戴 一，賈曉益，宋祖榮

SN38與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物的合成及抗腫瘤活性研究

*戴 一1，賈曉益2，宋祖榮1

（1. 安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽，合肥 230088；2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽，合肥 230013）

SN38為喜樹(shù)堿類(lèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。本研究以羧基呋咱氮氧化物與SN38的酚羥基成酯合成制備SN38與呋咱氮氧化物的偶聯(lián)物，采用griess法、MTT法及劃痕實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了該偶聯(lián)物的體外NO釋放、抗腫瘤活性及抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性。結(jié)果顯示合成的SN38與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物24 h體外釋放NO達(dá)32.4%，抗腫瘤活性比SN38及SN38與呋咱氮氧化合物的混合物更強(qiáng)，且具有一定的抗轉(zhuǎn)移活性?？梢?jiàn)SN38與呋咱氮氧化物的偶聯(lián)物表現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)。

SN38；呋咱氮氧化物；griess法；抗腫瘤；抗轉(zhuǎn)移

7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿(SN-38)為喜樹(shù)堿衍生物，它是喜樹(shù)堿衍生物中活性最好的化合物之一，同其他喜樹(shù)堿類(lèi)化合物一樣，通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I阻滯DNA的復(fù)制而發(fā)揮抗腫瘤作用[1]，其前藥即是獲得FDA批準(zhǔn)的臨床用藥伊立替康。伊立替康水溶性相比于SN-38有了提高，但體外活性比SN-38低100-1000倍[2]。盡管伊立替康在體內(nèi)經(jīng)羧酸酯酶代謝形成SN-38，但僅有使用劑量的2%~8%能轉(zhuǎn)化成SN-38[3]。另外SN38不能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，腫瘤的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的重要因素之一，因此，SN-38的改造依然受到很大的關(guān)注。

一氧化氮（NO）作為一種氣態(tài)信使分子，具有多種生理活性[4]，高劑量NO（微摩爾濃度）可以抑制腫瘤生長(zhǎng)[5]及逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性[6]。在抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面，NO供體可以下調(diào)金屬基質(zhì)蛋白酶（MMP）[7]、N-myc下游調(diào)節(jié)基因-1（NDRG1）[8]、細(xì)胞粘附分子（CAMs）的活性及抑制腫瘤細(xì)胞表面的微泡形成等，從而阻止腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[9]。NO供體種類(lèi)繁多，常見(jiàn)的為硝酸酯類(lèi)，如臨床上使用的硝酸甘油、硝酸異山梨酯等[10]，但硝酸酯類(lèi)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且受撞擊易爆等?，F(xiàn)今受到關(guān)注的NO供體多為N-偶氮烯二醇類(lèi)、亞硝基硫醇類(lèi)及呋咱氮氧化物類(lèi)[11]。由于呋咱氮氧化物在酸堿中均具有較好的穩(wěn)定性，且易于制備，得到較多的應(yīng)用。拼合原理是藥物化學(xué)普遍采取的藥物設(shè)計(jì)策略，可以起到多藥協(xié)同的效果[12]。受此啟示，本研究設(shè)計(jì)合成了SN38與呋咱氮氧化物的偶聯(lián)物，以期達(dá)到二者的協(xié)同抗腫瘤效果、為SN38新體系研究開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器與試劑

Orbitrap Fusion? Lumos? Tribrid? 三合一質(zhì)譜儀，BruckerACF-400型核磁共振儀，bio-rad mode680酶標(biāo)儀，SN38購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司。DEME培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、MTT 均購(gòu)置于生工生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑均為分析純。受試鼠乳腺癌4T1細(xì)胞及人肺癌A549細(xì)胞來(lái)自于美國(guó)ATCC公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 合成路線(xiàn)

首先合成呋咱氮氧化物2，再在EDCI、DMAP存在條件下與SN38酚羥基成酯制備出SN38與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物1，結(jié)果見(jiàn)圖1。產(chǎn)物經(jīng)NMR、MS確認(rèn)結(jié)構(gòu)。

