徐欣欣，王佳堃

（浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院奶業(yè)科學(xué)研究所，杭州310058）

減少反芻動物甲烷產(chǎn)量能夠提高飼料利用效率，且有利于保護生態(tài)環(huán)境。離子載體[1]、有機酸[2]、鹵代化合物[3]等化學(xué)物質(zhì)，皂苷[4]、單寧[5]、蒽醌[6]等植物提取物，及細菌素[7]、驅(qū)原蟲劑[8]、產(chǎn)甲烷菌疫苗[9]等生物方法都曾是反芻動物甲烷減排的熱點技術(shù)，但在動物養(yǎng)殖過程中這些方法又受限于纖維消化的抑制或降甲烷效果瞬時性的影響。體外瘤胃發(fā)酵證實，添加硝酸鹽和硫酸鹽降甲烷效果顯著，推測這一過程是通過硝酸鹽和硫酸鹽還原途徑與甲烷生成途徑競爭氫來實現(xiàn)的[10]。而事實上，NO－3和SO2－4是多種環(huán)境中甲烷厭氧氧化（anaerobic methane oxidation, AMO）的電子受體，在NO－3或SO2－4存在時，甲烷氧化菌可以將甲烷氧化[11]。其中反向產(chǎn)甲烷途徑是AMO的方式之一。即參與甲烷生成的酶是一類“雙向酶”，它們既參與產(chǎn)甲烷菌利用氫氣和二氧化碳生成甲烷的生成過程，也參與以甲烷為底物生成二氧化碳的AMO 過程[11]。每年自然環(huán)境中有0.3 Gt 的甲烷經(jīng)厭氧氧化途徑被消耗[12]。而在反芻動物的瘤胃中，尤其是在添加硝酸鹽和硫酸鹽的情況下，甲烷生成量的減少是競爭氫的結(jié)果，還是甲烷氧化的結(jié)果，不得而知。因此，深入研究在自然環(huán)境和瘤胃2 種不同生境下AMO 途徑中硝酸鹽和硫酸鹽對甲烷生成量差異的影響，能夠更好地闡釋硝酸鹽和硫酸鹽抑制瘤胃甲烷排放的內(nèi)在機制。

1 自然環(huán)境中甲烷厭氧氧化途徑

AMO 是沼澤、濕地、農(nóng)田土壤、水底淤泥等厭氧環(huán)境中甲烷排放量降低的主要因素，且AMO 普遍存在于這些生境中（表1）。AMO 途徑依據(jù)其末端電子受體類型可以分為硫酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化（sulfate-dependent anaerobic methane oxidation,S-DAMO）、硝酸鹽/亞硝酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化（nitrate/nitrite-dependent anaerobic methane oxidation,N-DAMO）及金屬依賴型甲烷厭氧氧化（metaldependent anaerobic methane oxidation,M-DAMO）。

1.1 硫酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化（S-DAMO）

S-DAMO 是甲烷厭氧氧化古菌（anaerobic methanotrophic archaea, ANME）和硫酸鹽還原菌（sulfate-reducing bacteria,SRB）以SO2－4為終端電子受體，經(jīng)硫酸鹽還原反應(yīng)將甲烷氧化為HCO－3和HS－的過程。目前，該過程有反向產(chǎn)甲烷、乙酸化與甲基化3種假說途徑。

表1 不同類型甲烷厭氧氧化途徑中甲烷氧化速率Table 1 Methane oxidation rates in the different types of anaerobic methane oxidation processes

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，在與SRB共生的ANME類群中，ANME-1 與產(chǎn)甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）和產(chǎn)甲烷微菌目（Methanomicrobiales）的親緣關(guān)系較遠[19-20]，ANME-2 屬于產(chǎn)甲烷八疊球菌目[20]，ANME-3 與擬甲烷球菌屬（Methanococcoides）的親緣關(guān)系較近[20]，其中ANME-2 可以再細分為ANME-2a、ANME-2b、ANME-2c[21]和ANME-2d[22]。ANME-2d 也被稱為GoM-ArcⅠ[23]或AAA 古菌[24]。在S-DAMO 中，與ANME-1 和ANME-2 共 生 的SRB 通常屬于脫硫八疊球菌屬（Desulfosarcina）和脫硫球菌屬（Desulfococcus）[19-20,25]，與ANME-3共生的SRB一般屬于脫硫葉菌屬（Desulfobulbus）[26-27]。

