尹夢婕，呂艷茹，蒿艷蓉，曹宇華，袁賢彬，謝嫣嫣，徐志勇，高 珊，莫華清，沈婧怡

0 引 言

鼻咽癌是一種起源于鼻咽上皮組織的惡性腫瘤，其新發(fā)病例約占全部癌癥確診病例的0.7%，70%的新病例發(fā)生在東亞和東南亞[1]，盡管近年來鼻咽癌的放、化療及免疫治療等有了較大進(jìn)展[2]，但因其早期癥狀通常沒有特異性且極易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)，5年生存率只有50%～60%[3]。鼻咽癌的發(fā)病主要與遺傳易感性、EB病毒感染和環(huán)境因素等相關(guān)[4]，但目前鼻咽癌發(fā)病的分子機制尚未完全闡明。

MicroRNA(miRNA)是長度約為22～25個核苷酸的一類非編碼小RNA，其可通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)從而抑制靶mRNA的剪切或翻譯, 從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]。研究表明，在鼻咽癌中microRNAs參與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲、耐化療和放療，以及其他與疾病和治療相關(guān)的過程[7]。本研究前期發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌中CSF1R呈現(xiàn)過表達(dá)并能促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲等[8]，但對于其過表達(dá)的機制尚未明確，通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-22可能通過結(jié)合 mRNA 3'非編碼區(qū)( 3'-UTR) 調(diào)控CSF1R的表達(dá)[9]。MiR-22是研究最頻繁的microRNAs之一，其參與了心臟重構(gòu)、細(xì)胞周期調(diào)控、增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程[10]。有文獻(xiàn)報道m(xù)iR-22在肺癌、乳腺癌、宮頸癌、膀胱癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移[11-14]，但目前miR-22在鼻咽癌中研究鮮見報道。本研究從美國國立生物技術(shù)信息中心創(chuàng)建的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)中檢索獲得鼻咽癌miRNA 表達(dá)水平的檢測數(shù)據(jù)，并利用鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)一步驗證，利用生物信息學(xué)預(yù)測并探究其靶基因的功能，以期為鼻咽癌提供有價值的分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 差異表達(dá)miRNA的篩選從Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm. nih.gov/geo/) 數(shù)據(jù)庫中下載鼻咽癌相關(guān)的microRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE32960(包括312例鼻咽癌組織及18例正常鼻咽組織)和mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE53819(包括18例鼻咽癌組織及18例正常鼻咽組織)。使用R語言Limma程序包對下載的數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選閾值為:Fold Change(差異表達(dá)倍數(shù))≥|1.0| ，P<0.01。

1.2實時熒光定量PCR法驗證miR-22-3p在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)情況培養(yǎng)細(xì)胞總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司的miRcute miRNA Isolation Kit，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自廣州復(fù)能基因有限公司的 All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit。實驗引物購自廣州復(fù)能，miR-22-3p：5'-AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-3'，U6：5'-CGCTT CGGCAGCACATATAC-3'。miR-22-3p過表達(dá)慢病毒及空載病毒購自吉凱基因。正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP69細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞系HK1均獲贈于香港大學(xué)曹世華教授。

將正常鼻咽上皮細(xì)胞系 NP69細(xì)胞置于配置含生長因子的K-SFM培養(yǎng)基中、鼻咽癌細(xì)胞系HK1細(xì)胞均置于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，均置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染說明書將miR-22-3p過表達(dá)慢病毒(過表達(dá)組)及空載病毒(陰性對照組)分別轉(zhuǎn)染至HK-1細(xì)胞中，并利用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株；另選取不轉(zhuǎn)染任何病毒的HK1原代細(xì)胞為空白組。按照試劑盒說明書提取細(xì)胞系中的miRNA富集部分，以純凈水作為對照組，取1 μL樣品由紫外分光光度計檢測其濃度和純度：A260/A280范圍在1.8～2.0的樣品則可以滿足后續(xù)實驗。

實時熒光定量PCR:將提取的總RNA按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及說明書提供的反應(yīng)條件設(shè)置溫度將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用ABI 7500 PCR儀分析 RT-PCR的PCR擴(kuò)增及溶解曲線。反應(yīng)體系20 μL，PCR反應(yīng)過程：預(yù)變性 95 ℃ 10 min；變性 95 ℃ 10 s，退火 65 ℃ 20 s和延伸 72 ℃ 32 s，40 個循環(huán)擴(kuò)增。PCR 溶解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。設(shè)復(fù)孔3個取均值計算。結(jié)果采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達(dá)量，ΔΔCT計算公式如下：

