Tfam表達(dá)水平，對(duì)線粒體的生物合成及功能產(chǎn)生不利影響?？梢?jiàn)，DT和OTP導(dǎo)致心肌氧化損傷機(jī)制與抑制線粒體能量代謝與生物合成密切相關(guān)。

DT是OTP的重要產(chǎn)物，常被作為判斷食品蛋白質(zhì)氧化程度的標(biāo)準(zhǔn)[44]。Ding Yinyi等發(fā)現(xiàn)DT具有與T3類似的結(jié)構(gòu)，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合胰腺T3受體，抑制T3生理效應(yīng)的發(fā)揮，導(dǎo)致胰腺細(xì)胞ATP生成不足，胰島素分泌降低[45]。通過(guò)比較分析OTP組與DT組各項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)DT對(duì)心肌氧化應(yīng)激及能量代謝等各指標(biāo)的影響與OTP一致，且無(wú)顯著性差異，提示DT可能是OTP誘導(dǎo)心肌氧化損傷的關(guān)鍵成分，進(jìn)一步深入研究可為闡明OTP作用機(jī)制提供可靠的理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)探究了食源性O(shè)TP和DT對(duì)小鼠心肌氧化還原穩(wěn)態(tài)，線粒體功能及能量代謝的影響。結(jié)果表明OTP和DT均可導(dǎo)致蛋白質(zhì)及脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的積累，降低抗氧化酶活性，引起心肌組織氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)。同時(shí)，通過(guò)影響線粒體生物合成及抗氧化通路相關(guān)基因表達(dá)，抑制線粒體的生物合成與能量代謝。DT作為OTP的重要成分，在OTP誘導(dǎo)的心肌損傷過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。