如圖1 所示，甲烷生成途徑中大部分酶催化的反應(yīng)都是可逆的[11]，反向產(chǎn)甲烷理論正是以此為基礎(chǔ)提出的。甲烷生成途徑的最后一步是甲基輔酶M 還原酶（methyl-coenzyme M reductase,Mcr）將輔酶M（coenzyme M, CoM）連接的甲基催化為甲烷[21]，而在反向產(chǎn)甲烷途徑中，Mcr被證實是活化甲烷即催化AMO 的關(guān)鍵酶[28]。除亞甲基四氫甲烷蝶呤還原酶（methylene-H4MPT reductase,Mer）和一些氫化酶的編碼基因外，ANME-1的基因組具有編碼二氧化碳還原生成甲烷的其他全部酶基因[29]。因此，在基因?qū)用嫔希聪虍a(chǎn)甲烷途徑中的大部分環(huán)節(jié)都能在ANME-1 中實現(xiàn)，表明ANME-1 與SRB至少能通過部分反向產(chǎn)甲烷途徑完成S-DAMO。Mcr 的可逆性及甲烷生成所需的關(guān)鍵酶基因的存在[28-30]，都支持了反向產(chǎn)甲烷途徑。但有研究發(fā)現(xiàn)，在低氫、高甲烷含量的環(huán)境中無法成功誘導(dǎo)反向產(chǎn)甲烷途徑[31]。通過系統(tǒng)發(fā)育分析和顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與產(chǎn)甲烷八疊球菌目有較近親緣關(guān)系的古菌參與了某些環(huán)境中的S-DAMO[32]，但許多產(chǎn)甲烷八疊球菌目的微生物不能利用氫氣完成產(chǎn)甲烷過程，而是更傾向于在富含甲基化合物和乙酸的環(huán)境中生長[33]。出于對以上幾點的考慮，VALENTINE 等推測可能存在其他途徑供ANME 與SRB 完成SDAMO[33]，并由此提出乙酸化理論。乙酸化理論包括2種代謝途徑，都涉及甲烷的氧化與乙酸的生成，但ANME 是直接將2 分子的甲烷氧化為乙酸和氫氣，還是利用二氧化碳將甲烷轉(zhuǎn)化為乙酸[33]，尚需要系統(tǒng)的研究。

除反向產(chǎn)甲烷理論與乙酸化理論外，甲基化理論作為一種新的AMO 理論模型也被用于解釋AMO[34]。從熱力學(xué)角度來看，當海洋環(huán)境中氫氣濃度超過0.29 nmol/L時，S-DAMO會受到抑制[35]。但MORAN 等[34]接種來自Eel 河盆地和水合物脊（hydrate ridge）的沉積物后發(fā)現(xiàn)，0.43 mmol/L 的氫氣濃度并不抑制S-DAMO，說明氫氣并非是SDAMO的產(chǎn)物；因此，作者推斷在S-DAMO過程中存在其他電子傳遞體。然而，當MORAN 等向培養(yǎng)體系中添加甲硫醇（MeSH）時，S-DAMO 的反應(yīng)速率降低了68%，由此推斷甲基硫化物充當了這一過程中的電子傳遞體，從而提出了甲基化理論。即甲烷與輔酶M（CoM）結(jié)合時被活化并釋放電子，此時HCO－3作為電子受體，在碳酸酐酶作用下轉(zhuǎn)化為二氧化碳，二氧化碳被ANME利用后還原為甲基化合物并與CoM 結(jié)合，硫化物取代結(jié)合物中的CoM，再次釋放的CoM 可再被作用于甲烷活化和二氧化碳還原，而甲基硫化物則充當這一過程中的電子傳遞體并被SRB利用，其與SO2－4反應(yīng)后產(chǎn)生的HCO－3和HS－又可用于AMO的起始階段[34]。不同環(huán)境下SDAMO的發(fā)生機制可能存在一定的差異，而具體是通過哪一種機制來完成AMO 過程，尚需要在不同試驗條件下進行驗證。