圖1 SN38與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物的合成

2.2 化合物2的合成

按文獻(xiàn)報(bào)道[13]合成，首先以肉桂醇（10.74 g，80 mmol）為起始原料，在16 mL冰乙酸溶解后緩慢加入NaNO2飽和水溶液20 mL，控溫在70 ℃以下，反應(yīng)完畢，加水稀釋?zhuān)砸颐演腿。柡褪雏}水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓過(guò)濾，除去乙醚，所得產(chǎn)物直接用于下步反應(yīng)。取上步所制化合物 (1.152 g, 6 mmol)，丁二酸酐 (900 mg, 9 mmol)，DMAP (45 mg, 0.4 mmol) 溶于60 mL二氯甲烷，室溫反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)完畢，分別用稀鹽酸、冰水洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，濃縮即得灰白色固體，收率為81%，TLC分析Rf約0.4（展開(kāi)劑石油醚：乙酸乙酯=1：1）；1H-NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.78 – 7.64 (m, 2H), 7.64 – 7.43 (m, 3H), 5.13 (s, 2H), 2.74 – 2.53 (m, 4H)。與文獻(xiàn)比較分析，數(shù)據(jù)相一致。

2.3 化合物1(即SN38與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物)的合成

取SN38（392 mg, 1 mmol）、化合物2 (350 mg, 1.2 mmol)、EDCI (380 mg,2 mmol)及DMAP (123 mg, 1.0 mmol)溶于20 mL二氯甲烷中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，TLC跟蹤，反應(yīng)完畢，反應(yīng)液分別以稀鹽酸及飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓除去二氯甲烷，粗產(chǎn)物過(guò)硅膠柱，以石油醚：乙酸乙酯梯度洗脫（石油醚：乙酸抑制=5:1~1:1），得淡黃色固體，收率為43%， TLC分析Rf約0.6（展開(kāi)劑為石油醚：乙酸乙酯=1：1）；UV(MeOH) λmax(logε) 375 nm(3.53),227 nm(4.61);1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 0.95 – 1.08 (t, J = 7.4 Hz, 3H), 1.33 – 1.44 (t, J = 7.7 Hz, 3H), 1.82 – 1.98 (ddt, J = 16.9, 14.2, 7.1 Hz, 2H), 2.81 – 2.90 (dd, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 2.98 – 3.07 (dd, J = 7.6, 5.3 Hz, 2H), 3.09 – 3.20 (q, J = 7.7 Hz, 2H), 3.88 – 3.93 (s, 1H),5.20 – 5.35 (m, 5H), 5.68 – 5.79 (d, J = 16.3 Hz, 1H), 7.45 – 7.58 (m, 4H), 7.63 – 7.76 (m, 3H), 7.80 – 7.85 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.19 – 8.27 (d, J = 9.2 Hz, 1H).;13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 7.87, 14.02, , 23.18, 28.67, 29.18, 31.62, 49.41, 54.54, 66.32, 72.80, 98.10, 111.12, 114.53, 118.64, 125.21, 125.89, 127.33, 127.42, 127.61, 129.47, 131.47, 132.09, 145.42, 146.77, 147.41, 149.41, 157.61, 170.65, 171.31, 173.86; m/z(ESI-MS) 667.6[M+H]+。

2.4 SN38與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物體外NO釋放[14]

2.4.1 NO 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

于96孔板中分別加入不同濃度NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液 (50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 μM) 100 uL，復(fù)孔3個(gè)，每孔再分別加入Griess試劑（含1.0%磺胺、5.0%的磷酸、0.1% N-1-萘乙二胺鹽酸鹽水溶液）37℃孵育10 min，540 nm測(cè)定吸光度，得回歸方程為y = 0.0404x + 0.0561，r = 0.9998。表明NaNO2在50~1.56 μM濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.4.2 SN38與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物體外NO釋放