ΔΔCT=ΔCT實驗組-ΔCT對照組

ΔCT=CT目標(biāo)-CT內(nèi)參

設(shè)定正常鼻咽上皮細(xì)胞中miR-22-3p相對平均表達(dá)量為1，其余組表達(dá)量為 2-ΔΔCt計算，最終計算相對改變倍數(shù)。

1.3靶基因的預(yù)測及差異基因的篩選應(yīng)用miRecords數(shù)據(jù)庫 (http://miRecords.biolead.org/) 進(jìn)行靶基因預(yù)測miR-22最可能的靶基因，其中預(yù)測軟件包括:DIANA、Microinspector、miRANDA、miR target2、miTarget、NBmiR-Tar、PicTar、PITA、RNA22、RNAhybrid以及TargetS-can，只有至少被3種不同算法預(yù)測的交集才作為miRecords預(yù)測的靶基因，在數(shù)據(jù)集GSE53819中進(jìn)一步篩選表達(dá)有差異的靶基因。

1.4GO功能注釋和KEGG通路富集分析將上述所得的靶基因利用DAVID網(wǎng)站 (https://david.ncifcrf.gov/) 進(jìn)行GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析，其中GO功能注釋包括生物過程、細(xì)胞組分、分子功能，選取P<0.01的GO和P<0.05的KEGG信號通路。

1.5差異基因的PPI構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選利用String數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)構(gòu)建靶基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,置信度評分≥0.4。利用Cytoscape軟件插件cytoHubba中的Degree法分別篩選出節(jié)點中心度排名前9位的并做表達(dá)水平的檢測，用Kaplan Meier-plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)分析關(guān)鍵基因?qū)︻^頸部腫瘤預(yù)后的影響。

2 結(jié) 果

2.1 miR-22-3p在鼻咽癌中的表達(dá)通過差異分析篩選出GSE32960數(shù)據(jù)集中鼻咽癌與正常鼻咽上皮之間具有明顯差異表達(dá)的miRNA共80個，包括上調(diào)miRNA 32個及下調(diào)miRNA 48個，其中miR-22-3p在鼻咽癌中呈明顯低表達(dá)，log FC為-1.426，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表 1 數(shù)據(jù)集GSE32960中下調(diào)的miRNA

2.2qRT-PCR驗證miR-22-3p在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)情況qRT-PCR結(jié)果顯示，在鼻咽癌細(xì)胞株HK-1中， miR-22-3p的平均表達(dá)(0.015±0.014)顯著低于正常鼻咽上皮細(xì)胞(1.000±0.000)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3miR-22-3p對鼻咽癌患者的診斷效能ROC曲線結(jié)果顯示曲線下面積(AUC)為0.984(95%CI:0.970～0.998)，表明在鼻咽癌中miR-22-3p的表達(dá)具有一定診斷效能，見圖1。

圖 1 miR-22-3p對鼻咽癌的診斷效能

2.4miR-22-3p靶基因的GO功能富集分析和KEGG通路分析在miRecords中選取3個軟件共同預(yù)測的靶基因進(jìn)行信號通路分析，共檢索到2682個miR-22-3p的預(yù)測靶基因，其中201個基因在數(shù)據(jù)集GSE53819中存在差異表達(dá)，對其進(jìn)行GO功能分析表明，miR-22-3p靶基因產(chǎn)物的主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞外基質(zhì)、突觸等，生物過程主要涉及細(xì)胞表面受體連接信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附及Wnt受體信號通路等，分子功能主要包括蛋白域特異性結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性及SH3結(jié)構(gòu)域連接等(P<0.01)，見圖2。KEGG分析表明這些靶基因所參與的主要信號通路主要包括趨化因子信號通路、癌癥通路(P<0.05)，上述通路均與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。見圖3。

圖 2 miR-22-3p靶基因的GO分析

圖 3 miR-22-3p靶基因的KEGG通路分析

2.5篩選miR-22-3p的hub基因及與預(yù)后的關(guān)系篩選出排名前9的關(guān)鍵基因，分別為WNT5A、GNG7、CXCR5、CCR7、CXCL5、TFRC、STAT1、CX3CR1、KIAA0319，其中在數(shù)據(jù)集GSE53819中WNT5A、CXCL5、TFRC、STAT1呈現(xiàn)高表達(dá)，CXCR5、GNG7、CCR7、CX3CR1、KIAA0319呈現(xiàn)低表達(dá)(P<0.01)，見表2。過表達(dá)組WNT5A、CXCL5的表達(dá)水平低于陰性對照組及空白組(P<0.05)，見表3。9個關(guān)鍵基因在頭頸部鱗癌中進(jìn)行預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，GNG7、CXCR5、CCR7、CX3CR1低表達(dá)及TFRC的高表達(dá)與頭頸部鱗癌的不良預(yù)后具有明顯的相關(guān)性(P<0.01)，見圖4。