1.2 硝酸鹽/亞硝酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化（NDAMO）

N-DAMO 常在濕地[15]和淡水[36]等缺氧且富含NO－2或者NO－3的區(qū)域發(fā)生，是ANME和NC10門細菌（CandidatusMethylomirabilis oxyfera,M.oxyfera）以NO－2或NO－3作為電子受體，與脫氮耦聯(lián)并將甲烷氧化為二氧化碳的過程。1991年，SMITH等在富含硝酸鹽的地下水域中監(jiān)測到了甲烷氧化的發(fā)生，由此推測NO－3也許能夠作為電子受體，將反硝化與甲烷氧化耦合[37]。之后，RAGHOEBARSING 等通過對河流的厭氧沉積物進行富集培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該富集培養(yǎng)物由1種細菌和1種與ANME-2親緣關(guān)系較遠的古菌組成，其在厭氧條件下能夠完成甲烷氧化和反硝化，故認為在N-DAMO中，首先由古菌完成甲烷的氧化，再將電子傳遞給NC10 門細菌以完成NO－3和NO－2的還原[16]。ETTWIG 等在抑制Mcr 的條件下培養(yǎng)由NC10門細菌和產(chǎn)甲烷八疊球菌目的古菌組成的富集培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)體系中甲烷和亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化速率保持穩(wěn)定，古菌在培養(yǎng)過程中逐漸消失；由此推斷，N-DAMO 過程主要由NC10 門細菌完成，并且NO－2比NO－3更適合作為該培養(yǎng)體系的電子受體[36]。借助同位素標記法，ETTWIG等在同時存在甲烷和亞硝酸鹽的體系中培養(yǎng)M.oxyfera，監(jiān)測到了甲烷的氧化和氮氣的生成[40]?；蚪M及轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)技術(shù)揭示了M. oxyfera具有還原NO－3、NO－2和NO 的基因，能夠使2 分子NO 轉(zhuǎn)化為N2和O2，而不是將NO轉(zhuǎn)化為N2O，但M.oxyfera缺少目前已知的編碼N2O還原酶的基因[40]。HAROON等[30]發(fā)現(xiàn)：在淡水沉積物與厭氧廢水污泥的兩者混合物中，占主導(dǎo)地位的ANME-2d 的基因組信息中包括所有Mcr 亞單位基因（McrABCDG）及F420依賴型Mer 在內(nèi)的完整的反向產(chǎn)甲烷途徑[30]；同位素標記試驗結(jié)果表明，ANME-2d 能夠利用NO－3作為電子受體，獨立完成AMO 過程（圖1），完整的固碳途徑和乙酰輔酶A合成酶也存在于ANME-2d的基因組中，暗示其具有產(chǎn)生乙酸的可能性。

圖1 硝酸鹽或亞硝酸鹽競爭氫氣、氫營養(yǎng)型甲烷生成途徑及反向產(chǎn)甲烷途徑[21,30,38-39]Fig.1 Nitrate and nitritecompetition for hydrogen,hydrogenotrophic methanogenesis and reverse methanogenesis processes[21,30,38-39]

1.3 金屬依賴型甲烷厭氧氧化（M-DAMO）

除S-DAMO 和N-DAMO 外，研究者發(fā)現(xiàn)，在湖泊[41]、湖水[42]及海岸[18]等生境中，AMO 還與金屬離子還原耦合，尤其是與Fe3＋和Mn4＋的還原反應(yīng)[43]。從熱力學(xué)角度來看，金屬離子比硫酸鹽更適合作為AMO過程中的電子受體（表2）。