以pH = 7.4PBS/乙腈 (1:1)混合溶劑制備50 μM濃度的化合物1、2供試液，加入半胱氨酸 (500 μM) 后37 ℃避光孵育24 h。按照2.4.1法測(cè)定各供試液540 nm的吸光度，計(jì)算24 h NO的釋放程度，結(jié)果見(jiàn)圖2A，在過(guò)量半胱氨酸存在下，24 h內(nèi)化合物1、2均具有較高的釋放度，分別達(dá)到32.4%和53.5%，可見(jiàn)化合物1的在體外均有較高的NO釋放度為其抗癌活性的發(fā)揮提供了基礎(chǔ)。

2.5 SN38與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物抗腫瘤活性研究

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞種植于96孔板中，每孔種植4000個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)，以含藥培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48 h，吸去含藥培養(yǎng)基，以含MTT培養(yǎng)基替換，MTT濃度為1 mg/mL，繼續(xù)孵育4 h，吸去MTT培養(yǎng)基，加入DMSO150 μL，震蕩10 min，于酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定吸光度OD值，計(jì)算抑制率及IC50值。抑制率(%)=[1-(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組) / (A對(duì)照組-A空白組)]′100%?；衔?、2及由化合物1和2按1：1摩爾比組成的混合物MTT結(jié)果顯示（圖2B、2C），化合物1和SN38及SN38+2對(duì)A549細(xì)胞IC50值分別為0.66、7.78、8.14 μM，對(duì)4T1細(xì)胞IC50值分別為0.12、3.46、0.71 μM?？梢?jiàn)SN38與呋咱氮氧化物的偶聯(lián)，顯著提高了母體化合物的細(xì)胞毒性，均高于簡(jiǎn)單的SN38與化合物2的簡(jiǎn)單混合效果，為SN38的NO供體化的開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)。

A:NO釋放；B：對(duì)HepG2細(xì)胞的MTT結(jié)果；C：對(duì)A549細(xì)胞的MTT結(jié)果

2.6 姜黃素與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物抗轉(zhuǎn)移活性研究

在6孔板中種植4T1細(xì)胞，長(zhǎng)至匯合度達(dá)95%~100%，用1 mL槍頭輕輕在細(xì)胞上劃出十字痕，以PBS洗去劃掉的細(xì)胞，加入含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在0 h及24 h 分別以顯微鏡觀察傷口的愈合。結(jié)果如圖3所示，單獨(dú)的SN38與對(duì)照組相似，都可見(jiàn)明顯的劃痕愈合，而SN38與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物組可見(jiàn)劃痕未見(jiàn)明顯愈合，說(shuō)明SN38與呋咱氮氧化物的偶聯(lián)物具有一定的抗腫瘤轉(zhuǎn)移效果。

圖3 SN38與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用

3 討論

SN38通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶而發(fā)揮抗腫瘤作用，在臨床上已較為廣泛的使用，但其在使用過(guò)程中同樣會(huì)產(chǎn)生耐藥性，其活性有進(jìn)一步提升的空間，仍具有較大的開(kāi)發(fā)潛力。NO作為第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的氣態(tài)信使分子，參與多種生理及病理過(guò)程，高濃度一氧化氮可以抑制腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性。本研究通過(guò)品和原理合成了SN38與呋咱氮氧化物的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，酯鍵水解釋放NO和原藥SN38，發(fā)揮協(xié)同效果。初步體外實(shí)驗(yàn)顯示，該偶聯(lián)物可以釋放NO和具有比母體更強(qiáng)的抗腫瘤活性，同時(shí)具有一定的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究。

[1] Pommier Y. DNA Topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, Biology, and Interfacial Inhibition[J].Chem Rev, 2009,109 (7):2894-2902.

[2] Mathijssen RHJ, van Alphen R J, Verweij J,et al. Clinical Pharmacokinetics and Metabolism of Irinotecan (CPT-11)[J]. Clin Cancer Res, 2001, 7 (8):2182-2194.

[3] Slatter J G, Schaaf LJ, Sams J P, et al. Pharmacokinetics, metabolism, and excretion of irinotecan (CPT-11) following I.V. infusion of [(14)C]CPT-11 in cancer patients[J]. Drug Metab Dispos, 2000, 28(4): 423-433.