表 2 關(guān)鍵基因在數(shù)據(jù)集GSE53819中的表達(dá)水平

表 3 各組細(xì)胞中WNT5A和CXCL5 mRNA的相對表達(dá)量

圖 4 GNG7、CXCR5、CCR7、CX3CR1及TFRC的表達(dá)與頭頸鱗癌的預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

鼻咽癌發(fā)生發(fā)展涉及多個癌基因的激活與抑癌基因的失活，它們之間相互作用的失衡是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)[15-16]。MicroRNA 是存在于多種真核生物中的一類由內(nèi)源性基因編碼的小分子非編碼單鏈RNA分子，近年來，越來越多的microRNA被發(fā)現(xiàn)與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，一些microRNA如miR-212、miR-663、miR-155、miR-29a等能調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，包括對細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及對細(xì)胞周期的調(diào)控[17-20]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中miR-22可作為抑癌因子參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，例如在肺癌中，過表達(dá)miR-22通過靶向Snail抑制上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)從而影響肺癌的發(fā)生發(fā)展[11]；在乳腺癌中，miR-22通過靶向SIRT1抑制乳腺癌細(xì)胞生長，而且通過調(diào)控ACLY基因參與脂肪酸和膽固醇合成過程[12, 21]；在卵巢癌中，miR-22表達(dá)下降并通過Notch信號通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長，而過表達(dá)miR-22還能通過下調(diào) ERa 的蛋白水平從而抑制雌激素信號通路[22-23]。除此之外，miR-22在胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等腫瘤均呈現(xiàn)低表達(dá)并可抑制腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[24-26]。在前列腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)miR-22表達(dá)顯著下調(diào)，而Butt等發(fā)現(xiàn)miR-22表達(dá)上調(diào)并激活PI3K-Akt信號通路[27-28]；在血液系統(tǒng)中，有研究表明miR-22在兒童急性B 淋巴細(xì)胞白血病中為低表達(dá)，也有研究表明在骨髓增生異常綜合征(MDS)和白血病中miR-22的表達(dá)上調(diào)并作為原癌基因發(fā)揮作用[29-30]；另外，miR-22在惡性轉(zhuǎn)化的支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)增加，通過抑制PETN蛋白發(fā)揮致瘤作用[31]。然而關(guān)于在鼻咽癌中miR-22的表達(dá)情況和作用機制鮮見文獻(xiàn)報道。

本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集，分析了miR-22-3p在鼻咽癌組織和非癌組織中的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-22-3p在鼻咽癌組織中表達(dá)水平明顯低于正常鼻咽組織，并利用qRT-PCR進(jìn)一步在鼻咽癌細(xì)胞中驗證了這種差異，同時ROC曲線表明miR-22-3p對鼻咽癌有一定的診斷價值，說明可能成為一項新的診斷指標(biāo)。MicroRNA主要通過與 mRNA 3'非編碼區(qū)(3'-UTR)結(jié)合而抑制其相關(guān)靶基因蛋白的合成，或通過降解其靶基因 mRNA 沉默基因,起到轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的作用。利用生物信息學(xué)分析miR-22-3p調(diào)控的靶基因，其中包括FGFR2、 TGFBR1、 PTEN、AKT3、CSF1R等。在數(shù)據(jù)集GSE53819中篩選表達(dá)有差異的靶基因，并對這些靶基因進(jìn)行GO功能注釋，發(fā)現(xiàn)miR-22-3p的靶基因在鼻咽癌中主要參與了細(xì)胞表面受體連接信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附等生物學(xué)過程，發(fā)揮跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白域特異性結(jié)合等分子功能，而KEGG分析表明這些靶基因主要參與了趨化因子信號通路，這些過程及通路都與腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡、細(xì)胞周期等生物學(xué)行為密切相關(guān)。通過靶基因蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖篩選出了關(guān)鍵基因WNT5A、GNG7、CXCR5、CCR7、CXCL5、TFRC、STAT1、CX3CR1、KIAA0319，有研究證實WNT5A、CXCL5等在鼻咽癌中表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展[32, 33]，我們進(jìn)一步利用qRT-PCR證實了miR-22的過表達(dá)能抑制WNT5A和CXCL5的表達(dá)，結(jié)合KEGG分析的結(jié)果我們推測在鼻咽癌中miR-22-3p可能通過靶向調(diào)控WNT5A、CXCL5等參與WNT信號通路及趨化因子信號通路，進(jìn)而在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。

然而miR-22-3p在鼻咽癌中具體的功能與分子機制還需要相關(guān)實驗做進(jìn)一步的驗證，未來我們將這一研究方向作為重點，進(jìn)一步闡明miR-22-3p在鼻咽癌中發(fā)揮作用的具體機制。