ETTWIG 等在連續(xù)通入甲烷、亞硝酸鹽和硝酸鹽的河流沉積物中，富集到了一種與硝酸鹽型甲烷厭氧氧化菌（CandidatusMethanoperedens nitroreducens）相關(guān)的古菌群——AAA 簇古菌（ANME-2d），發(fā)現(xiàn)該古菌群能夠直接耦合甲烷的氧化及Fe3＋和Mn4＋的還原[43]。BEAL 等發(fā)現(xiàn)：河流盆地沉淀物中的微生物能夠利用Fe3+和Mn4＋氧化甲烷[14]；通過16S rRNA 和Mcr-A 的多樣性分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)體系中同時存在ANME 及大量的細菌，擬桿菌屬（Bacteriodes）和酸桿菌門（Acidobacteria）等中約40%的細菌能夠還原Mn4＋，表明Mn4＋依賴型AMO不是由ANME 單獨完成的，其中Mn4＋還原菌在此過程中發(fā)揮著重要作用；此外，隨培養(yǎng)時間的延長，ANME-2的數(shù)量顯著下降，ANME-3的數(shù)量顯著增加，而ANME-1 的數(shù)量始終保持穩(wěn)定，說明Mn4＋依賴型AMO 主要由ANME-1 和ANME-3 及某些Mn4＋還原菌共同完成。SCHELLER 等將檸檬酸鐵添加至包含ANME-2a和ANME-2c的培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)在Fe3＋作為唯一電子受體時能夠監(jiān)測到AMO[44]。CAI 等利用同位素標記，發(fā)現(xiàn)淡水沉積物中存在由ANME 獨立介導(dǎo)完成的Fe3＋依賴型AMO，且該培養(yǎng)體系中ANME 的基因組信息表明其具有編碼反向產(chǎn)甲烷途徑的所有基因[45]；因此，在基因?qū)用?，ANME 能夠利用反向產(chǎn)甲烷途徑完成AMO。SOO 等將ANME-1 編碼Mcr的基因克隆到醋酸甲烷八疊球菌（Methanosarcina acetivorans）中，在甲烷作為碳源與Fe3＋作為電子供體的條件下，結(jié)合同位素示蹤試驗，發(fā)現(xiàn)甲烷的消耗伴隨著乙酸鹽的增加，推測醋酸甲烷八疊球菌能夠逆轉(zhuǎn)乙酸營養(yǎng)型甲烷生成途徑以完成AMO[46]。

2 瘤胃中硝酸鹽和硫酸鹽還原反應(yīng)

在反芻動物瘤胃中，產(chǎn)甲烷菌能夠利用氫氣與發(fā)酵產(chǎn)物作為底物生成甲烷，這在一定程度上穩(wěn)定了瘤胃內(nèi)的氫分壓，也為瘤胃內(nèi)微生物的生存提供了保障。通過二氧化碳-氫氣反應(yīng)生成的甲烷占瘤胃甲烷生成量的82%[47]。硫酸鹽和硝酸鹽等能夠與二氧化碳競爭氫氣，從而降低甲烷的產(chǎn)量。從熱動力學(xué)角度（表2）來看，由硝酸鹽還原菌和硫酸鹽還原菌介導(dǎo)的還原反應(yīng)比氫營養(yǎng)型甲烷生成反應(yīng)更有優(yōu)勢[48]，因此，在飼料中添加硝酸鹽和硫酸鹽是反芻動物甲烷減排的研究熱點。

表2 利用不同電子受體進行的還原或氧化反應(yīng)的吉布斯自由能[11,14,48,50]Table 2 Gibbs free energy for reduction or oxidation reactions using different electron receptors[11,14,48,50]

硫酸鹽作為最終電子受體被還原成H2S，這一過程在熱動力學(xué)上略次于硝酸鹽還原反應(yīng)[48]。VAN ZIJDERVELD 等發(fā)現(xiàn)：補飼2.6%的硫酸鹽能降低綿羊16%甲烷產(chǎn)量；2.6%硝酸鹽與2.6%硫酸鹽聯(lián)用時，甲烷產(chǎn)量降低程度可高達47%；但單獨添加硫酸鹽的降甲烷效果不如單獨添加硝酸鹽[10]。許多關(guān)于硝酸鹽和硫酸鹽的研究均獲得了較為理想的降低甲烷產(chǎn)量的效果（表3）。

