徐萍 盧延虹 時(shí)志鵬
肺結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病,可涉及諸多臟器而以肺部結(jié)核感染最為常見[1]。但是,人體感染結(jié)核菌后不一定發(fā)病,僅當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或細(xì)胞介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)增高時(shí),才能引起臨床發(fā)病,影響病人的健康和生活[2]。細(xì)胞程序性死亡因子1(PD-1)、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(TIM-3)是T細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白;而高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種高度保守的核蛋白,能直接參與機(jī)體多種病理、生理過程[3]。臨床研究表明,HMGB1能活化巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子,引起機(jī)體炎癥反應(yīng),亦與機(jī)體免疫存在緊密的聯(lián)系[4]。PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態(tài)性在老年肺結(jié)核中表達(dá)異常,能直接參與疾病的發(fā)生、發(fā)展,但是與病人肺功能的關(guān)系研究相對(duì)較少[5-6]。因此,本研究旨在探討PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態(tài)性在老年肺結(jié)核病人中的表達(dá)及與肺功能的關(guān)系,報(bào)道如下。
1.1 臨床資料 選擇我院2016年6月至2019年6月老年肺結(jié)核病人86例為觀察組,男47例,女39例,年齡61~94歲,平均(79.22±6.45)歲;病程1~7個(gè)月,平均(3.26±0.59)個(gè)月。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均符合中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];(2)均能完成外周血采集、肺功能測(cè)定;(3)意識(shí)尚清楚,能與醫(yī)生進(jìn)行溝通、交流。選擇同期健康體檢者59例設(shè)為對(duì)照組,男32例,女27例,年齡60~90歲,平均(77.31±5.44)歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并肺外結(jié)核病、肺炎、塵肺及肺部實(shí)體瘤者。COPD等影響肺功能的疾??;(2)合并艾滋病、肝炎病毒感染或長(zhǎng)期使用激素治療者。
1.2 儀器與設(shè)備 抗人TIM-3-FITC、抗人PD-1試劑盒(上海西塘生物科技有限公司)、PBS溶液(美國Hyclone公司)、DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)、DNA定量檢測(cè)試劑盒(美國Invitrogen公司)、AMpure磁珠(美國Beckman公司)。
1.3 方法 觀察組入院后空腹?fàn)顟B(tài)下取外周血5 mL,對(duì)照組健康體檢當(dāng)天取外周血5 mL,離心后放置在-80 ℃冰箱中,備用。
1.3.1 PD-1、TIM-3表達(dá)檢測(cè):采用流式細(xì)胞儀測(cè)定2組外周血自然殺傷(NK)細(xì)胞表面PD-1、TIM-3表達(dá)水平。取上述分離的血清標(biāo)本,在流式管中分別加入人流式抗體PD-1、TIM-3及單標(biāo)和同型對(duì)照標(biāo)記,向每個(gè)流式管中加入全血50μL,充分混合后完成15 min孵育。向混合溶液中加入溶血素1 mL避光下完成10 min孵育,5 min離心,速度1000 r/min,采用PBS完成2次清洗,并將其放置在濃度4%多聚甲醛溶液500μL中固定、檢測(cè)。
1.3.2 HMGB1基因多態(tài)性測(cè)定[8-9]:采用高通量測(cè)序法完成HMGB1基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)檢測(cè),分析2組SNP基因型、等位基因頻率存在的差異。(1)SNPs的挑?。翰殚喩镄畔?shù)據(jù)庫,結(jié)合既往研究報(bào)道確定HMGB1基因rs1045411、rs2249825、rs1412125 3個(gè)SNPs;(2)基因序列的確定:參考Genebank獲得HMGB1基因多態(tài)性引物序列,見表1;(3)DNA擴(kuò)增反應(yīng)條件:設(shè)置PCR參數(shù)為30 ℃ 10 min,42 ℃ 30 min,99 ℃ 5 min,5 ℃下5 min,連續(xù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán),72 ℃10 min延長(zhǎng),獲得最終產(chǎn)物并放入1.5%瓊脂凝膠電泳,β-actin為內(nèi)對(duì)照;(4)測(cè)序:配置濃度為2%瓊脂糖凝膠,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與凝膠充分混合、電泳,給予溴乙錠染色并完成電泳,拍照[10]。
1.3.3 肺功能水平測(cè)定:采用肺功能測(cè)定儀檢測(cè)2組FVC、FEV1及FEV1/FVC[11]。
表1 HMGB1基因多態(tài)性引物設(shè)計(jì)
2.1 2組PD-1、TIM-3水平比較 觀察組PD-1、TIM-3水平均明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。