[4] 馬超,袁文金,吳紅云,等．不同強(qiáng)度遠(yuǎn)程缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)穩(wěn)定型心絞痛患者運(yùn)動(dòng)耐量、血清一氧化氮及內(nèi)皮素的影響[J]．井岡山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2018，39(4):92-94．

[5] Wink D A, Vodovotz Y, Laval J, et al. The multifaceted roles of nitric oxide in cancer[J]. Carcinogenesis, 1998, 19(5):711-721.

[6] Riganti C, Miraglia E, Viarisio D, et al. Nitric oxide reverts the resistance to doxorubicin in human colon cancer cells by inhibiting the drug efflux [J]. Cancer Res, 2005, 65(2):516-525.

[7] Cheng H, Wang L, Mollica M, et al.Nitric oxide in cancer metastasis[J].Cancer Lett, 2014,353(1):1-7.

[8] Hickok J R, Sahni S, Mikhed Y, et al. Nitric oxide suppresses tumor cell migration through N-Myc downstream-regulated gene-1 (NDRG1) expression: role of chelatable iron[J]. J Biol Chem, 2011, 286(48):41413-41424.

[9] Kang F H, Zhu J Y, Wu J B, et al.O2-3-Aminopropyl diazeniumdiolates suppress the progression of highly metastatic triple-negative breast cancer by inhibition of microvesicle formation via nitric oxide-based epigenetic regulation[J]. Chem Sci, 2018, 9(34), 6893-6898.

[10] 李娜,廖晶,胡文,等．1 例原發(fā)性高血壓合并心、腎功能不全患者的藥學(xué)監(jiān)護(hù)[J]．井岡山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2017,38(6):93-97．

[11] Riccio D A, Schoenfisch MH. Nitric oxide release: Part I. Macromolecular scaffolds[J]. Chem Soc Rev, 2012, 41(10):3731-3741.

[12] Kiberstis P A, Travis J. Stocking oncology's medicine cabinet [J]. Science, 2017, 355(6330):1142-1143.

[13] 戴一,曹殿潔. 白藜蘆醇與呋咱氮氧化物偶聯(lián)物的合成及抗腫瘤活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2019,31(3):502-505.

SYNTHESIS AND ANTI-TUMOR ACTIVITY OF CONJUGATE OF SN38 AND FUROXANS

*DAI Yi1, JIA Xiao-yi2, SONG Zu-rong1

(1.Pharmacology College, Anhui Xinhua University, Hefei, Anhui 230088, China；2. Pharmacology College, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei ,Anhui 230013, China)

SN38 is a topoisomerase inhibitor of camptothecin alkaloids type. The conjugate of SN38 and furoxans was synthesized through esterification of furoxan containing carboxyl with phenol hydroxyl of SN38. The NO release, antitumor activity and anti-metastasis activity of the conjugate of SN38 and furoxanswere determined by Griess method, MTT method and scratch assay respectively. The results showed that the conjugate of curcumin and furoxans could be prepared. The percent of NO release from conjugate of SN38 and furoxans was 32.4%in 24 h. The anti-tumor activity of conjugate of SN38 and furoxans is more potent than those of SN38, or mixture of SN38 and furoxans. Moreover, the conjugate of SN38 and furoxans has anti-metastasis activity. These results indicated thattheconjugate of SN38 and furoxans has significant synergistic effects.

SN38; furoxans; griess method; anti-tumor; anti-metastasis

R914.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2020.05.005

1674-8085(2020)05-0022-04

2020-06-006；

2020-07-29

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81603362）；安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2019A0873); 安徽新華學(xué)院中藥量效關(guān)系研究團(tuán)隊(duì)（kytd201908）

*戴 一(1979-)，男，安徽利辛人，副教授，博士，主要從事活性天然產(chǎn)物研究(E-mail:daiyiii@163.com);

賈曉益(1978-)，女，安徽合肥人，副教授，博士，主要從事抗炎藥理研究(E-mail:jiaxiaoyi78@126.com);

宋祖榮(1977-)，女，安徽鳳陽(yáng)人，副教授，碩士，主要從事中醫(yī)藥藥理研究(E-mail:szr77@126.com).