3 自然環(huán)境和瘤胃中硝酸鹽和硫酸鹽還原反應(yīng)降低甲烷產(chǎn)量的差異

目前，從瘤胃中分離出來的產(chǎn)甲烷菌主要有產(chǎn)甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、產(chǎn)甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、產(chǎn)甲烷微菌屬（Methanomicrobium）和產(chǎn)甲烷八疊球菌屬（Methanosarcine）[53-54]，其中大部分都通過還原二氧化碳來產(chǎn)生甲烷。甲烷的形成伴隨著細胞膜內(nèi)外Na＋和H＋化學(xué)梯度的形成，兩者分別由Na＋泵-甲基輔酶M轉(zhuǎn)移酶（methyl-H4MPT: CoM methyltransferase,Mtr）和細胞膜上的氫化酶來實現(xiàn)。Na＋和H＋梯度驅(qū)動位于膜上的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）合酶，通過產(chǎn)生ATP 來實現(xiàn)能量轉(zhuǎn)換[55]。反向產(chǎn)甲烷途徑逆轉(zhuǎn)了甲烷生成的過程，在Mcr等一系列關(guān)鍵酶的催化下將甲烷氧化為二氧化碳[30]。HAROON 等通過ANME-2d 的基因組信息發(fā)現(xiàn)，ANME-2d 利用反向產(chǎn)甲烷途徑氧化甲烷過程中的能量轉(zhuǎn)換與甲烷生成過程類似，同樣是通過跨膜化學(xué)濃度梯度驅(qū)動膜上的ATP合成酶，最終產(chǎn)生ATP[30]。而ETTWIG等的研究表明，M.oxyfera在還原N時產(chǎn)生O2，進而用于甲烷氧化并獲取能量[40]。WU 等進一步細化了M.oxyfera的中心分解代謝和能量代謝通路，發(fā)現(xiàn)甲烷在顆粒性甲烷單加氧酶（particulate methane mono-oxygenase, PMMO）的催化下轉(zhuǎn)化為甲醇，再經(jīng)甲醇脫氫酶（methanoldehydrogenase,Mdh）、亞甲基-四氫甲基蝶呤脫氫酶（methylene-H4MPT dehydrogenase, MtdB）或亞甲基-四氫葉酸脫氫酶（methylene-H4F dehydrogenase,FolD）一系列酶的作用形成甲酸，再由甲基脫氫酶（formate dehydrogenase,Fdh）催化甲酸轉(zhuǎn)化為二氧化碳[61]。N經(jīng)一系列酶催化后，最終轉(zhuǎn)化為N2和O2，其中3/4 的O2被用于甲烷的氧化，1/4 的O2被用于產(chǎn)能代謝等其他生化過程[61-62]。M. oxyfera作為呼吸型微生物，其通過化學(xué)滲透機制保存來自NDAMO產(chǎn)生的能量，以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）脫氫酶耦合還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）的氧化和醌的還原，通過質(zhì)子的泵出實現(xiàn)跨膜H＋梯度進而合成ATP；細胞色素bc1復(fù)合體對還原性醌進行氧化，可再次實現(xiàn)H＋的跨膜轉(zhuǎn)移，而細胞色素c作為電子供體將電子傳遞給cd1型亞硝酸還原酶，進行實現(xiàn)N的還原[61-62]。

表3 添加硝酸鹽或硫酸鹽降低瘤胃甲烷產(chǎn)量的研究Table 3 Studies of reducing methane production in rumen by adding nitrate or sulfate

4 小結(jié)

硝酸鹽或硫酸鹽等可替代電子受體來降低瘤胃甲烷產(chǎn)量的原因是多樣的，如硝酸鹽既可通過競爭氫氣實現(xiàn)瘤胃甲烷產(chǎn)量的降低，也可通過對瘤胃產(chǎn)甲烷菌的毒性作用抑制甲烷生成。AMO 作為環(huán)境中減少甲烷排放的重要途徑之一，其與硝酸鹽或硫酸鹽影響瘤胃甲烷產(chǎn)量是否存在一定聯(lián)系尚未可知，但N-DAMO 微生物在瘤胃中的發(fā)現(xiàn)說明AMO 可能在瘤胃中發(fā)生。同位素示蹤技術(shù)與體外試驗相結(jié)合，可以直觀地監(jiān)測瘤胃微生物是否將甲烷氧化為二氧化碳；而添加硝酸鹽等使瘤胃中AMO 微生物數(shù)量增加，能夠再度監(jiān)測甲烷的轉(zhuǎn)化過程；另外，宏基因組技術(shù)與其他組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，可以深度分析何種瘤胃微生物通過何種途徑實現(xiàn)了甲烷氧化為二氧化碳的過程，這也是打破硝酸鹽降低瘤胃甲烷生成量傳統(tǒng)認知的關(guān)鍵。這些研究將為開發(fā)瘤胃甲烷減排措施提供更廣闊的思路，對提高飼料利用效率和減緩甲烷對溫室效應(yīng)的影響具有重要意義。

表4 硝酸鹽和硫酸鹽在自然環(huán)境和瘤胃中對甲烷產(chǎn)量影響的差異[10-11,48,50]Table 4 Differences in the effects of nitrate and sulfate on methane production in natural habitats and rumen[10-11,48,50]