表2 2組PD-1、TIM-3水平比較
2.2 2組HMGB1基因SNP比較 2組rs1045411基因型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);觀察組rs2249825、rs1412125基因型頻率均高于對(duì)照組(P<0.05);觀察組rs2249825、rs1412125基因型中CC基因頻率高于對(duì)照組(P<0.05),見表3。
表3 2組HMGB1基因多態(tài)性比較
2.3 2組肺功能水平比較 觀察組FEV1、FVC及FEV1/FVC水平均低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。
表4 2組肺功能比較
2.4 PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態(tài)性與肺功能的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析表明,肺功能與HMGB1基因多態(tài)性中的rs1045411無相關(guān)性(P>0.05),與PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態(tài)性rs2249825、rs1412125呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05),見表5。
表5 PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態(tài)性與肺功能相關(guān)性(r)
肺結(jié)核是臨床上常見的傳染性疾病,且全球約有1/3人口感染過結(jié)核分枝桿菌,但是僅有1/10感染者會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為肺結(jié)核。由此看出:肺結(jié)核的發(fā)生存在個(gè)體差異性,可能與肺結(jié)核的易感基因有關(guān)[12]。國外學(xué)者研究表明,結(jié)核病易感基因類型較多,常見的包括:維生素D受體、IL與Toll樣受體基因等[13]。臨床研究表明,肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素參與過程,常伴有炎癥因子的共同參與,而T細(xì)胞則能參與疾病的發(fā)展。PD-1、TIM-3是目前臨床上研究較多的負(fù)性協(xié)同刺激因子。PD-1最早于1992年首次被發(fā)現(xiàn),該基因主要定位于2號(hào)染色體上,其表達(dá)多與肺結(jié)核、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等有關(guān);而TIM-3表達(dá)多與乙型肝炎、肝硬化及肝癌等有關(guān),能直接參與機(jī)體炎癥反應(yīng)。本研究中,觀察組PD-1、TIM-3水平高于對(duì)照組(P<0.05),說明PD-1、TIM-3在肺結(jié)核病人中呈高表達(dá)狀態(tài),其水平能輔助臨床診療。
HMGB1是一種高度保守的核蛋白,能直接參與機(jī)體多種病理、生理過程。有研究表明,HMGB1能激活機(jī)體內(nèi)的巨噬細(xì)胞,釋放大量炎癥因子,從而能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng),其表達(dá)水平亦與機(jī)體免疫有關(guān)[14]。相關(guān)研究顯示,HMGB1基因多態(tài)性與肺癌、代謝綜合征及高血壓的發(fā)生有關(guān),但是臨床上對(duì)于HMGB1基因多態(tài)性與肺結(jié)核的關(guān)系研究較少。本研究中,觀察組病人rs2249825、rs1412125基因型頻率均高于對(duì)照組(P<0.05);觀察組rs2249825、rs1412125基因型中CC基因頻率均高于對(duì)照組(P<0.05);觀察組FEV1、FVC及FEV1/FVC水平均低于對(duì)照組(P<0.05),說明老年肺結(jié)核病人與HMGB1基因多態(tài)性有關(guān),而CC單體型則為病人易感基因。臨床研究表明,HMGB1基因CC單體型病人的HMGB1蛋白表達(dá)水平增加,從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞因子的大量釋放,能促進(jìn)老年肺結(jié)核的發(fā)生,加劇肺功能異常[15]。為了進(jìn)一步分析PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態(tài)性與肺功能的關(guān)系,本研究對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果表明:老年肺結(jié)核病人肺功能與PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態(tài)性rs2249825、rs1412125呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05),說明老年肺結(jié)核病人肺功能受到的影響因素較多,加強(qiáng)病人PD-1、TIM-3、HMGB1基因多態(tài)性測(cè)定能反映病情嚴(yán)重程度,利于臨床診療。但是,本研究中亦存在諸多不足,一方面納入病例數(shù)較少;另一方面對(duì)病人數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)存在無創(chuàng),均需要進(jìn)一步研究與探討。
綜上所述,PD-1、TIM-3在老年肺結(jié)核病人中高表達(dá),而HMGB1基因CC單體型是肺結(jié)核的易感型,與肺功能水平存在相關(guān)性,能為肺結(jié)核診療提供依據(jù)和參考。